Versuch 9 - LDH

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Proteinchemisches Praktikum SS 2012 Sabine Bauer, Carolin Absmeier Aus v max konnte dann die spezifische Umsatzgeschwindigkeit v um berechnet werden. Hierfür wurden folgende Formeln benötigt: LDH LDH (wobei v hier das eingesetzte Volumen an LDH (50 µl)bezeichnet und c LDH die Konzentration von 3,3 µg/ml beschreibt) Eingesetzt ergibt sich somit für die spezifische Umsatzgeschwindigkeit: um Um die Abweichung der ermittelten Werte zu bestimmen wurde folgende Formel benötigt: 9
Proteinchemisches Praktikum SS 2012 Sabine Bauer, Carolin Absmeier 4. Diskussion 4.1 Bestimmung der Pyruvatkonzentration Bei diesem Versuchsteil wurde aus drei Ansätzen die Konzentration einer unbekannten Pyruvatlösung ermittelt. Die drei Ansätze wurden mit jeweils verschiedenen Pyruvatmengen angesetzt. Es wurden deshalb drei Ansätze verwendet, um anschließend durch die Mittelwertberechnung einen möglichst exakten Wert zu erhalten. Je mehr Messungen vorgenommen werden, desto weniger fällt ein falscher Messwert ins Gewicht und führt so zu einem verfälschten Ergebnis. Pyruvat ist bei dieser Enzymreaktion ein limitierender Faktor, daher bekamen wir mit steigender Pyruvatmenge auch einen steigenden Extinktionswert. Nach dem Zurückrechnen auf die Ausgangskonentration sollten sich so drei sich stark ähnelnde Werte ergeben. Durch die mehrfache Messung des Endwerts konnten wir sicher gehen, den exakten Maximalwert zu erhalten und so ein falsches Ergebnis vermeiden. Die leichten Schwankungen, die sich bei den errechneten Pyruvatkonzentrationen ergaben können zum einen darauf zurückgeführt werden, dass wir nach Zugabe des Enzyms die drei Küvetten nicht in der gleichen Zeitspanne ins Photometer geben konnten. Die Schwankungen, die sich bei unseren Messwerten ergaben können darauf zurückgeführt werden, dass es sich bei biochemischen Reaktionen meist um Gleichgewichtsreaktionen handelt und so bei keinem der Ansätze das Pyruvat in seiner ganzen Menge verbraucht wurde. Zudem sei zu beachten, dass Enzyme sehr Empfindliche Proteine gegenüber Umgebungsveränderungen sind. Hierzu zählen zum einen Änderungen im pH-Wert, bei der Temperatur oder auch von Scherkräften. Liegt zum Beispiel der pH Wert für unsere Reaktion nicht bei exakt 7,5 kann dies die Arbeit des Enzyms LDH beeinträchtigen. Durch die Berechnung des Mittelwerts konnte ein falscher Wert weniger aussagekräftig gemacht werden und wir erreichten trotz der Schwankungen ein gutes Mittel für die gesuchte Pyruvatkonzentration 4.2 Bestimmung der Michaeliskonstante von LDH Hier wurden aus zehn Lösungsansätzen mit Hilfe eines LIneweaver-Burk Diagramms Km und v max bestimmt. Hierfür wurde wie bei Punkt 3.2 beschrieben die Steigung des linearen Bereichs bestimmt. Da sich in unserer zweiten Messreihe ein Starker Knick im Bereich der ersten drei Punkte befindet, wurde dieser Wert ignoriert, weil wir davon ausgehen mussten eine falsche Steigung, auf Grund der zu niedrigen Werte für die Anfangsextinktion und den Folgewert, zu errechnen. Dies stellte jedoch kein Problem dar, da immer noch 9 Werte übrig blieben, durch die eine Regressionsgerade gezogen werden konnte. Sowohl beim Michaelis-Menten Diagramm, als auch nach der doppelt reziproken Auftragung im Lineweaver-Burk Diagramm fällt auf, dass die Werte doch erheblich schwanken. Dies rührt zum einen daher, dass nach der Enzymzugabe die Küvetten nicht in der gleichen Zeitspanne ins Photometer gestellt worden sind. Um dies zu erreichen hätte man die genaue Zeit zwischen der Enzymzugabe und der Messung des ersten Extinktionswertes bestimmen müssen um dann alle Küvetten zum gleichen Reaktionszeitpunkt ins Photometer geben zu können. Der Durchmischprozess verstärkt die Reaktion des Enzyms. Da dies nicht möglich war wurden die Küvetten eventuell zu unterschiedlichen Reaktionszeitpunkten ins Photometer gestellt und wir erhielten so etwas verschobene Werte. Da die Mischzeit und Stärke wahrscheinlich nicht bei allen 10 Küvetten gleich war ergeben sich hier leichte Schwankungen in den Werten. diese Abweichungen können sich auch auf die später berechnete Anfangsgeschwindigkeit v auswirken und sich auch in v max bemerkbar machen. Zum anderen können wie auch bei 4.1 bereits erwähnt Umgebungsänderungen die Enzymarbeit der empfindlichen Biokatalysatoren erheblich beeinträchtigen. Da die Eppendorfgefäße von 3 Gruppen für alle Versuche verwendet wurden, ist es leicht möglich, dass sich starke Temperaturschwankungen (Raumtemperatur, Körpertemperatur durch halten…), oder auch Scherkräfte durch das Pipettieren ergaben, welche zu einer teilweisen Denaturierung und damit zu einer Beeinträchtigung der Funktion der LDH führten. Ein weiterer, jedoch wahrscheinlich weniger relevanter Punkt könnten die verschiedenen Arten der verwendeten Küvetten darstellen. DA es sich nicht immer um einen Typ von 10
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