Versuch 9 - LDH
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Proteinchemisches Praktikum SS 2012 Sabine Bauer, Carolin Absmeier<br />
4. Diskussion<br />
4.1 Bestimmung der Pyruvatkonzentration<br />
Bei diesem <strong>Versuch</strong>steil wurde aus drei Ansätzen die Konzentration einer unbekannten Pyruvatlösung ermittelt.<br />
Die drei Ansätze wurden mit jeweils verschiedenen Pyruvatmengen angesetzt. Es wurden deshalb<br />
drei Ansätze verwendet, um anschließend durch die Mittelwertberechnung einen möglichst exakten Wert<br />
zu erhalten. Je mehr Messungen vorgenommen werden, desto weniger fällt ein falscher Messwert ins Gewicht<br />
und führt so zu einem verfälschten Ergebnis. Pyruvat ist bei dieser Enzymreaktion ein limitierender<br />
Faktor, daher bekamen wir mit steigender Pyruvatmenge auch einen steigenden Extinktionswert. Nach<br />
dem Zurückrechnen auf die Ausgangskonentration sollten sich so drei sich stark ähnelnde Werte ergeben.<br />
Durch die mehrfache Messung des Endwerts konnten wir sicher gehen, den exakten Maximalwert zu erhalten<br />
und so ein falsches Ergebnis vermeiden. Die leichten Schwankungen, die sich bei den errechneten<br />
Pyruvatkonzentrationen ergaben können zum einen darauf zurückgeführt werden, dass wir nach Zugabe<br />
des Enzyms die drei Küvetten nicht in der gleichen Zeitspanne ins Photometer geben konnten. Die Schwankungen,<br />
die sich bei unseren Messwerten ergaben können darauf zurückgeführt werden, dass es sich bei<br />
biochemischen Reaktionen meist um Gleichgewichtsreaktionen handelt und so bei keinem der Ansätze das<br />
Pyruvat in seiner ganzen Menge verbraucht wurde. Zudem sei zu beachten, dass Enzyme sehr Empfindliche<br />
Proteine gegenüber Umgebungsveränderungen sind. Hierzu zählen zum einen Änderungen im pH-Wert, bei<br />
der Temperatur oder auch von Scherkräften. Liegt zum Beispiel der pH Wert für unsere Reaktion nicht bei<br />
exakt 7,5 kann dies die Arbeit des Enzyms <strong>LDH</strong> beeinträchtigen.<br />
Durch die Berechnung des Mittelwerts konnte ein falscher Wert weniger aussagekräftig gemacht werden<br />
und wir erreichten trotz der Schwankungen ein gutes Mittel für die gesuchte Pyruvatkonzentration<br />
4.2 Bestimmung der Michaeliskonstante von <strong>LDH</strong><br />
Hier wurden aus zehn Lösungsansätzen mit Hilfe eines LIneweaver-Burk Diagramms Km und v max bestimmt.<br />
Hierfür wurde wie bei Punkt 3.2 beschrieben die Steigung des linearen Bereichs bestimmt. Da sich in unserer<br />
zweiten Messreihe ein Starker Knick im Bereich der ersten drei Punkte befindet, wurde dieser Wert<br />
ignoriert, weil wir davon ausgehen mussten eine falsche Steigung, auf Grund der zu niedrigen Werte für die<br />
Anfangsextinktion und den Folgewert, zu errechnen. Dies stellte jedoch kein Problem dar, da immer noch 9<br />
Werte übrig blieben, durch die eine Regressionsgerade gezogen werden konnte.<br />
Sowohl beim Michaelis-Menten Diagramm, als auch nach der doppelt reziproken Auftragung im<br />
Lineweaver-Burk Diagramm fällt auf, dass die Werte doch erheblich schwanken. Dies rührt zum einen daher,<br />
dass nach der Enzymzugabe die Küvetten nicht in der gleichen Zeitspanne ins Photometer gestellt<br />
worden sind. Um dies zu erreichen hätte man die genaue Zeit zwischen der Enzymzugabe und der Messung<br />
des ersten Extinktionswertes bestimmen müssen um dann alle Küvetten zum gleichen Reaktionszeitpunkt<br />
ins Photometer geben zu können. Der Durchmischprozess verstärkt die Reaktion des Enzyms.<br />
Da dies nicht möglich war wurden die Küvetten eventuell zu unterschiedlichen Reaktionszeitpunkten ins<br />
Photometer gestellt und wir erhielten so etwas verschobene Werte. Da die Mischzeit und Stärke wahrscheinlich<br />
nicht bei allen 10 Küvetten gleich war ergeben sich hier leichte Schwankungen in den Werten.<br />
diese Abweichungen können sich auch auf die später berechnete Anfangsgeschwindigkeit v auswirken und<br />
sich auch in v max bemerkbar machen. Zum anderen können wie auch bei 4.1 bereits erwähnt Umgebungsänderungen<br />
die Enzymarbeit der empfindlichen Biokatalysatoren erheblich beeinträchtigen. Da die<br />
Eppendorfgefäße von 3 Gruppen für alle <strong>Versuch</strong>e verwendet wurden, ist es leicht möglich, dass sich starke<br />
Temperaturschwankungen (Raumtemperatur, Körpertemperatur durch halten…), oder auch Scherkräfte<br />
durch das Pipettieren ergaben, welche zu einer teilweisen Denaturierung und damit zu einer Beeinträchtigung<br />
der Funktion der <strong>LDH</strong> führten. Ein weiterer, jedoch wahrscheinlich weniger relevanter Punkt könnten<br />
die verschiedenen Arten der verwendeten Küvetten darstellen. DA es sich nicht immer um einen Typ von<br />
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