Tierärztliche Hochschule Hannover Einfluss unterschiedlicher ...

Tierärztliche Hochschule Hannover
Einfluss unterschiedlicher
Progesteronkonzentrationen auf
die Maturation boviner Oozyten
in vivo und in vitro
INAUGURAL - DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer Doktorin
der Veterinärmedizin
- Doctor medicinae veterinariae -
( Dr. med. vet. )
vorgelegt von
Nicole Schlüter
Münster
Hannover 2013

Wissenschaftliche Betreuung:
Prof. Dr. Christine Wrenzycki
Klinik für Rinder,
Reproduktionsmedizinische Einheit der Kliniken
jetzt: Justus-Liebig-Universität Gießen
Klinik für Geburtshilfe, Gynäkologie und Andrologie
der Groß- und Kleintiere mit Tierärztlicher Ambulanz,
Professur für Molekulare Reproduktionsmedizin
1. Gutachterin Prof. Dr. Christine Wrenzycki
2. Gutachter Prof. Dr. Burkhard Meinecke
Tag der mündlichen Prüfung: 30.09.2013
Die vorliegende Arbeit wurde gefördert durch den Förderverein Biotechnologie Forschung e.V.
(FBF e.V.) Bonn.

Meinen Großvätern

Inhalt
1 Einleitung 1
2 Literatur 5
2.1 Gewinnung von Kumulus-Oozyten-Komplexen (KOK) mit der Ovum-Pick-Up
(OPU)-Methode . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5
2.1.1 Die Entwicklung des OPU . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5
2.1.2 Vergleich des OPU mit anderen Methoden zur Gewinnung von Eizellen
bzw. Embryonen beim Rind . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6
2.2 Einfluss des OPU auf die Gesundheit des Donortieres . . . . . . . . . . . . . . 7
2.3 Einfluss des OPU auf den ovariellen Zyklus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
2.4 Einflüsse des Zyklusstandes auf die Ergebnisse des OPU . . . . . . . . . . . . 8
2.5 Einfluss des Zyklusstandes auf die Qualität der KOK . . . . . . . . . . . . . . 9
2.6 Beurteilung der Entwicklungskompetenz boviner Oozyten . . . . . . . . . . . 10
2.7 Einfluss des Zyklusstandes auf die Entwicklungskompetenz boviner KOK . . . 12
2.8 Beeinflussung der follikulären Reifungsvorgänge durch peripheres Progesteron 14
2.9 In-vitro-Maturation (IVM) boviner Oozyten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
2.10 Beeinflussung der Eizell- und Embryonenqualität . . . . . . . . . . . . . . . . 16
2.11 Einfluss der Maturationsbedingungen auf die Eizell- und Embryonenqualität . . 17
2.12 Einfluss der Steroidsupplementation während der IVM . . . . . . . . . . . . . 19
2.13 MessengerRNA-Expression entwicklungsrelevanter Gene in bovinen Oozyten
und Embryonen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
2.13.1 Growth and Differentiation Factor 9 (GDF9) . . . . . . . . . . . . . . 22
2.13.2 Bone Morphogenetic Protein 15 (BMP15) . . . . . . . . . . . . . . . . 23
2.13.3 Glukosetransporter 1 (SLC2A1) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
2.13.4 Hypoxia Inducible Factor 2α (HIF2α) . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
2.14 MessengerRNA-Expression von Progesteronstoffwechsel-relevanten Genen in
Oozyten und Embryonen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
2.14.1 Progesteronrezeptoren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
2.14.2 Progestin und AdipoQ Rezeptor 5 (PAQR5) . . . . . . . . . . . . . . . 27
2.15 Ziel des Projektes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
3 Material und Methoden 29
3.1 Ovum Pick-Up (OPU) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
3.1.1 Auswahl der Versuchstiere und Feststellung des Versuchsbeginns . . . 29
3.1.2 Gewinnung von Kumulus-Oozyten-Komplexen im OPU-Verfahren . . . 30
3.1.3 Blutentnahme und Konservierung der Blutproben . . . . . . . . . . . . 33
3.1.4 Bestimmung der Progesteronkonzentration im Blut . . . . . . . . . . . 34
3.2 In-vitro-Produktion boviner Embryonen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
V

Inhalt
3.2.1 Herkunft der Ovarien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
3.2.2 Vorbereitung und Selektion der Kumulus-Oozyten-Komplexe . . . . . 35
3.2.3 In-vitro-Maturation (IVM) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
3.2.4 Progesteronbestimmung im Reifungsmedium und Einteilung der Versuchsgruppen
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
3.2.5 Reifungskontrolle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38
3.2.6 In-vitro-Fertilisation (IVF) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38
3.2.7 In-vitro-Kultur (IVC) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39
3.2.8 Beurteilung der Embryonen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39
3.2.9 Archivierung von gereiften Oozyten für die mRNA-Analyse . . . . . . 39
3.3 mRNA-Analyse der Oozyten zur Darstellung qualitätsanzeigender Gentranskripte 40
3.3.1 Aufbereitung der Proben zur Isolierung der mRNA . . . . . . . . . . . 40
3.3.2 Reverse Transkription (RT) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40
3.3.3 Quantitative Polymerase Kettenreaktion (qPCR) . . . . . . . . . . . . 41
3.4 Auswertung der Daten und statistische Analyse . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
4 Ergebnisse 45
4.1 OPU . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
4.1.1 Zyklusverhalten und Gelbkörpereigenschaften . . . . . . . . . . . . . 47
4.1.2 Follikelpunktion, Eizellausbeute und Oozytenqualität . . . . . . . . . . 48
4.2 Progesteronsupplementation während der In-vitro-Maturation . . . . . . . . . . 50
4.2.1 Progesteronanalyse im Medium . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50
4.2.2 In-vitro-Produktion nach Progesteronzusatz im Reifungsmedium . . . . 51
4.3 mRNA-Expression verschiedener Gene . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53
4.3.1 mRNA-Expression in OPU-KOK verschiedener Zyklusphasen . . . . . 53
4.3.2 mRNA-Expression in gereiften Oozyten nach IVM mit P4-Zusatz . . . 54
5 Diskussion 57
5.1 Zyklusverhalten während der OPU-Versuchsphase . . . . . . . . . . . . . . . . 57
5.1.1 Zwischenbrunsten und Bildung gelbkörperähnlicher Strukturen . . . . 57
5.1.2 Eigenschaften der gelbkörperähnlichen Gebilde . . . . . . . . . . . . . 59
5.2 Follikeleigenschaften, Eizellausbeute und Oozytenqualität . . . . . . . . . . . 61
5.3 MessengerRNA-Häufigkeiten in den OPU-Oozyten . . . . . . . . . . . . . . . 62
5.4 Progesteronsupplementation während der Eizellreifung . . . . . . . . . . . . . 64
5.4.1 Einfluss der Progesteronsupplementation auf die Genexpression . . . . 65
5.5 Einfluss des Progesterons auf die Eizellqualität in vivo und in vitro . . . . . . . 67
5.6 Schlussfolgerungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67
5.7 Kritische Würdigung der Arbeit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67
6 Zusammenfassung 69
VI

7 Summary 71
A Medien und Chemikalien 73
A.1 Medien für das OPU . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73
A.2 Medien für die IVP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73
A.3 Medien für die Reifungskontrolle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77
A.4 Medien für den Radioimmunoassay . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78
A.5 Medien für die RT-qPCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78
B Verzeichnis der Gesamtdaten 81
B.1 Daten aus dem OPU-Versuch . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81
B.1.1 Näherungsfunktionen und Berechnungen für den Verlauf des Serumprogesteronwertes
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 97
B.1.2 Progesteronverläufe der Einzeltiere . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 97
B.1.3 Berechnungen aus den Funktionen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 99
B.2 Daten aus dem IVM-Versuch . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100
B.2.1 IVP-Durchgänge der Versuchsgruppen . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100
B.2.2 P4 im IVM-Medium . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 105
B.2.3 Reifungskontrollen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 107
B.3 Daten aus der RT-qPCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 109
B.3.1 OPU-Oozyten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 109
B.3.2 IVM-Versuch . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 110
Abbildungen 113
Tabellen 115
Literaturverzeichnis 119
Abkürzungsverzeichnis 159
VII

text

1 Einleitung
Die erfolgreiche Weiterentwicklung der In-vitro-Produktion (IVP) von Rinderembryonen, bestehend
aus den drei methodischen Schritten der In-vitro-Maturation (IVM), In-vitro-Fertilisation
(IVF) und In-vitro-Kultur (IVC) hat in den letzten Jahren Embryonen in großer Zahl verfügbar
gemacht. Bei Verwendung von Kumulus-Oozyten-Komplexen (KOK) aus Schlachthofovarien
liegen die Effizienzen für die einzelnen Schritte bei 60-95 % für die IVM (ADONA
et al. 2008), 70-90 % für die IVF (WRENZYCKI et al. 2007) und 25-40 % für die IVC (KES-
KINTEPE und BRACKETT 1996, RIZOS et al. 2003). In Kombination mit der Ovum-Pick-Up
(OPU)-Technologie zur Gewinnung von Eizellen von lebenden Tieren liegen die Entwicklungsraten
zu einem transfertauglichen Embryo an Tag 7 ebenfalls bei 25-40 %. Somit steht
mit der kombinierten OPU-/IVP-Technologie ein alternatives Verfahren zu den klassischen
MOET-Programmen (Multiple Ovulation and Embryo Transfer, Superovulation mit anschließendem
Embryotransfer) zur Verfügung (PIETERSE et al. 1991b). Nach dem Transfer von IVP-
Embryonen auf Empfängertiere werden bei frisch transferierten Embryonen Trächtigkeitsraten
von ca. 50 % (WRENZYCKI 2007) erziehlt, beim Transfer tiefgefrorener Embryonen durchschnittlich
40 % (GALLI et al. 2001, LAZZARI et al. 2002, WRENZYCKI 2007).
Trotz der enormen Verbesserung der IVP-Systeme weisen in vitro produzierte Embryonen
nach wie vor eine schlechtere Qualität auf als in vivo gewonnene (NIEMANN et al. 2002, RI-
ZOS et al. 2002). Während die Qualität der Oozyte sich hauptsächlich auf die Anzahl der sich
entwickelnden Blastozysten auswirkt (RIZOS et al. 2002), beeinflussen die Kulturbedingungen
die Blastozysten hinsichtlich ihrer Genexpressionsmuster (WRENZYCKI et al. 2007, GAD
et al. 2012), ihrer Fähigkeit, eine Trächtigkeit zu induzieren und ihrer Gefriertauglichkeit (LO-
NERGAN et al. 2001, RIZOS et al. 2003).
Die für die IVP verwendeten KOK werden routinemässig aus Schlachthofovarien oder durch
die transvaginale, ultraschallgeleitete Follikelpunktion (OPU) gewonnen und nach morphologischen
Kriterien ausgewählt. Die Entwicklungskompetenz der Oozyten bis zur Blastozyste ist
hierbei durch den Zyklusstand des Tieres, die follikuläre Entwicklungsphase sowie die Follikelgröße
beeinflusst. Im Gegensatz zu fertilen Schlachttieren haben OPU-Spendertiere aufgrund
des ein bzw. zwei Mal wöchentlich durchgeführten OPU keinen physiologischen Zyklus (GIB-
1

1 Einleitung
BONS et al. 1994, BONI et al. 1997, PETYIM et al. 2003). Die Entfernung der antralen Follikel
auf dem Ovar induziert eine neue Follikelwelle, es erfolgt jedoch keine natürliche Ovulation.
Je nach Punktionsintervall unterbleibt auch die Ausbildung eines dominanten Follikels (GIBB-
ONS et al. 1994, GARCIA und SALAHEDDINE 1998, CARLIN et al. 1999, PETYIM et al. 2003,
LOPES et al. 2006). Somit sind auch die mit diesen Prozessen einhergehenden hormonellen
Veränderungen beeinflusst. Aus diesem Grund kann die Situation der Follikel auf den Ovarien
von Tieren, bei denen OPU angewendet wird, nicht mit denen von zyklischen Tieren verglichen
werden. Es konnte bereits ein Zusammenhang zwischen dem Gehalt an Progesteron in
der Follikelflüssigkeit mit sowohl der Morphologie als auch der Entwicklungskompetenz der
aus dem Follikel gewonnenen Eizelle hergestellt werden (HAZELEGER et al. 1995). Um die
OPU-/IVP-Technologie weiter zu verbessern, ist es deshalb notwendig, mehr über die Zusammenhänge
zwischen den hormonellen Veränderungen und der Eizellqualität sowie die Rolle des
hormonellen Umfeldes während der Eizellreifung zu erfahren.
Zur Verbesserung der IVP von Rinderembryonen wurden in den letzten Jahren verschiedenste
Versuche bezüglich der Supplementation der Medien der einzelnen Produktionsschritte durchgeführt.
Steroidhormone als natürliche Sexualhormone, deren Konzentration sich während des
natürlichen Zyklus und damit auch während des Heranreifens von Oozyten in vivo ständig verändert
(SCHAMS und BERISHA 2002), spielten dabei immer wieder eine Rolle (FUKUI et al.
1982, SIROTKIN 1992, RYAN et al. 1999, SILVA und KNIGHT 2000, MINGOTI et al. 2002). Bisher
konnten jedoch keine eindeutigen Ergebnisse bezüglich deren Einfluss gewonnen werden.
Der Wechsel vom dominierenden Estradiol zur Progesterondominanz im Follikel im Zeitraum
zwischen LH-Peak und Ovulation (DIELEMAN et al. 1983) sowie die Expression der Progesteronrezeptoren
in Oozyte und Kumuluszellen (APARICIO et al. 2011) lassen eine Rolle von
Progesteron bei der Eizellreifung vermuten (LONERGAN 2011, FAIR und LONERGAN 2012).
Nach wie vor ist diese Rolle von Progesteron jedoch nicht ausreichend definiert (LONERGAN
2011, FAIR und LONERGAN 2012). Es ist außerdem ungeklärt, ob die Beeinflussung der Oozyte
durch Steroide, insbesondere Progesteron, auf direktem oder indirektem Wege erfolgt.
Die Darstellung der mRNA-Expression bei Rinderembryonen ist in den letzten Jahren ein viel
beachtetes Thema geworden (NIEMANN und WRENZYCKI 2000). Frühe kritische Schritte der
Entwicklung, wie Zeitpunkt der ersten Teilung, Aktivierung des embryonalen Genoms, Kompaktierung
und Blastozystenbildung und -expansion können durch die Kulturmedien und die
In-vitro-Bedingungen sowie durch die Produktionsverfahren selbst in erheblichem Maße beeinflusst
werden. Diese Veränderungen betreffen sowohl eine signifikante Hoch- oder Herrunterregulation
sowie die De novo-Induktion oder Abschaltung von Genen, die für eine ungestörte embryonale,
fetale und neonatale Entwicklung von Bedeutung sind. Es konnte gezeigt werden, daß
sich das höhere Entwicklungspotenzial von in vivo gereiften Eizellen im Gegensatz zu dem in
vitro gereifter Oozyten auch auf molekularer Ebene wiederspiegelt (WRENZYCKI et al. 2007).
Obwohl die Ausgangsqualität die wohl entscheidene Rolle für die Genexpressionsmuster darstellt,
haben Untersuchungen des Einflusses der Follikelumgebung bzw. der IVM-Bedingungen
auf bovine Oozyten und die darauf folgenden embryonalen Entwicklungsstadien bis zur Blastozyste
auf molekularer Ebene bisher erst in den letzten Jahren stattgefunden [eine Übersicht
der Arbeiten findet sich bei FAIR und LONERGAN (2012)].
In dieser Arbeit soll nicht nur der Einfluss der sich ändernden peripheren Progesteronkonzentration
durch ein Corpus luteum während des natürlichen Zyklus auf die reifende Eizelle in vivo
2

untersucht werden, sondern auch die Effekte verschiedener Progesteronkonzentrationen als Zusatz
zum IVM-Medium. Dabei sollen anhand von Genexpressionsmustern die Veränderungen
auf molekularer Ebene Beachtung finden. Der Fokus liegt jedoch nicht nur auf qualitätsanzeigenden
Gentranskripten, sondern auch auf der mRNA-Expression der Progesteronrezeptoren.
3

2 Literatur
2.1 Gewinnung von Kumulus-Oozyten-Komplexen (KOK) mit der
Ovum-Pick-Up (OPU)-Methode
Das OPU ist eine flexibel einsetzbare und wiederholbare Technik, um Eizellen für die In-vitro-
Produktion (IVP) von Embryonen vom lebenden Tier zu gewinnen. Bereits 1991 wurde die Methode
als Alternative zum konventionellen Multiple Ovulation and Embryo Transfer (MOET)
bezeichnet (PIETERSE et al. 1991b).
2.1.1 Die Entwicklung des OPU
Gegen Ende der 1980er Jahre wurde das für den Menschen entwickelte OPU-Verfahren an
das Rind adaptiert (PIETERSE et al. 1988) und die Technik in den darauf folgenden Jahren
kontinuierlich verbessert. Das beinhaltete unter anderem Versuche mit verschiedenen Punktionskanülen.
Die Verwendung zweilumiger Kanülen, bei denen das eine Lumen der Entfernung
des Follikelinhaltes, das andere Lumen zur Zufuhr von Spülflüssigkeit diente, lieferte allerdings
widersprüchliche Ergebnisse (FRY et al. 1994, SASAMOTO et al. 2003). Die Verwendung von
Einmalkanülen, die nach jeder Punktion gewechselt werden, bietet sowohl aus hygienischer als
auch ökonomischer Sicht ein praktikables Handling (BOLS et al. 1995). Auch der Durchmesser
sowie die Länge des Anschliffes sind wichtige Parameter bei der Eizellgewinnung (BOLS et al.
1997, LOPES et al. 2006). Ebenso beeinflusst das Aspirationsvakuum die Ergebnisse des OPU,
insbesondere hinsichtlich der Wiederfindungsraten (BOLS et al. 1995, 1997), aber auch bezüglich
der Qualität der gewonnenen KOK (BOLS et al. 1995, 1996, WARD et al. 2000, LOPES et al.
2006). In Bezug auf die Anzahl der Kumuluszellagen kann neben der Anpassung des Aspirationsdruckes
auch die Veränderung des Durchmessers der Punktionskanüle eine Optimierung
bewirken (HASHIMOTO et al. 1999, SASAMOTO et al. 2003).
5

2 Literatur
2.1.2 Vergleich des OPU mit anderen Methoden zur Gewinnung von Eizellen
bzw. Embryonen beim Rind
Für die Gewinnung von KOK zur anschließenden IVP von Embryonen gibt es verschiedene
Verfahren. Aus Ovarien vom Schlachthof können KOK mittels Aspiration der Follikel (WARE
et al. 1989) oder durch Slicing der Ovarien (XU et al. 1992) gewonnen werden. Am lebenden
Tier wurden die transvaginale endoskopische Follikelpunktion (REICHENBACH et al. 1994),
die ultraschallgeleitete Follikelpunktion über die sakroischiale Region (CALLESEN et al. 1987)
und die transvaginale, ultraschallgeleitete Follikelpunktion [OPU; PIETERSE et al. (1988)] entwickelt.
Eine Gewinnung von in vivo produzierten Embryonen ist mittels Spülung des Uterus
möglich (HAHN 1978), was im MOET-Verfahren Anwendung findet. Über einen endoskopischen
Eingriff können tubale Embryonalstadien entnommen werden (BESENFELDER et al.
2001). Im Nachfolgenden sollen lediglich die meistgenutzten Verfahren (Gewinnung von KOK
aus Schlachthofovarien, MOET) mit der OPU-Methode verglichen werden.
Der große Vorteil des OPU gegenüber der Separation von Eizellen aus Schlachthofmaterial
ist die mehrfach mögliche Anwendung bei wertvollen Tieren (BOLS et al. 1995). Jedoch ist die
Qualität der Eizellen aus Schlachthofovarien in der Regel höher, da bei ihnen der sogenannte
„post-mortem-Effekt“ eintritt (BLONDIN et al. 1997), der eine verbesserte Entwicklungskompetenz
bedingt, und die Anzahl der Kumuluszelllagen durchschnittlich höher ist (BUNGARTZ
et al. 1995). Ein weiterer Nachteil beim OPU ist die begrenzte Anzahl an KOK, die eine Selektion
bezüglich der Qualität oft nicht zulässt (MERTON et al. 2003, CHAUBAL et al. 2006).
Vorteilhaft gegenüber dem MOET ist, dass die OPU-Technik auch bei graviden Tieren angewandt
werden kann (RYAN et al. 1990, MERTON et al. 2003). Dies bedingt nicht nur eine erhebliche
Verkürzung des Generationsintervalls (MERTON et al. 2003), sondern auch eine höhere
Anzahl von Embryonen pro Zeiteinheit (GOODHAND et al. 1999, MERTON et al. 2003). Obwohl
die Fähigkeit, eine Trächtigkeit hervorzurufen bei IVP-Embryonen gegenüber der in vivo
generierter Embryonen geringer ist (MERTON et al. 2003), ermöglicht das OPU mit anschließender
IVP die Produktion von über 50 Kälber pro Donortier im Jahr (VAN WAGTENDONK-DE
LEEUW 2006). Auch kann bei der IVP Sperma verschiedener Bullen eingesetzt werden (GALLI
et al. 2001, MERTON et al. 2003). Ferner kann im Gegensatz zum MOET beim OPU vollständig
auf den Einsatz von Hormonen verzichtet werden (BUNGARTZ et al. 1995, GALLI et al.
2004, CHAUBAL et al. 2006). Weiterhin ist eine schnelle Rückkehr der Tiere in den normalen
Zyklus nach OPU belegt (PIETERSE et al. 1991b). Es ist allerdings zu beachten, dass beim
OPU ein intensiveres „Tier-Handling“ mit entsprechenden Fähigkeiten bei der Manipulation des
Genitaltraktes, die Bereitstellung des kostenintensiven OPU-Equipments sowie entsprechender
Laboreinrichtungen für die anschließende IVP Vorraussetzung sind (BROADBENT et al. 1997).
Dies bedingt einen höheren Kostenaufwand als beim MOET (BROADBENT et al. 1997, GALLI
et al. 2004, VAN WAGTENDONK-DE LEEUW 2006). Beim OPU besteht weiterhin ein höheres
Risiko der Übertragung von infertilen Haplotypen in die Folgegeneration, da durch OPU Fertilitätsstörungen
des Donortieres in stärkerem Maße als beim MOET umgangen werden können
(VAN WAGTENDONK-DE LEEUW 2006).
6

2.2 Einfluss des OPU auf die Gesundheit des Donortieres
2.2 Einfluss des OPU auf die Gesundheit des Donortieres
Wie jeder Eingriff, sei er noch so minimal, ist auch das OPU nicht ohne Auswirkungen auf die
betroffenen Tiere. So können zum Beispiel in seltenen Fällen bedingt durch die Epiduralanästhesie
Veränderungen im Bereich der Injektionsstelle beobachtet werden, die sich in Form von
Neovaskularisation und Knorpelmetaplasie an den Intervertebralscheiben darstellen (MCEVOY
et al. 2006). Eine Beeinträchtigung der Allgemeingesundheit (SANTL et al. 1998, PETYIM et al.
2003), der Fertilität (ALLER et al. 2010) sowie der Gravidität bis zum dritten Trächtigkeitsmonat
(MEINTJES et al. 1993) scheinen jedoch nicht aufzutreten. Ebenso bleiben die Milchproduktion
sowie die somatischen Zellzahlen in Milch und Blutplasma unbeeinflusst (CHASTANT-
MAILLARD et al. 2003). Eine Rückkehr zum physiologischen Zyklus ca. 3-4 Tage nach der
letzten Punktion (CHASTANT-MAILLARD et al. 2003) mit physiologischem Verhalten (PETY-
IM et al. 2007) sowie die Möglichkeit, das MOET-Verfahren anzuwenden (BROADBENT et al.
1997), ist gegeben.
Grundsätzlich wird durch OPU der physiologische Zyklus gestört (STUBBINGS und WAL-
TON 1995, BONI et al. 1997, BOLS et al. 1998, PETYIM et al. 2000). Durch die Aspiration
der Follikel wird der Interöstrus verlängert (STUBBINGS und WALTON 1995), da die jeweils
abgesaugten Follikel durch eine neue Follikelwelle ersetzt werden müssen. Dies deckt sich mit
der Beobachtung verspäteter oder gestörter Brunsten bei OPU während der Lutealphase von
TAKUMA et al. (2010). Der Zeitpunkt des OPU, aber auch das Punktionsintervall sind wesentliche
Faktoren, die auf den Zyklus Einfluss nehmen. So konnten Bage et al. (BAGE et al. 2003)
bei einem diskontinuierlichen OPU-Regime mit Punktionen lediglich bis zum 12. Zyklustag
keine Auswirkungen auf den Zyklus beobachten. Auch die Arbeitsgruppe von PIETERSE et al.
(1991a) konnte bei OPU-Sitzungen an Tag 4, 10 und 16 des Zyklus eine normale Zyklusaktivität
feststellen. Kontinuierliche, einmal wöchentlich stattfindende OPU-Sitzungen führen dagegen
zu irregulären Zykluslängen (KLOSSOK et al. 1997), setzen die Zyklusaktivität aber nicht aus
(GIBBONS et al. 1994, BONI et al. 1997, GALLI et al. 2001, PETYIM et al. 2003). Bei zwei wöchentlichen
Follikelpunktionen sind die Beobachtungen nicht einheitlich. PETYIM et al. (2000)
beschreiben gelegentlich auftretende Zyklusaktivität und Brunsten mit regulärer Zykluslänge,
Östruslänge und physiologisch ablaufender Brunst. In den Untersuchungen der Arbeitsgruppen
um BONI et al. (1997) und GIBBONS et al. (1994) zeigte sich dagegen keine Zyklusaktivität.
2.3 Einfluss des OPU auf den ovariellen Zyklus
In Bezug auf das Ovar konnten keine wesentlichen, makroskopisch erkennbaren Veränderungen
festgestellt werden (PETYIM et al. 2007), jedoch verändert sich die Struktur des Ovars
(PETYIM et al. 2001). In einigen Fällen können Vernarbungen und Verhärtungen der Ovarien
auftreten. Verdickungen der Tunica albuginea (VAN DER SCHANS et al. 1991, PETYIM et al.
2001) sowie Fibrosierungen und hämatomartige Follikel wurden beobachtet (PIETERSE et al.
1988, VAN DER SCHANS et al. 1991, PETYIM et al. 2000). Jedoch sind jegliche Veränderungen
8 Monate nach der letzten Follikelpunktion nicht mehr sichtbar (CHASTANT-MAILLARD
et al. 2003), so dass langfristig kein negativer Effekt auf die follikuläre und luteale Aktivität des
Ovars besteht (PETYIM et al. 2000, MCEVOY et al. 2002). Eine Beeinflussung der Ovarfunktion
während längerer Zeiträume kontinuierlichen OPUs ist belegt (CARLIN et al. 1999). So
7

2 Literatur
führt das Absaugen aller Follikel zur Auslösung einer neuen Follikelwelle und kann diese sogar
synchronisieren (GARCIA und SALAHEDDINE 1998). Dies geschieht auch, wenn lediglich
die Follikel eines der beiden Ovarien abgesaugt werden (TAKUMA et al. 2008). Ein zweimal
wöchentliches OPU-Regime erhöht die Follikelwellenfrequenz (BONI et al. 1997), wobei eine
neue Follikelwelle innerhalb von 2 (GARCIA und SALAHEDDINE 1998) bzw. 3 (BONI et al.
1997) Tagen entsteht. BONI et al. (1997) beschreiben ferner einen Anstieg der Follikelzahl über
die ersten drei Monate und ein anschließendes Absinken im 4.-6. Monat.
Auf ein bestehendes Corpus luteum (C.l.) gibt es anscheinend keinen Einfluss (PIETERSE
et al. 1991a). Die Bildung C.l.-ähnlicher Strukturen aus punktierten Follikeln wird unter anderem
durch PETYIM et al. (2000) beschrieben. Für eine östrusnahe Punktion von Follikeln ist die
Bildung physiologischer Gelbkörper (PETYIM et al. 2001, 2003) beschrieben, wohingegen die
östrusferne Punktion von Follikeln zu kleineren C.l.-ähnlichen Strukturen führt, deren Progesteronproduktion
und Lebensdauer geringer ist (GIBBONS et al. 1994, PETYIM et al. 2001, 2003).
HAYASHI et al. (2006) konnten hingegen keine C.l.-Bildung bei der Punktion eines dominanten
Follikels vor dem LH-Peak beobachten. Eine Punktion nach dem LH-Peak führte in dieser
Studie zu normalen C.l.. Zusammen mit dem Zyklus werden auch die damit einhergehenden
Hormonprofile, insbesondere von Progesteron (P4), durch fehlende bzw. unzureichende Gelbkörperbildung,
Luteinisierendem Hormon (LH) und Follikel stimulierendem Hormon (FSH)
beeinflusst (CARLIN et al. 1999). In Bezug auf FSH konnte eine vermehrte Ausschüttung am
Tag nach der Follikelpunktion festgestellt werden (PETYIM et al. 2001).
2.4 Einflüsse des Zyklusstandes auf die Ergebnisse des OPU
Die Ergebnisse des OPU in Bezug auf die Anzahl der punktierten Follikel und die Eizellausbeute
werden durch vielfältige Faktoren beeinflusst. So sind das jeweils punktierte Individuum
(LANSBERGEN et al. 1995, BONI et al. 1997, GALLI et al. 2001, MERTON et al. 2003, TA-
MASSIA et al. 2003), die Ernährung des Tieres (DOMINGUEZ 1995), das Alter (SU et al. 2012)
bezogen auf den körperlichen Entwicklungsstand (GALLI et al. 2001), eine etwaige Trächtigkeit
(MORENO et al. 1993, DOMINGUEZ 1995) und die Zeit seit dem letzten Partus (RIZOS et al.
2005) von Bedeutung. Nicht auszuwirken scheint sich hingegen die Anzahl der vorangegangenen
Kalbungen (LANSBERGEN et al. 1995). Von technischer Seite aus können die Modalitäten
des Ultraschallequipments Einfluss nehmen (MERTON et al. 2003). Einfluss auf die Anzahl der
KOK besteht einerseits von Seiten des Durchführenden (LANSBERGEN et al. 1995, MERTON
et al. 2003), andererseits auch durch technische Modalitäten. So konnten etwa der Aspirationsdruck
und der Nadeldurchmesser (HASHIMOTO et al. 1999) als Faktoren benannt werden.
Die Berichte über den Einfluss des Zeitintervalls zwischen den OPU-Sitzungen sind nicht
einheitlich. So konnten VAN DER SCHANS et al. (1991), GARCIA und SALAHEDDINE (1998),
GOODHAND et al. (1999), CHAUBAL et al. (2006) und HANSTEDT (2009) bei zweimal wöchentlich
stattfindenden OPU-Sitzungen mehr Follikel aspirieren als bei einmal wöchentlicher
Punktion. Die Forschungsgruppe um RAMOS et al. (2010) punktierte im einmal wöchentlichen
Rhythmus mehr Follikel als bei zweimal wöchentlichen Sitzungen. Bezüglich der Eizellausbeute
wirkt sich ein 2-Tages-Intervall des OPU offenbar ungünstig aus, jedoch sind bei 4-5-Tages-
8

2.5 Einfluss des Zyklusstandes auf die Qualität der KOK
Intervallen anteilig mehr große Follikel vorhanden (BONI et al. 1997), welche eine schlechtere
Qualität der KOK aus den subordinaten Follikeln bewirken.
Bezüglich hormoneller Beeinflussung scheint sich die Gabe von FSH positiv auf die Follikelzahl
auszuwirken (DE ROOVER et al. 2008, ALLER et al. 2010). Auch eine Erhöhung der
Eizellausbeute ist durch hormonelle Gaben (FSH, GnRH) möglich (BORDIGNON et al. 1997,
ALLER et al. 2010).
Die Anzahl der vorhergehenden OPU-Sitzungen ist ebenfalls von Bedeutung. So ist die Follikelzahl
bei Tieren, die vorher nie der OPU-Prozedur unterzogen wurden, größer (BOLS et al.
1998). Weiterhin scheint die Follikelzahl über längere Punktionszeiträume zunächst anzusteigen,
um dann nach 4-6 Monaten wieder abzufallen (BONI et al. 1997).
Über den Einfluss des Zyklusstandes gibt es keine einheitlichen Erkenntnisse. PETYIM et al.
(2000) beobachteten eine geringere Anzahl an Follikeln bei Tieren, die ein C.l. aufwiesen, BOE-
DIONO et al. (1995) und DOMINGUEZ (1995) konnten dies jedoch nicht bestätigen.
2.5 Einfluss des Zyklusstandes auf die Qualität der KOK
Bei der Beeinflussung der Eizellqualität sind zunächst einmal technische Parameter zu nennen.
So ist belegt, dass ein hohes Vakuum einerseits zu weniger Kumuluszellen an den KOK
führt (BOLS et al. 1995) und andererseits auch die Entwicklungsraten zur Blastozyste negativ
beeinflusst (BOLS et al. 1996, WARD et al. 2000).
Hinsichtlich des Punktionsintervalles ist zu berücksichtigen, dass bei einmal wöchentlichen
Punktionen dominante Follikel ausgebildet werden können (GARCIA und SALAHEDDINE 1998,
PETYIM et al. 2003, LOPES et al. 2006). Bei einem Intervall von 3-4 Tagen entwickelt sich
kein Follikel mit ausgeprägter Dominanz, was den potenziell negativen Effekt auf die Entwicklungskompetenz
der subordinaten Follikel fehlen lässt (GIBBONS et al. 1994, BUNGARTZ et al.
1995). HENDRIKSEN et al. (2004) erhielten bei Punktionsintervallen von 2-5 Tagen mehr IVPtaugliche
KOK als bei 7-Tages-Intervallen. Im Gegensatz dazu konnte HANSTEDT (2009) keinen
Einfluss des Punktionsintervalles auf die KOK-Qualität, die IVP-Tauglichkeit sowie die
Teilungs- und Entwicklungsraten feststellen. In dieser Studie wurde ein 7-tägiges Intervall mit
3- bis 4-tägigen Punktionsabständen verglichen.
Beim 3- bis 4-Tages-Intervall liegt auch eine reduzierte Inzidenz von Atresie vor, da die Follikel
bereits vor der Atresieinduktion, welche sich am fünften Tag der Follikelwelle strukturell
manifestiert (ASSEY et al. 1994), entfernt werden (GARCIA und SALAHEDDINE 1998, GAL-
LI et al. 2001, LOPES et al. 2006). Während der Follikelatresie kommt es zu degenerativen
Prozessen, welche mit dem Schrumpfen der Eizelle und der Granulosazellen bis zum völligen
Verschwinden einhergeht (SCHNORR und KRESSIN 2001). Oozyten aus früh-atretischen Follikeln
zeigten in einigen Studien ein gutes Entwicklungspotential (BLONDIN und SIRARD 1995,
DE WIT et al. 2000), was vermutlich darauf zurückzuführen ist, dass die ersten atretischen Veränderungen
denen der Eizellreifung ähneln (ASSEY et al. 1994).
Während in einer Untersuchung keine Unterschiede in den Teilungs-und Entwicklungsraten
von KOK aus ein- bzw. zweimal wöchentlich durchgeführtem OPU beobachtet werden
konnten (CHAUBAL et al. 2006), schlossen andere Autoren in ihren Veröffentlichungen, dass
9

2 Literatur
die Teilungs- und Entwicklungsraten von aus OPU-KOK entstandenen Embryonen durch die
Dauer des Punktionsintervalles beeinflusst werden (HANENBERG und VAN WAGTENDONK-DE
LEEUW 1997, LOPES et al. 2006). So zeigten KOK aus zweimal wöchentlich durchgeführtem
OPU höhere Entwicklungsraten als solche aus einmal wöchentlichen Punktionen (LOPES et al.
2006). Einige Autoren folgern daraus, dass ein einmal wöchentliches OPU-Regime für kommerzielle
Embryotransfer-Programme inadäquat ist (LOPES et al. 2006).
2.6 Beurteilung der Entwicklungskompetenz boviner Oozyten
Grundlage einer erfolgreichen Produktion von Embryonen ist die Qualität bzw. die Entwicklungskompetenz
der in der IVP eingesetzten Oozyten. Diese wird meist funktionell definiert
und über die Fähigkeit zum Meioseabschluss, zur Befruchtung und anschließenden Teilung,
der Entwicklung zur Blastozyste, der Fähigkeit der Induktion und Erhaltung einer Trächtigkeit,
der Erhaltung der Gesundheit des Feten und schließlich der Geburt eines gesunden und fertilen
Kalbes gemessen (LONERGAN et al. 2001, SIRARD et al. 2006, ANGUITA et al. 2007). Dementsprechend
kann die Entwicklung zur Blastozyste auch als Maß für die Qualität der eingesetzten
KOK herangezogen werden. GILCHRIST und THOMPSON (2007) bezeichnen bereits die Fähigkeit
der Eizelle, über Sezernierung bestimmter Faktoren ihre Umgebung zu beeinflussen als
Teil ihrer Entwicklungskompetenz.
Eine vollständige Beurteilung der Entwicklungskompetenz bis hin zur Geburt eines vitalen
Kalbes ist in Versuchen kaum möglich. Optimal für die Effizienz der IVP wäre eine Beurteilung
der KOK schon vor ihrer Gewinnung. Aus bisherigen Untersuchungen konnten beim Rind
jedoch keine verlässlichen Indikatoren gefunden werden, um die Qualität von Eizellen aus Follikeln
bestimmter Größe vorauszusagen (KENDRICK et al. 1999). Zwar stellten PAVLOK et al.
(1992) bei Eizellen aus Follikeln der Größen >2 mm bis 8 mm keine Unterschiede der Blastozystenraten
fest, bei zwei Dritteln der eingesetzten Eizellen traten jedoch Unregelmäßigkeiten
bei Fertilisation und Entwicklung zur Blastozyste auf. Die Autoren führen dies auf atretische
Vorgänge in den Follikeln, denen diese Eizellen entstammten, zurück. Dies deckt sich mit früheren
Untersuchungen von SCARAMUZZI et al. (1980) und MCNATTY et al. (1984), die jeweils
eine höhere Inzidenz von Atresie in Follikeln < 5 mm festgestellt hatten. Auch Arbeiten von
FAIR (2003) ergaben, dass die Entwicklungskompetenz zur Blastozyste erst ab einer Follikelgröße
von 3 mm gegeben ist, da die Eizelle dann die Größe von 120 µm und somit meiotische
Kompetenz (FAIR et al. 1995, ANGUITA et al. 2007) sowie die Fähigkeit der Entwicklung bis
zur Blastozyste (OTOI et al. 1997) erreicht hat.
Eine Beurteilung der KOK hinsichtlich ihrer Qualität findet daher in der Regel nach ihrer
Gewinnung statt. Eine Einteilung aufgrund von morphologischen Kriterien zeigte sich als geeigneter
Indikator (HAZELEGER et al. 1995, BONI et al. 2002). Dabei gilt die Größe der Eizelle
als Indikator für die meiotische Kompetenz (siehe oben). Die Anzahl der Kumuluszellen sowie
die Beschaffenheit des Cumulus oophorus (MADISON et al. 1992), aber auch Anzeichen von
Degeneration der KOK wie Expansion der äußeren Kumuluszellagen und eine leichte Granulierung
des Ooplasmas werden zur Beurteilung genutzt (BLONDIN und SIRARD 1995). Ebenso
konnte inhomogenes und helles Ooplasma mit geringeren Entwicklungsraten in Zusammenhang
gebracht werden (HAZELEGER et al. 1995). Kritiker führen jedoch den limitierten Erfolg
10

2.6 Beurteilung der Entwicklungskompetenz boviner Oozyten
dieser Methode an (COTICCHIO et al. 2004). So könne anhand der genutzten Kriterien keine
endgültige Aussage über die Entwicklungskompetenz gemacht werden (HAGEMANN 1999,
MERMILLOD et al. 1999). Zum Beispiel zeigen morphologisch gute KOK aus atretischen Follikeln
eine geringere Entwicklungskompetenz als morphologisch ähnliche aus gesunden Follikeln
(JEWGENOW et al. 1999, FENG et al. 2007). Auch die Expansion des Cumulus oophorus
wird als unzuverlässiges Kriterium beschrieben (RUSSELL et al. 2006). Insbesondere vor dem
Schritt der In vitro-Reifung können Eizellen mit In vitro-Entwicklungskompetenz morphologisch
stark variieren (DE LOOS et al. 1992).
SANTOS et al. (2008) nahmen eine Einschätzung der Entwicklungskompetenz über die Anzahl
der Poren in der Zona pellucida sowie deren Durchmesser vor. Andere Autoren zogen die
Dichte der Granulosazellen in der Follikelflüssigkeit (FENG et al. 2007), den Gehalt an Wachstumshormonen
(MODINA et al. 2007), Aminosäuren (SINCLAIR et al. 2008) oder Progesteron
(HAZELEGER et al. 1995) in der Follikelflüssigkeit oder die Aktivität des Enzyms Glucose-
6-Phosphatdehydrogenase mittels Brilliant-Kresyl-Blau-Färbung (BHOJWANI et al. 2007) für
die Beurteilung heran. Während der IVP können die Formung (DOMINKO und FIRST 1992)
des Polkörpers und eine frühe Vollendung der Kernreifung während der IVM (DOMINKO und
FIRST 1997) sowie das Auftreten der Furchung nach der Fertilisation (WARD et al. 2001) als
Hinweise auf die Entwicklungskompetenz dienen.
Die Entwicklungskompetenz basiert auf multiplen Faktoren, von denen viele auf zellulärer
bzw. molekularer Ebene angesiedelt sind und deshalb nur invasiv gemessen werden können
(COTICCHIO et al. 2004). Methoden zur Beurteilung der Kompetenz auf zellulärer und molekularer
Ebene gehen zumeist mit der Zerstörung der Eizelle einher. Sie geben jedoch die
Möglichkeit, objektive Parameter zur Beurteilung der Oozytenqualität zu finden (COTICCHIO
et al. 2004). Zur Umgehung dieser destruktiven Prozesse muss eine Korrelation zwischen invasiven,
zerstörenden Methoden und nichtinvasiven, erhaltenden Methoden gefunden werden
(ANGUITA et al. 2007).
Eine gute Methode, ein weites Spektrum von Daten bezüglich der Eizellqualität zu erfassen,
stellt die Analyse der MessengerRNA(mRNA)-Expression dar (LECHNIAK 2002). Jedoch
bedingt eine erhöhte mRNA-Expression bestimmter Gene nicht immer auch erhöhte Proteingehalte
(GYGI et al. 1999), und Proteine sind nicht immer enzymatisch aktiv (SUMNER et al.
2003). Es wird deshalb nach Korrelationen zwischen der Kompetenz und den in der Follikelflüssigkeit
bzw. dem IVM-Medium zu findenden Proteinen (ELLEDEROVA et al. 2004, GUPTA
et al. 2009) und Metaboliten (SINGH und SINCLAIR 2007) gesucht.
Mit der vollständigen Sequenzierung des bovinen Genoms entstand auch die Möglichkeit
der globalen Analyse des Transkriptoms mit Hilfe von Microarray-Techniken. Im Gegensatz
zur einzelnen Analyse der Gentranskripte mittels RT-qPCR kann hier eine Vielzahl von Genen
gleichzeitig betrachtet werden. Globale Transkriptomanalysen boviner MII-Oozyten (MI-
SIRLIOGLU et al. 2006, KUES et al. 2008) sowie vergleichende Analysen reifer und unreifer
Eizellen (MAMO et al. 2011) lieferten neue Informationen über die molekularen Veränderungen
während der Eizellreifung und konnten das Vorhandensein aktiver Transkription während
der Eizellreifung belegen (MAMO et al. 2011). O’SHEA et al. (2012) gelang über eine Meta-
Analyse veröffentlichter Microarray-Daten die Identifizierung 63 potenzieller Markergene für
die Entwicklungskompetenz boviner Oozyten.
11

2 Literatur
2.7 Einfluss des Zyklusstandes auf die Entwicklungskompetenz boviner
KOK
Es gibt Hinweise auf den Einfluss des individuellen Tieres (TAMASSIA et al. 2003, GALLI et al.
2004), der Rasse (LOPES et al. 2006), des Alters (SU et al. 2012) bezogen auf die Adoleszenz
(PALMA et al. 1993, STEEVES und GARDNER 1999, RIZOS et al. 2005, MALHI et al. 2007)
und die damit verbundene Steroidbalance (SU et al. 2009), der Fütterung (DOMINGUEZ 1995,
KENDRICK et al. 1999, ADAMIAK et al. 2005), des Laktationsstatus (BUNGARTZ et al. 1995),
insbesondere bei Hochleistung (LEROY et al. 2008), und einer etwaigen Trächtigkeit (MORENO
et al. 1993) auf die Kompetenz der KOK (siehe auch 2.1). Auch die Herkunft und die Methode
der Gewinnung der KOK wirkt sich auf die Entwicklungsrate zur Blastozyste aus (GAD et al.
2012). Bei der Gewinnung von KOK aus Schlachthofovarien prägten BLONDIN et al. (1997)
den Begriff des „post-mortem-Effektes“. Diese Autoren stellten fest, dass die Zeitspanne vom
Tod des Tieres bis zur eigentlichen Eizellgewinnung über Veränderungen im follikulären Mikromilieu
die Entwicklungskompetenz der Oozyten beeinflusst.
Einer der Hauptfaktoren, die die Qualität von Eizellen beeinflussen, stellt das follikuläre
Entwicklungsstadium dar. So besteht ein deutlicher Zusamenhang zwischen Follikelgröße und
Entwicklungskompetenz der Oozyte. Eizellen aus kleinen Follikeln mit einem Durchmesser
< 3 mm haben demnach ein signifikant geringeres Entwicklungspotential als solche aus größeren
Follikeln (TAN und LU 1990, PAVLOK et al. 1992, LONERGAN et al. 1994, BLONDIN
und SIRARD 1995, RIZOS et al. 2002). Weiterhin ist die Entwicklungsrate bei Oozyten aus
nicht-atretischen, intermediären und leicht atretischen Follikeln gleich (BLONDIN und SIRARD
1995). DE WIT et al. (2000) stellten sogar mit steigender Atresie ein zunehmendes Entwicklungspotential
fest. ASSEY et al. (1994) prägten 1994 hierfür den Begriff der „Pseudomaturation“.
Lediglich hoch atretische Follikel enthalten Oozyten mit herabgesetzter Kompetenz
(DE WIT et al. 2000). Im Zusammenhang mit dem Follikelstadium wurde auch das hormonelle
Umfeld der Eizelle im Follikel betrachtet. HAZELEGER et al. (1995) fanden dabei heraus,
dass sich eine hohe Progesteronkonzentration in der Follikelflüssigkeit ungünstig auf die Eizellqualität
auswirkt. Dies deckt sich mit den Erkenntnissen von BELLIN und AX (1984), die
mit steigender Atresie höhere Progesterongehalte in der Follikelflüssigkeit nachweisen konnten.
Weiterhin ist bekannt, dass ein dominanter Follikel, insbesondere im späten Dominanzstadium,
negativ auf die Qualität der Eizellen aus den subordinaten Follikeln einwirkt (HENDRIK-
SEN et al. 2004, CHAUBAL et al. 2006). Auch bezüglich der Entwicklungskompetenz kann
daher der Zeitpunkt bzw. das Intervall der Eizellgewinnung bedeutsam sein (siehe Kap. 2.2.3).
Je länger die Dominanzphase, desto mehr degenerierte Oozyten und Embryonen treten auf (AH-
MAD et al. 1995, REVAH und BUTLER 1996, CERRI et al. 2009). REVAH und BUTLER (1996)
vermuten, das eine verfrühte nukleare Reifung der Eizellen dafür verantwortlich sei. Die Beobachtung
von vermehrter Follikelatresie bei verlängerter Dominanzphase durch OUSSAID et al.
(2000) stützt diese These. Auch andere Autoren konnten höhere Teilungs- und Entwicklungsraten
während der Wachstums- im Vergleich zur Dominanzphase feststellen (HAGEMANN 1999,
MACHATKOVA et al. 2004, NEMCOVA et al. 2006). Daher vermuten CERRI et al. (2009) einen
starken Einfluss der Länge der Dominanz auf die Entwicklungskompetenz bis Tag 6 der frühen
Embryonalentwicklung. Ein weiterer Faktor, dem ein Einfluss auf die Entwicklungskompetenz
zugeschrieben wird, ist die Anzahl der Follikel mit einer Größe von 2-5 mm auf dem Ovar.
12

2.7 Einfluss des Zyklusstandes auf die Entwicklungskompetenz boviner KOK
Befinden sich demnach weniger als 10 Follikel der Größe 2-5 mm auf dem Ovar, so sind die
Teilungs- und Entwicklungsraten zur Blastozyste der dort gewonnenen KOK deutlich verringert
(GANDOLFI et al. 1997, MODINA et al. 2007).
Bezüglich der C.l.-Präsenz zum Zeitpunkt der Eizellgewinnung gibt es keine eindeutigen
Erkenntnisse. Einige Autoren beschreiben einen Einfluss des C.l. auf die Eizellqualität (BOE-
DIONO et al. 1995, LANSBERGEN et al. 1995, STUBBINGS und WALTON 1995), PETYIM et al.
(2003) und VASSENA et al. (2003) konnten dies jedoch nicht bestätigen. Auch in den Untersuchungen
von DE WIT et al. (2000) wurde kein Einfluss des Zyklusgeschehens beobachtet.
Weiterhin wurde der gezielte Einsatz von Hormonen zur Verbesserung der Entwicklungskompetenz
untersucht. Dabei stellten BORDIGNON et al. (1997) einen positiven Effekt von GnRH
fest. Auch die Gonadotropine FSH und eCG wirken sich auf die Entwicklungsraten zu Embryonen
aus (WANG et al. 1988, SENDAG et al. 2008). Eine Aufstellung der untersuchten Parameter
und deren Einfluss auf die Entwicklungskompetenz boviner Oozyten findet sich in Tabelle 2.1.
13

2 Literatur
Tabelle 2.1: Untersuchungen zu verschiedenen Parametern und deren Einfluss auf die
Entwicklungskompetenz boviner Oozyten
Autor Parameter Kriterium Ergebnis
PLOURDE et al. (2012) Herkunft der KOK ER in vivo ER↑
in vivo vs. p. mortem
LOPES et al. (2006) Rasse Morphologie bei Holstein Qualität↑
PALMA et al. (1993) Alter Morphologie bei Adulten Qualität↑
TR, ER
TR↑, ER↑
SU et al. (2012) Alter TR, ER bei 1 Jahr alten
1 vs. 7-8 Jahre, TR↓ ,ER↓
RIZOS et al. (2005) Färse, Kuh ER bei Kühen ER↑
DOMINGUEZ (1995) Energiebilanz Morphologie Defizit Qualität↓
KENDRICK et al. (1999)
ADAMIAK et al. (2005) ER Überversorgung ER↓
BUNGARTZ et al. (1995) Reproduktionsphase Morphologie, ER während Laktation
Qualität↑, TR↑
TAN und LU (1990) TR, ER < 2 mm TR↓, ER↓
> 6 mm TR↓, ER↓
PAVLOK et al. (1992) Follikelgröße TR < 2mm TR↓
LONERGAN et al. (1994) Morphologie, ER < 2 mm Qualität↓, ER↓
BLONDIN und SIRARD (1995) ER < 2mm ER↓
DE WIT et al. (2000) Atresie ER ER↑
HAZELEGER et al. (1995) P4 in FF Morphologie hohes P4 Qualität↓
HANSTEDT (2009) foll. Blutfluss Morphologie erkennbarer Blutfluss
TR, ER Qualität↑, TR↑, ER↑
MACHATKOVA et al. (2004)
HENDRIKSEN et al. (2004) Morphologie, ER Qualität↓, ER↓
CHAUBAL et al. (2006) DF ER ER↓
NEMCOVA et al. (2006)
CERRI et al. (2009)
BOEDIONO et al. (1995) C.l. TR, ER TR↑, ER↑
DE WIT et al. (2000) ER frühe Lutealphase ER ↑
PETYIM et al. (2003) Morphologie keiner
VASSENA et al. (2003) ER keiner
BORDIGNON et al. (1997) GnRH ER ER↑
SENDAG et al. (2008) FSH, eCG Morphologie FSH Qualität↑
ER=Entwicklungsrate zur Blastozyste, TR=Teilungsrate, ↑= erhöht, ↓=verringert
2.8 Beeinflussung der follikulären Reifungsvorgänge durch peripheres
Progesteron
Nach wie vor gibt es keine klaren Beweise über den Effekt des peripher zirkulierenden Progesterons
auf die Follikelentwicklung, die Fertilisation und die frühe Embryonalentwicklung
(CERRI et al. 2011b).
14

2.9 In-vitro-Maturation (IVM) boviner Oozyten
Durch die Studien von SANGSRITAVONG et al. (2002) wurde bekannt, dass die hohe Futteraufnahme
während der Hochlaktation zu einem erhöhten Leberblutfluss sowie einer hohen
Stoffwechselaktivität führt und sich dadurch die Menge an zirkulierendem P4 und E2 verringert.
Den schnelleren metabolischen Abbau von P4 und E2 sehen die Autoren als Ursache für
die herabgesetzte Fertilität hochleistender Milchkühe.
WILTBANK et al. (2006) beobachteten Veränderungen im Follikelwellenmuster infolge niedriger
P4-Konzentrationen im Blut. Ausserdem scheint eine kurze P4-Exposition in kleineren
ovulatorischen Follikeln zu resultieren, ohne dabei die Trächtigkeitsraten oder die Embryonenqualität
zu beeinflussen (CERRI et al. 2011b, DIAS et al. 2012). Zunehmend häufen sich die Hinweise,
dass sowohl Zeitpunkt und Konzentration der P4-Exposition für die Beeinflussung der
Fertilität insbesondere auf Follikel-/Eizellebene die entscheidende Rolle spielen (WILTBANK
et al. 2011). So assoziierten CERRI et al. (2011a) Veränderungen in der Follikelflüssigkeitskomposition,
der C.l.-Lebensdauer sowie eine geringere Fertilität mit niedrigen P4-Konzentrationen
während der follikulären Entwicklung. Dabei waren die Estradiolgehalte der Follikelflüssigkeit
des dominanten Follikels deutlich erhöht, während IGF-1 in geringeren Mengen enthalten war.
Auch SHAHAM-ALBALANCY et al. (2001) und FORTUNE et al. (2001) stellten erhöhte E2-
Konzentrationen in der Follikelflüssigkeit nach niedrigen Blut-P4-Gehalten fest.
Viele Autoren vermuten den Effekt des peripheren P4 in der Beeinflussung der LH-Ausschüttung
(CERRI et al. 2011b,a, RIVERA et al. 2011, PURSLEY und MARTINS 2011). Schon IRE-
LAND und ROCHE (1982) entdeckten erhöhte LH-Pulsfrequenzen bei niedrigem Blut-P4. Spätere
Arbeiten von ROBERSON et al. (1989), SIROIS und FORTUNE (1990), CERRI et al. (2011b),
RIVERA et al. (2011) bestätigen dies. Eine hohe LH-Pulsfrequenz beschleunigt laut FORTUNE
et al. (2001) das Follikelwachstum und wird mit einer verfrühten Eizellreifung im Follikel (RE-
VAH und BUTLER 1996) und dementsprechend einer verminderten Eizellqualität (REVAH und
BUTLER 1996, DENICOL et al. 2012) sowie einer schlechteren frühen Embryonalentwicklung
(AHMAD et al. 1995, CERRI et al. 2011b,a, RIVERA et al. 2011) in Verbindung gebracht.
In der follikulären Wachstumsphase und während der Selektion des dominanten Follikels
scheinen sich hohe periphere P4-Konzentrationen positiv auf die Entwicklungsraten und die
Fertilität auszuwirken (CUNHA et al. 2008, BISINOTTO et al. 2010, BISINOTTO und SANTOS
2011, NASSER et al. 2011, RIVERA et al. 2011, WILTBANK et al. 2011, PURSLEY und MAR-
TINS 2011). Ein möglicher Einfluss des zirkulierenden P4 auf später ablaufende Vorgänge der
frühen Embryonalentwicklung wird daher diskutiert (CERRI et al. 2009, NASSER et al. 2011,
RIVERA et al. 2011).
2.9 In-vitro-Maturation (IVM) boviner Oozyten
Grundsätzlich besteht die IVP aus drei methodischen Schritten (siehe Abbildung 2.1). Zuerst die
In-vitro-Reifung oder -Maturation (IVM), danach die In-vitro-Fertilisation oder -Befruchtung
(IVF) und schlussendlich die mehrtägige In-vitro-Kultur [IVC; WRIGHT und BONDIOLI (1981),
BALL et al. (1984), NIEMANN und MEINECKE (1993), WARD et al. (2002), SIRARD et al.
(2006)]. An dieser Stelle soll lediglich auf die Reifung (IVM) der Oozyten eingegangen werden.
15

2 Literatur
Abbildung 2.1: Schematische Darstellung der IVP beim Rind; modifiziert nach NIEMANN
und MEINECKE (1993)
Mittels OPU-Technik am lebenden Tier oder aus Schlachthofovarien post mortem per Aspiration
oder Schneidemethode [Slicing, ECKERT und NIEMANN (1995)] gewonnene KOK werden
anhand morphologischer Kriterien in IVP-taugliche und nicht-IVP-taugliche eingeteilt. IVPtaugliche
KOK zeichnen sich durch mindestens eine vollständige Lage kompakten Kumulus
und ein homogen dunkles Ooplasma aus (NIEMANN und MEINECKE 1993). Die Kumuluszellen
sind wichtig für die Herstellung eines Mikromilieus aus Stoffwechselprodukten und Sekretionsprodukten,
welches letzlich für die Penetration durch das Spermium wichtig ist (TANGHE et al.
2003). Eine Entfernung der Kumuluszellen vor der IVF wirkt sich negativ auf die Befruchtung
der Eizellen aus (FATEHI et al. 2002). Im Anschluss an die Selektion der KOK beginnt die 24-
stündige IVM. Während dieser Zeit wird die zuvor im Ovar arretierte Prophase beendet und die
meiotische Teilung fortgesetzt (NIEMANN und MEINECKE 1993, RÜSSE und SINOWATZ 1994,
SIRARD et al. 2006, SIRARD und COENEN 2006). Je nach Zustand der Eizellen und Mediumkomposition
sind Maturationsraten von 66-95 % der eingesetzten Oozyten möglich (ADONA
et al. 2008).
2.10 Beeinflussung der Eizell- und Embryonenqualität
Ein wesentlicher Beitrag zum Erfolg der IVP wird durch die Qualität der eingesetzten KOK geleistet
(siehe Kap. 2.2.3). Während die Eizellqualität die Ausbeute an Embryonen bestimmt, ist
die Embryonenqualität unter anderem von den in den einzelnen Schritten eingesetzten Medien
16

2.11 Einfluss der Maturationsbedingungen auf die Eizell- und Embryonenqualität
abhängig. Anfangs wurden komplexe Medien wie das Tissue Culture Medium 199 (TCM199)
mit dem Zusatz von undefinierten Stoffen wie zum Beispiel Serum, semidefinierten Stoffen wie
Bovines Serum Albumin (BSA) oder definierten Stoffen wie das Makromolekül Polyvinylalkohol
(PVA) verwendet (EYESTONE und FIRST 1989). Obwohl diese Medien erfolgreich in
der IVP eingesetzt wurden, erfolgte eine Weiterentwicklung der Kultursysteme, um die Embryonenqualität
zu verbessern. Dies diente besonders dem Ziel, die Problematik des Large Offspring
Syndromes (LOS) zu lösen. Das LOS wird durch signifikant höheres Geburtsgewicht,
Polyhydramnion, Hydrops fetalis, verändertes Organwachstum, Defekte von Plazenta, Skelett
und Immunsystem sowie eine hohe perinatale Mortalität charakterisiert (WALKER et al. 1996,
KRUIP und DEN , DAAS 1997, YOUNG et al. 1998, RENARD et al. 1999, SINCLAIR et al. 2000).
Deshalb wurden einfache Medien entwickelt, die häufig auf Modifikationen des Synthetic Oviduct
Fluid (SOF)-Mediums (TERVIT et al. 1972) basieren, bei denen Polyvinylpyrrolidon (PVP)
oder PVA zugesetzt werden (KESKINTEPE und BRACKETT 1996). Auch das Hamster Embryo
Culture Medium (HECM) zählt zu diesen einfachen Medien. Bei Verwendung von TCM199,
SOF oder HECM können Entwicklungsraten von mehr als 40 % erreicht werden (KESKINTEPE
und BRACKETT 1996, KRISHER et al. 1999, FERGUSON et al. 2004). Es konnte gezeigt werden,
dass die Entwicklungsraten in definierten Medien niedriger sind als bei der Verwendung
semidefinierter (mit BSA-Zusatz) oder undefinierter (mit Serum-Zusatz) Medien (ECKERT und
NIEMANN 1995, KESKINTEPE und BRACKETT 1996, WRENZYCKI et al. 1999). Trotz dieser
Verbesserungen ist die Qualität in vitro produzierter Embryonen immer noch deutlich schlechter
als die in vivo gewonnener (NIEMANN et al. 2002, RIZOS et al. 2002). So können nach
dem Transfer von IVP-Embryonen Trächtigkeitsraten von 30-40 % erziehlt werden, nach Embryotransfer
oder nach künstlicher Besamung (KB) 50-70 % (MOORE und THATCHER 2006).
Im Allgemeinen wird auch von höheren Verlusten während der Trächtigkeit berichtet (HASLER
et al. 1995, GALLI et al. 2001). MARQUANT-LE GUIENNE et al. (1989) stellten eine geringere
Anzahl an Zellen der Inner Cell Mass (ICM) bei IVP-Embryonen im Vergleich zu in vivo
generierten fest. Die Qualität eines Embryos zeichnet sich nicht nur durch die Fähigkeit, eine
Trächtigkeit zu induzieren und zu erhalten aus. Auch Parameter wie die Morphologie, die zeitliche
Abfolge der Entwicklung sowie die Kryotoleranz sind qualitätsanzeigend (WRENZYCKI
et al. 2005a). Eine langsamere Entwicklung in vitro (BARNES und EYESTONE 1990, GRIS-
ART et al. 1994) sowie eine geringere Kryotoleranz (RORIE et al. 1990, VOELKEL et al. 1992)
konnten schon in den 1990er Jahren belegt werden. JIANG et al. (1992) zeigten in ihrer Arbeit,
dass die Gesamtzellzahl des Trophoblasten ein gutes Kriterium zur Beurteilung der Qualität
darstellt. Andere Autoren konnten einen Zusammenhang der Qualität mit der Fähigkeit zum
Glukosestoffwechsel nachweisen (KRISHER et al. 1999, STEEVES und GARDNER 1999, HER-
RICK et al. 2006). Auf molekularer Ebene konnte die Expression bestimmter Gentranskripte als
Indikator für die Embryonenqualität identifiziert werden (WRENZYCKI et al. 2007).
2.11 Einfluss der Maturationsbedingungen auf die Eizell- und Embryonenqualität
Wie vorhergehend angedeutet, nehmen die IVP-Bedingungen entscheidenden Einfluss auf die
sich entwickelnden Embryonen und ihre spätere Güte. So kann allein die Dauer der Reifung die
Ergebnisse bezüglich der Teilungs- und Entwicklungsraten wesentlich verändern (WARD et al.
17

2 Literatur
2002, PARK et al. 2005, AGUNG et al. 2006). Allgemein hat sich dabei herausgestellt, dass eine
Reifungszeit von 18-24 h optimal ist. Längere Reifungszeiten führen zu einer sich negativ
auswirkenden „Überreife“ (HYTTEL et al. 1986). Auch die Sauerstoffkonzentration während
der Reifung wurde hinsichtlich ihres Einflusses untersucht. Die Ergebnisse differieren stark.
Während HASHIMOTO et al. (2000) höhere Entwicklungsraten bei 5 % O 2 erzielten, wirkte
sich die gleiche Sauerstoffkonzentration in Versuchen von PINYOPUMMINTR und BAVISTER
(1995) und OYAMADA und FUKUI (2004) negativ aus. Die Untersuchungen von ABELE et al.
(2012) konnten hinsichtlich der Teilungs- und Entwicklungsraten und der Embryonenmorphologie
keinen Unterschied zwischen bei 20 % O 2 gereiften und bei 5 % O 2 gereiften KOK feststellen.
Allerdings ist die Sauerstoffkonzentration wohl durchaus im Zusammenhang mit der
Glukoseverfügbarkeit zu untersuchen. HASHIMOTO et al. (2000) konnten bei sinkendem O 2
und gleichzeitig steigender Glukosekonzentration erhöhte Entwicklungsraten beobachten.
Die Komposition des IVM-Mediums kann die Entwicklungskompetenz boviner Oozyten ebenfalls
beeinflussen. So verändert der Gehalt an Serum (KORHONEN et al. 2010), Wachstumsfaktoren
(IZADYAR et al. 1998) oder Leptin (PAULA-LOPES et al. 2007) im Reifungsmedium die
Ergebnisse hinsichtlich der Teilungs- und Entwicklungsraten. In den letzten Jahren wurden verschiedene
Stoffe hinsichtlich ihres Einflusses auf die IVM geprüft. Die Tabelle 2.2 gibt eine
Übersicht der untersuchten Zusätze und deren Effekt.
18

2.12 Einfluss der Steroidsupplementation während der IVM
Tabelle 2.2: Effekte verschiedener Zusätze zum IVM-Medium auf die Entwicklungsraten
in der IVP boviner Embryonen
Autor Substrat Effekt
LONERGAN et al. (1994) Follikelflüssigkeit (FF) keiner
ALI et al. (2004) FF kompetenter Follikel positiv
TAKAGI et al. (1998) FF aus Zysten positiv
KONISHI et al. (1996) Granulosazellen positiv
IZADYAR et al. (1998) FSH, Wachstumshormone positiv
FUKUI (1989) FSH, LH, Estradiol (E2) keiner
BOEDIONO et al. (1994) LH keiner
LU et al. (1987), ECS positiv
XU et al. (1988)
HARPER und BRACKETT (1993) EGF positiv
LONERGAN et al. (1996)
SALHAB et al. (2011)
MAILLARD et al. (2010) Adiponectin keiner
PAULA-LOPES et al. (2007) Leptin positiv
ARIAS-ALVAREZ et al. (2011) Leptin negativ bei 100 ng/ml
CORDOVA et al. (2011) Leptin keiner
ADONA et al. (2011) Leptin keiner
Cysteamin
keiner
BDNF
keiner
DE WIT und KRUIP (2001) Harnstoff negativ
JORRITSMA et al. (2004) ungesättigte FS negativ
VAN HOECK et al. (2011)
KORHONEN et al. (2010) FS-freie IVM negativ
KORHONEN et al. (2010) Protein- und Hormon-freie IVM negativ
KORHONEN et al. (2010) Serum-freie IVM negativ
WARZYCH et al. (2007) Polyvinylpyrrolidon (PVP40) negativ
BOEDIONO et al. (1994) Glukose, FS, Cholesterol niedriger Gehalt positiv
2.12 Einfluss der Steroidsupplementation während der IVM
Aufgrund ihrer ständigen Präsenz im Organismus während des Sexualzyklus sowie der sich
verändernden Konzentrationen in der Follikelflüssigkeit, rückten auch die Sexualsteroide Progesteron
(P4), Testosteron (T) und Estradiol (E2) in den Fokus der Forschung. Die Erkenntnisse
an verschiedenen Spezies liefern dabei wertvolle Hinweise auf deren Wirkungen, sind aber offenbar
in Abhängigkeit von der Spezies sehr unterschiedlich.
Bei Amphibien konnte mit Hilfe von markiertem Progesteron eine die meiotische Reifung
auslösende Steroid-Eizell-Interaktion nachgewiesen werden (BANDYOPADHYAY et al. 1998).
MOOR et al. (1980) stellten in ihren Studien an Schafoozyten fest, dass Änderungen im follikulären
Steroidprofil während der Reifung zu Abnormalitäten führen, die sich besonders auf die
IVF auswirken. Ein Zusatz von Steroiden zum Reifungsmedium von Schweinen ist offenbar
nicht erforderlich, da laut DODE und GRAVES (2002) die essentiellen Steroide durch die KOK
19

2 Literatur
selbst sezerniert werden. Bei Zusatz von 100 µM Progesteron zum Reifungsmedium von Kaninchenoozyten
findet eine reversible Blockade wesentlicher Reifeschritte statt, 10 µM scheinen
dagegen keinen Effekt zu haben (SMITH et al. 1978).
Beim Rind konnten bisher jedoch noch keine eindeutigen Aussagen über Beziehungen zwischen
den Teilungs- und Entwicklungsraten oder der Embryonenqualität und der Präsenz dieser
Hormone bzw. deren Konzentrationen im Reifungsmedium gemacht werden. Der Nachweis
von Progesteronrezeptoren (PGR) an bovinen KOK gibt jedoch Hinweise auf eine Beteiligung
von P4 bei Reifungsprozessen und der Erlangung der Entwicklungskompetenz (APARICIO et al.
2011). Eine Übersicht der Arbeitsgruppen, die den Einfluss verschiedener Steroide während der
IVM von Rinder-KOK untersucht haben sowie deren Ergebnisse findet sich in Tabelle 2.3.
Tabelle 2.3: Effekte verschiedener Steroidsupplementationen im IVM-Medium für
Rinder-KOK
Autor Hormon Konzentration Effekt
(µmol/l)
FUKUI et al. (1982) P4 3,2 keiner
E2 3,2 positiv
RYAN et al. (1999) P4 0,32-3,2 positiv mit Gonadotropinen
E2 0,32-3,2 negativ
SIROTKIN (1992) P4 0,16/0,8/3,2/16 positiv
E2 0,016/0,16/0,32/1,6/3,2/16 stimuliert Reinitiation
T 0,032/0,32/3,2/16 keiner
SILVA und KNIGHT (2000) P4 0,3 negativ
T 0,1 keiner
MINGOTI et al. (2002) P4 3,2/8/16/32 erhöht E2-Gehalt
T 3,2/8/16/32 erhöht E2-Gehalt
E2 3,2/8/16/32 erhöht P4-Gehalt
Einige Autoren (SILVA und KNIGHT 2000) orientieren sich dabei an physiologisch in der
Follikelflüssigkeit vorkommenden Konzentrationen. In Bezug auf den Steroidgehalt der Follikelflüssigkeit
sind je nach Zeitpunkt der Entnahme im Zyklus (KRUIP und DIELEMAN 1985,
WISE 1987, EISSA 1996), aber auch abhängig von der Größe der Follikel (KRUIP und DIELE-
MAN 1985, WISE 1987, DE LOS REYES et al. 2006, MONNIAUX et al. 2008) sehr unterschiedliche
Werte gemessen worden. Der Entwicklungsstand des einzelnen Follikels (wachsend, statisch,
Atresiegrad, Dominanz) führt ebenfalls zu unterschiedlichen Steroidnachweisen (KRUIP
und DIELEMAN 1985, MARTIN et al. 1991, TAKAGI et al. 1993, PRICE et al. 1995). FORTUNE
und HANSEL (1985) untersuchten sogar lediglich die Follikelflüssigkeit von präovulatorischen
Follikeln im Zeitraum vom Proöstrus bis 24 h nach dem Östrus. DIELEMAN et al. (1983) teilten
die Zeit vom Beginn des Östrus bis zur Ovulation anhand des LH-Peaks ein. Sie fanden
dabei heraus, dass die Zeit vor dem LH-Peak durch hohe E2-Konzentrationen (6,05 µmol/l)
gekennzeichnet ist und P4 erst nach dem LH-Peak ansteigt (P4 vor LH-Peak 0,39 µmol/l, nach
LH-Peak 0,73 µmol/l). Alle untersuchten Steroidhormone (E2, P4, T) verringern sich im Zeitraum
6-12 h nach dem LH-Peak. Für E2 und T hält dies bis zur Ovulation an. Für P4 konnte
allerdings ein massiver Anstieg in der Zeit 20 h nach LH-Peak (0,39 µmol/l) bis zur Ovulation
20

2.13 MessengerRNA-Expression entwicklungsrelevanter Gene in bovinen Oozyten und
Embryonen
(1,51 µmol/l) gemessen werden. Geht man davon aus, dass physiologischerweise die Eizelle in
der Zeit des Östrus bis zur Ovulation ihre zweite Reifeteilung vollzieht, so ist dieser Vorgang
offensichtlich in ein Milieu mit wechselnden Steroidkonzentrationen eingebettet.
In Bezug auf die Kultur der fertilisierten Oozyten gibt es ebenfalls Hinweise auf Beeinflussungen
der präimplantatorischen Embryonalentwicklung durch Steroide, insbesondere P4
(REGGIO et al. 1997, GOFF und SMITH 1998, SHIMADA und TERADA 2002, FERGUSON et al.
2004, MERLO et al. 2006). Auch diesbezüglich sind die Ergebnisse allerdings nicht einheitlich
und werden kontrovers diskutiert.
2.13 MessengerRNA-Expression entwicklungsrelevanter Gene in
bovinen Oozyten und Embryonen
Der Begriff Transkription bezeichnet die durch verschiedene regulierende Mechanismen gesteuerte
Synthese von RNA nach Vorlage der DNA. So entstehende mRNA dient als Matrize
für die Proteinsynthese. Die jeweilige mRNA wird abhängig vom Wachstum und dem zeitlichen
Entwicklungsverlauf in speziesspezifischen Mustern exprimiert (NIEMANN und WRENZYCKI
2000).
Die präimplantatorische Embryonalentwicklung beruht auf der korrekten Umsetzung des genetischen
Programms der Eizelle bzw. des Embryos in Form einer gut abgestimmten Expression
maternaler bzw. maternaler und embryonaler Gene (KIDDER 1992) in einem geeigneten Umfeld.
Der Embryo durchläuft während dieser frühen Entwicklungsphase die ersten Teilungen,
die (Haupt-)Aktivierung des embryonalen Genoms im 8- bis 16-Zell-Stadium, die Kompaktierung
zur Morula sowie die Ausbildung der Blastozyste und die damit verbundene erste Differenzierung
der embryonalen Zellen in die ICM und das Trophektoderm (TE). Es ist bekannt, dass
sich die Expression entwicklungsrelevanter Gentranskripte bei in vivo und in vitro generierten
Embryonen deutlich unterscheidet (WRENZYCKI et al. 1998, KEPKOVA et al. 2011, PLOUR-
DE et al. 2012). Die Veränderungen in den Genexpressionsmustern können sich als Hoch- oder
Herunterregulierung, De novo-Induktion oder Stillegung von Genen äußern (WRENZYCKI et al.
2005b). Dies kann eine verringerte Qualität der Embryonen bedingen, die sogar die Überlebensfähigkeit
der Nachkommen nach einem Transfer beeinflussen könnte (WRENZYCKI et al. 2007)
und zu abnormalen Entwicklungen, wie sie zum Beispiel unter dem Begriff des zuvor bereits
erwähnten LOS zusammengefasst werden, führen (WRENZYCKI et al. 2005b). Dementsprechend
können die den Veränderungen unterliegenden Transkripte als Marker für die Qualität
und Entwicklungskompetenz angesehen werden (LEQUARRE et al. 1997, WRENZYCKI et al.
1999, 2001, NEMCOVA et al. 2006).
In der IVP können die einzelnen Schritte der präimplantatorischen Embryonalentwicklung
durch die Maturations- und Kulturbedingungen über eine veränderte Expression wichtiger Gentranskripte
wesentlich beeinflusst werden (WRENZYCKI et al. 1999, NIEMANN und WRENZY-
CKI 2000, LONERGAN et al. 2001, WRENZYCKI et al. 2001, NIEMANN et al. 2002, WREN-
ZYCKI et al. 2004, SAGIRKAYA et al. 2006, DRIVER et al. 2012, GAD et al. 2012). Dabei wird
die Reichhaltigkeit an bestimmten Gentranskripten nicht nur durch das Basismedium, sondern
auch durch Proteinsupplementation (WRENZYCKI et al. 1999, 2001, SAGIRKAYA et al. 2006,
WRENZYCKI et al. 2007) oder Makromoleküle (WARZYCH et al. 2007) beeinflusst. Insbeson-
21

2 Literatur
dere die Präsenz exogener Proteine scheint einen stadienabhängigen Einfluss auf den Zeitpunkt
und die Schwere der Veränderungen in den Genexpressionsmustern zu haben (WRENZYCKI
et al. 1999).
Bisher gibt es nur lückenhafte Erkenntnisse über den Effekt der Reifungsumgebung auf die
Genexpression. Dabei sind die während der Reifung ablaufenden Schritte der Polyadenylation
der RNA, der Spindelformation sowie Anordnung und Trennung der Chromosomen besonders
störanfällig (FAIR 2010). Längere Zeit wurde davon ausgegangen, dass während der Reifungsphase
kaum aktive Translation stattfindet (FAIR et al. 1995), sondern vielmehr ein während der
Wachstumsphase angelegter Vorrat an Transkripten die Entwicklung bis zur Aktivierung des
embryonalen Genoms vorantreibt. MAMO et al. (2011) entdeckten in einer Studie, dass der angelegte
Vorrat an Transkripten während der Reifung zwar schrumpfte, gleichzeitig aber eine
Überexpression bestimmter Gene stattfand, die das Vorhandensein von Transkription vermuten
lässt, welche offenbar den schwindenden Vorrat ergänzt bzw. aufstockt. Dies lässt Spekulationen
über Einflüsse der Reifungsumgebung auf die Genexpression zu, wie sie auch schon durch
andere Autoren vermutet wurden (WRENZYCKI et al. 1999, WATSON et al. 2000, LONERGAN
et al. 2003a,b, HUMBLOT et al. 2005, WARZYCH et al. 2007). KUES et al. (2008) und KATZ-
JAFFE et al. (2009) wiesen einen Unterschied in den Genexpressionsmustern zwischen in vivo
und in vitro gereiften Oozyten im Meiose-II-Stadium nach. In den Studien von HANSTEDT
(2009) zeigten Oozyten, die mittels der OPU-Technik in einem Intervall von 7 Tagen gewonnen
wurden, eine Herrunterregulation von 4 qualitätsanzeigenden Genen gegenüber Eizellen, die im
3- bis 4-Tages-Intervall gewonnen wurden. WATSON et al. (2000) zeigten eine Beeinflussung
der mRNA-Mengen durch die Komposition des IVM-Mediums. Supplementation des Reifungsmediums
mit Serum (WRENZYCKI et al. 1999, CALDER et al. 2001, 2005, SAGIRKAYA et al.
2007, WARZYCH et al. 2007), Makromolekülen [PVA; WRENZYCKI et al. (1999)] oder Leptin
(PAULA-LOPES et al. 2007) wirkt sich ebenfalls deutlich auf die Transkription aus. Eine detaillierte
Darstellung der einzelnen Supplemente sowie der beeinflussten Transkripte findet sich in
dem Übersichtsartikel von WRENZYCKI et al. (2007).
Im Folgenden sollen einige entwicklungsrelevante Gene, die sich als von äußeren Faktoren
beeinflusst gezeigt haben [eine Übersicht der Veröffentlichungen findet sich bei WRENZYCKI
et al. (2007)], näher beschrieben werden. Sie gelten als Markergene zur Einschätzung der Eizellbzw.
Embryonenqualität bezüglich ihrer Herkunft bzw. der angewandten biotechnischen Verfahren.
Davon sind Growth and Differentiation Factor 9 (GDF9) und Bone Morphogenetic Protein
15 (BMP15) an der Follikulogenese beteiligt, Hypoxia Inducible Faktor 2-α (HIF2α) an
der Stressprotektion und der Glukosetransporter 1 (SLC2A1) am Energiestoffwechsel.
2.13.1 Growth and Differentiation Factor 9 (GDF9)
Beim Growth and Differentiation Factor 9 (GDF9) handelt es sich um ein Polypeptid der Transforming
Growth Factor (TGF)-β-Superfamilie. Von anderen Mitgliedern dieser Familie unterscheidet
es sich durch Unterschiede im COOH-Terminus und durch das Fehlen des vierten und
siebten der sieben Cysteine im Bereich des COOH-Endes (MCPHERRON und LEE 1993). Die
Sequenz für GDF9 wurde zuerst bei der Maus entdeckt (MCPHERRON und LEE 1993). Ein
Knockout dieses Gens führt bei weiblichen Mäusen zu kompletter Infertilität, da die Follikel-
22

2.13 MessengerRNA-Expression entwicklungsrelevanter Gene in bovinen Oozyten und
Embryonen
entwicklung nur bis zum Primärfollikel stattfindet (DONG et al. 1996). Auch eine Follikelatresie
findet bei solchen Mäusen nicht statt. Dies lässt vermuten, dass der Block der Follikelentwicklung
vor der Erlangung der Atresie-Fähigkeit stattfindet (DONG et al. 1996). Bei Rindern
führte die Immunisierung gegen GDF9 zu einer veränderten Follikelentwicklung bezüglich Anzahl
und Größe der Follikel und teils erhöhten, teils verringerten Ovulationsraten (JUENGEL
et al. 2009). Über die Regulation von Schlüsselfunktionen der Granulosazellen ist GDF9 an der
Proliferation selbiger beteiligt (SPICER et al. 2006). Weiterhin ist es mitverantwortlich für die
Kumuluszell-Expansion und die Erhaltung des die Eizelle umgebenden Mikromilieus (ELVIN
et al. 1999). Bisher wurde vermutet, dass GDF9 ausschliesslich von Eizellen sezerniert wird
(ERICKSON und SHIMASAKI 2000). Neuere Untersuchungen von HOSOE et al. (2011) konnten
die Expression von GDF9 jedoch auch in Kumuluszellen nachweisen. Die mRNA von GDF9
ist ab dem Primordialfollikel (BODENSTEINER et al. 1996) über die Reifung und Fertilisation
bis zum 5- bis 8-Zell-Stadium nachweisbar (SENDAI et al. 2001, PENNETIER et al. 2004). In
Studien von SOMFAI et al. (2011) verringerte sich der Gehalt von GDF9 in der Oozyte während
der IVM unabhängig von der Medienkomposition. Eizellen aus Follikeln mit einer Größe
von ≥5 mm enthalten deutlich mehr Transkripte von GDF9 als solche aus Follikeln ≤2 mm
(DONNISON und PFEFFER 2004). Bei der Eizellgewinnung mit dem OPU-Verfahren hat sich
gezeigt, dass bei einer Punktion im 7-Tages-Intervall die Transkriptmenge von GDF9 in den
Oozyten signifikant geringer ist als beim 3- bis 4-Tages-Intervall (HANSTEDT 2009). Neuere
Untersuchungen von CHU et al. (2012) zeigten eine höhere GDF9-Expression in 2-6 h vor dem
LH-Peak gewonnenen Oozyten gegenüber 22 h nach dem LH-Peak. Beim Vergleich in vivo gereifter
Eizellen mit in vitro gereiften ist eine deutliche Herunterregulierung des Gens festzustellen
(LONERGAN et al. 2003a). HUSSEIN et al. (2006) zeigten, dass ein Zusatz von GDF9 zum
In vitro-Reifungsmedium die Blastozystenrate tendenziell, in Kombination mit BMP15 signifikant
erhöht. Eine Antagonisierung von GDF9 und/oder BMP15 senkte die Blastozystenrate in
selbiger Studie deutlich herab. HOSOE et al. (2011) fanden heraus, dass in Ovarien von Kälbern
wesentlich weniger GDF9-Transkripte vorhanden sind als in Eierstöcken adulter Tiere. Diese
Autoren sehen hier einen möglichen Grund für die geringere Entwicklungskompetenz von Oozyten
aus Kälberovarien. Auch GENDELMAN et al. (2010) stellen eine Verbindung zwischen
Entwicklungskompetenz und GDF9-Expression her. Diese Arbeitsgruppe stellte eine saisonal
unterschiedliche Transkriptmenge in Zweizellembryonen fest und sehen hier den Grund für die
geringere Entwicklungskompetenz von Eizellen, die in der heißen Jahreszeit gewonnen werden.
2.13.2 Bone Morphogenetic Protein 15 (BMP15)
Auch das Protein BMP15 gehört zur TGF-β-Superfamilie. Es unterscheidet sich von anderen
Familienmitgliedern durch das Fehlen des vierten der sieben Cysteine in der COOH-terminalen
Region, welches die kovalente Bindung von Dimeren bedingt (DUBE et al. 1998). Das Gen,
auf dem BMP 15 kodiert, ist hochkonserviert und befindet sich auf dem X-Chromosom (DUBE
et al. 1998). Bei Mäusen wird BMP15 nur in Oozyten beginnend im Primärfollikel bis über die
Ovulation hinaus exprimiert (DUBE et al. 1998). Beim Rind konnten Transkripte für BMP15
von der Oozyte bis ins Blastozystenstadium hinein nachgewiesen werden (EL-SAYED et al.
2006). Dies deutet auf eine sowohl maternale als auch embryonale Expression hin. Neuere
23

2 Literatur
Untersuchungen konnten auch die mRNA-Expression des Gens in Kumuluszellen darstellen
(HOSOE et al. 2011).
Versuche mit BMP15-Knockout-Mäusen ergaben eine Subfertilität bei weiblichen Mäusen,
wohingegen die Fertilität männlicher Mäuse nicht beeinträchtigt schien. An den weiblichen
Tieren konnten minimale histopathologische Defekte an den Ovarien, weniger Ovulationen und
geringere Fertilisationsraten beobachtet werden (YAN et al. 2001). Eine zusätzliche partielle
Ausschaltung des GDF9-Gens bewirkte weitere Veränderungen in Form von geschwächten
Oozyten-Kumuluszell-Bindungen und einem Verbleiben der Eizelle im Follikel nach der Ovulation.
Eine zusätzliche völlige Ausschaltung von GDF9 führte zu vermehrter ein- bzw. beidseitiger
Zystenbildung (YAN et al. 2001).
Eine kurzzeitige Immunisierung gegen BMP15 und GDF9 bewirkt bei Schafen eine erhöhte
Ovulationsrate, die scheinbar ohne negative Effekte auf die Fertilisation, die embryonale
und fetale Entwicklung oder die Trächtigkeitserhaltung vonstatten geht (JUENGEL et al. 2004).
Auch gibt es bei Schafen natürliche Mutationen des BMP15-Gens, welche sich dosisabhängig
in erhöhten Ovulationsraten oder infertilen Phänotypen zeigen (GALLOWAY et al. 2000).
In der IVM bewirkt der Zusatz von BMP15 eine geringere Kumuluszellapoptose (HUSSEIN
et al. 2006). Dies führte zu der Hypothese, dass BMP15 in vivo eventuell als antiatretischer Faktor
auf die Follikel wirkt. Weiterhin verbessert der Zusatz von BMP15 die Entwicklungsraten
zur Blastozyste, wohingegen ein Antagonist während der Reifungsphase die spätere Blastozystenformation
hemmt (HUSSEIN et al. 2006). HOSOE et al. (2011) wiesen einen geringeren
Gehalt an BMP15-Transkripten in weniger entwicklungskompetenten Oozyten aus Kälbern gegenüber
kompetenten Oozyten aus adulten Tieren nach. Dies lässt einen Zusammenhang zwischen
der BMP15-Expression und der Entwicklungskompetenz boviner Eizellen vermuten. Andere
Autoren (HANSTEDT 2009) konnten zeigen, dass BMP15 in im 7-Tages-Intervall per OPU
gewonnenen Eizellen gegenüber der Gewinung im 3- bis 4-Tages-Intervall herunter reguliert
ist.
2.13.3 Glukosetransporter 1 (SLC2A1)
Der Glukosetransporter 1 wurde erstmals durch MUECKLER et al. (1985) beschrieben und gehört
zur Familie der Solute Carrier (SLC). Beim Rind sind 13 verschiedenen Isoformen bekannt,
die sich alle durch ihre kinetischen Charakteristika, ihre gewebespezifische Verteilung
sowie ihre Empfindlichkeit gegenüber hormonellen und anderen Stimuli unterscheiden (JOOST
et al. 2002). Es handelt sich um Na + -unabhängige Membranproteine mit einer transmembranalen
Helix, einer intrazellulären Schleife, einem extrazellulären Element sowie einem intrazellulären
C- und N-Terminus (MUECKLER et al. 1985). Die Glukosetransporter transportieren
Glukose entlang eines Konzentrationsgradienten und regulieren den Transport zwischen intraund
extrazellulärer Matrix (OLSON und PESSIN 1996), wobei die Glukoseaufnahme durch eine
wachstumsfaktorabhängige Rekrutierung der intrazellulären SLC2A1-Moleküle reguliert wird.
Der SLC2A1 wird hauptsächlich an basolateralen Membranen wie an Blutgefäßen oder der
Blut-Hirn-Schranke exprimiert (OLSON und PESSIN 1996), konnte jedoch auch in unreifen Oozyten
und allen Embryonalstadien nachgewiesen werden (WRENZYCKI et al. 1998, AUGUSTIN
24

2.13 MessengerRNA-Expression entwicklungsrelevanter Gene in bovinen Oozyten und
Embryonen
et al. 2001). In der Entwicklung von der Oozyte zur Blastozyste wurde eine Abnahme der
Expression während Reifung und Fertilisation und eine konstante Expression während des 2-
bis 8-Zellstadiums (LEQUARRE et al. 1997) beobachtet. Dem entsprechend zeigten verschiedene
Studien der Stoffwechselaktivität während der frühen Embryonalentwicklung einen ersten
Anstieg des Glucosemetabolismus im 8- bis 16-Zellstadium sowie einen weiteren Anstieg
im Morulastadium bzw. bei der Blastulation (JAVED und WRIGHT 1991, RIEGER et al. 1992,
KHURANA und NIEMANN 2000b). Dies deutet auf einen erhöhten Glukoseumsatz zum Zeitpunkt
der Aktivierung des embryonalen Genoms und der Kompaktierung hin. Weiterhin wurde
herausgefunden, dass die Expression des SLC2A1 sich je nach verfügbarer Glukosemenge verändert
und bei Glukosemangel steigt (GARDNER und KAYE 1995).
LOPES et al. (2007) konnten einen Zusammenhang zwischen der SLC2A1-Expression und
der Embryonenqualität in der Weise herstellen, dass eine hohe Transkriptmenge für eine gute
Qualität spricht. In Versuchen von KNIJN et al. (2005) zeigten Embryonen aus in vitro gereiften
Oozyten eine deutlich geringere SLC2A1-Expression als nach in vivo-Reifung. Auch andere
Arbeitsgruppen konnten eine geringere Transkriptmenge von SLC2A1 in In vitro-produzierten
Embryonen gegenüber In vivo-Embryonen feststellen (WRENZYCKI et al. 1999, LAZZARI et al.
2002, BALASUBRAMANIAN et al. 2007, RHO et al. 2007). Demgegenüber fanden PURPERA
et al. (2009) eine höhere Transkriptmenge in in vitro produzierten Blastozysten als in in vivo
produzierten. JIANG et al. (2011) konnten in in vitro produzierten, auf ein Empfängertier
übertragenen Feten am 180. Trächtigkeitstag eine deutliche Herunterregulierung gegenüber in
vivo erzeugten Feten nachweisen. Auch die Medienkomposition hat Einfluss auf die Transkriptmenge.
So konnten SAGIRKAYA et al. (2007) zeigen, dass ein Zusatz von fetalem Kälberserum
(Fetal Calf Serum, FCS) im IVM-Medium zu einer höheren Genexpression bezüglich SLC2A1
führt als synthetischer Serumersatz (Synthetic Serum Substitue, SSS). Der Zusatz von ungesättigten
Fettsäuren (Non-Esterified Fatty Acids, NEFAs) während der IVM zeigte denselben
Effekt (VAN HOECK et al. 2011). Bei der Supplementation des IVC-Mediums konnte beim
Zusatz von Serum eine höhere Menge von SLC2A1 im Vergleich zu PVA detektiert werden
(WRENZYCKI et al. 1999), eine Supplementation mit IGF-1 zeigte hingegen keine veränderte
Expression von SLC2A1 (BLOCK et al. 2008).
2.13.4 Hypoxia Inducible Factor 2α (HIF2α)
Bei den Hypoxia Inducible Transkriptionsfaktoren (HIF) handelt es sich um heterodimere DNA-
Bindungskomplexe (HARVEY et al. 2004), die aus zwei Komponenten (HIFα und HIFβ) bestehen.
Die Stabilität der HIFα-Untereinheit ist dabei abhängig vom Sauerstoffgehalt, Zytokinen
und anderen Stimuli (WANG et al. 1995, SEMENZA 2001). Die HIFα-Untereinheit kommt in
drei Formen [HIF1α (WANG et al. 1995), HIF2α (EMA et al. 1997, FLAMME et al. 1997,
HOGENESCH et al. 1997, TIAN et al. 1997) und HIF3α (GU et al. 1998)] vor, wovon HIF1α
erstmals durch WANG et al. (1995) am 3´Hypoxyresponsive-Element im Erythropoetin-Gen
entdeckt wurde. HIF1α und HIF2α ähneln sich in ihrer Struktur. Sie besitzen eine Helix-Loop-
Helix-Domäne und ein Prolin-aktives Ende am N-Terminus sowie zwei transkriptaktivierende
und eine inhibitorische Domäne am C-Terminus.
25

2 Literatur
HIF regulieren adaptative Antworten auf Sauerstoffveränderungen und modulieren die Expression
verschiedener Gene (SEMENZA 1998) für Angiogenese, Energiestoffwechsel, Zellproliferation
und Vaskularisation (COVELLO et al. 2005, HARVEY et al. 2007). Sie konnten in
alveolärem Lungenepithel, Gehirn, Herz, Leber und Niere nachgewiesen werden (EMA et al.
1997, FLAMME et al. 1997).
In in vitro produzierten Blastozysten konnte die mRNA sowohl von HIF1α als auch HIF2α
nachgewiesen werden, als Protein jedoch nur HIF2α (HARVEY et al. 2004). HIF2α lokalisiert
hauptsächlich in den Nuclei der ICM und dem TE (HARVEY et al. 2004).
Eine veränderte Expression HIF-regulierter Gene (SLC2A1) wurde in in vitro produzierten
Blastozysten festgestellt (WRENZYCKI et al. 1998, 2001). Auch HARVEY et al. (2007) beschrieben
eine höchstwahrscheinlich durch HIF2 regulierte Veränderung der Genexpression in
Blastozysten. Für die Expression von SLC2A1 ist die Regulation durch HIF belegt (HARVEY
et al. 2004). Die Expression von HIF2α selbst ist redox-reguliert (HARVEY et al. 2004)
2.14 MessengerRNA-Expression von Progesteronstoffwechsel-relevanten
Genen in Oozyten und Embryonen
Im Folgenden sollen einige für die Wirkung von Progesteron relevante Gentranskripte näher
beschrieben werden. Der Fokus liegt dabei auf den Progesteronrezeptoren (nPGR, PGRMC1,
PGRMC2) sowie dem Progestin und AdipoQ Rezeptor 5 (PAQR5).
2.14.1 Progesteronrezeptoren
Bei den Progesteronrezeptoren unterscheidet man die nuklearen Rezeptoren (nPGR) und die
membranständigen Rezeptoren (mPGR). Es gibt drei Isoformen des nuklearen Rezeptors (A, B,
C), die alle einen N-Terminus, eine DNA-Bindungsdomäne sowie eine C-Anschluss-Liganden-
Bindungsdomäne besitzen.
Der nPGR ist in Milchdrüse (KARIAGINA et al. 2007), Ovidukt (GAVA et al. 2004) und Ovar
(GAVA et al. 2004, D’HAESELEER et al. 2007) verschiedener Spezies belegt. Seine Expression
im Ovar ist zellspezifisch und hormonell reguliert (PARK und MAYO 1991, NATRAJ und
RICHARDS 1993, APARICIO et al. 2011). Dieser Rezeptor findet sich sowohl im C.l. (DUFFY
et al. 1997, RUEDA et al. 2000) als auch in Granulosazellen (SHAO et al. 2006), im periovulatorischen
Follikel (CASSAR et al. 2002) und Oozyten von Schwein (SHIMADA et al. 2004) und
Rind (D’HAESELEER et al. 2007). PÖSCHKE und KÖLLE (2009) wiesen den Rezeptor per immunzytochemischem
Nachweis in unreifen, reifen und fertilisierten bovinen KOK nach. Auch
APARICIO et al. (2011) konnten das Vorhandensein des nPGR in KOK bestätigen. Während der
IVM beobachteten SALHAB et al. (2011) nach 10stündiger Reifung eine Überexpression des
nuklearen Progesteronrezeptors in den bovinen Kumuluszellen. Daraus kann auf eine eventuelle
Beteiligung an der Regulation des Übergangs von der Metaphase I (MI) in die Metaphase
II (MII) geschlossen werden. LUCIANO et al. (2010) hingegen halten die nPGR´s für die meiotische
Teilung und Mitose für unbedeutend und schreiben dem Rezeptor eine wichtige Rolle
bei der Blastulation zu. Aus der Studie von APARICIO et al. (2011) lässt sich schliessen, dass
26

2.14 MessengerRNA-Expression von Progesteronstoffwechsel-relevanten Genen in Oozyten
und Embryonen
die Wirkung von P4 während der IVM hauptsächlich durch die Rezeptorisoformen A und B
vermittelt wird. Ausserdem konnten diese Autoren eine veränderte Rezeptorexpression bei der
Supplementation von LH, FSH und P4 feststellen.
Die Transkription in Embryonen von Mäusen (HOU und GORSKI 1993), Schweinen (YING
et al. 2000), Pferden (RAMBAGS et al. 2008) und Rindern (CLEMENTE et al. 2009) ist ebenfalls
belegt. CLEMENTE et al. (2009) fanden heraus, dass der Rezeptor in allen Embryonalstadien
ausser dem Morulastadium exprimiert wird und die Transkriptmenge in der Oozyte am höchsten,
im 2- bis 4-Zellstadium und im 16-Zellstadium am geringsten ist.
Bei den membranständigen Progesteronrezeptoren gibt es die Isoformen PGRMC1 und 2. Sie
haben eine Größe von 28 kDA (FALKENSTEIN et al. 2001) und können Polymere von 140 kDa
und größer bilden (LÖSEL et al. 2005). Sie zeichnen sich durch eine kurze extrazelluläre Domäne
am N-Terminus, einzelne Transmembrandomänen und ein zytoplasmatisches Ende aus (LÖ-
SEL et al. 2005). Membranständige PGR sind in der Leber (FALKENSTEIN et al. 1996, MEYER
et al. 1996, SELMIN et al. 1996, NOLTE et al. 2000), im Hypothalamus (KREBS et al. 2000)
und im Linsenepithel (CENEDELLA et al. 1999, ZHU et al. 2001) vorhanden. Ausserdem konnte
das Vorkommen des Rezeptors im C.l. (BRAMLEY 2003, KOWALIK und KOTWICA 2008)
und in Granulosazellen (PARK und MAYO 1991, NATRAJ und RICHARDS 1993, SHAO et al.
2003) bestätigt werden. Dabei scheint die Expression im bovinen C.l. nicht nur während der
Lutealphase zu variieren, sondern auch signifikant mit der Menge des gebildeten P4 zu korrelieren
(KOWALIK und KOTWICA 2008). Auch LUCIANO et al. (2010) stellten eine Variation des
PGRMC1-Vorkommens fest. Immunhistochemische Studien dieser Arbeitsgruppe zeigten zyklusabhängig
unterschiedliche Lokalisationen im C.l.. NILSSON und SKINNER (2009) gelang
der Nachweis im fetalen Ovar, APARICIO et al. (2011) belegten sein Vorkommen in bovinen
KOK.
Auch die Untersuchungen von LUCIANO et al. (2010) weisen auf eine Rolle des PGRMC1
in der Oozytenmaturation hin. Diese Autoren konnten eine unterschiedliche Lokalisation des
Rezeptors während verschiedener Reifungsstadien beobachten und vermuten eine Beteiligung
an der Trennung der Chromosomen. Im bovinen Embryo werden beide Isoformen des mPR
exprimiert (DODE et al. 2006). Dabei ist die Transkriptmenge in unreifen Oozyten offenbar
am höchsten und im 2- bis 4-Zellstadium sowie im 16-Zellembryo am niedrigsten (CLEMENTE
et al. 2009).
Studien verschiedener Forschergruppen (LUCIANO und PELUSO 1995, PELUSO et al. 2001,
CRUDDEN et al. 2006) zeigten eine antiapoptotische und antimitotische Wirkung des PGRMC1
auf Granulosazellen. Weiterhin scheinen die Progesteronrezeptoren an der Regulation verschiedener
Gene, unter anderem HIF1α und HIF1β, beteiligt zu sein (KIM et al. 2009).
2.14.2 Progestin und AdipoQ Rezeptor 5 (PAQR5)
Bei den Progestin und AdipoQ Rezeptoren handelt es sich um eine Familie G-Protein-gekoppelter
Membranproteine mit sieben transmembranalen Domänen (ZHU et al. 2003a), die nach
den ersten beiden beschriebenen Liganden (Progestin und AdipoQ) benannt wurden (CAHILL
2007). Es handelt sich um eine hochkonservierte Proteinfamilie, deren Mitglieder sich schon
27

2 Literatur
bei Eukaryoten und Eubakterien finden (TANG et al. 2005). Bei Säugern existieren insgesamt
11 verschiedene Rezeptoren dieser Art, die sich in die Untergruppen α, β und γ einteilen lassen
(ZHU et al. 2003a). Die einzelnen Familienmitglieder sind entweder ubiquitär anzutreffen
(PAQR1, 2, 11) oder sehr organspezifisch (PAQR10). Ihre Expression unterliegt hormoneller
Regulation (ZHU et al. 2003a, CAI und STOCCO 2005). Auch PAQRs vermitteln nichtgenomische
Progesteroneffekte, sind aber weder mit den nPR noch mit den mPR verwandt
(ZHU et al. 2003b).
PAQR5 gehört zur γ-Subfamilie und konnte in Lunge und Leber (NUTU et al. 2007), Nieren,
Nervengewebe sowie weiblichen und männlichen Reproduktionsgeweben (ZHU et al. 2003a,
DRESSING et al. 2011) nachgewiesen werden. PAQR5 zeichnet sich durch eine hohe Bindungsaffinität
zu P4 mit begrenzter Kapazität und die γ-Subtyp-spezifische Progestinbindung aus
(ZHU et al. 2003a).
Es konnte eine Beteiligung des Rezeptors an der Reifung von Fisch- (ZHU et al. 2003b),
Amphibien- (THOMAS et al. 2002) und Säugeroozyten (QIU et al. 2008) nachgewiesen werden.
2.15 Ziel des Projektes
Die Rolle von Progesteron in der Eizellreifung ist nach wie vor unzureichend definiert (FAIR
und LONERGAN 2012). In dieser Arbeit soll der Einfluss des Steroidhormons Progesteron auf
die reifende Eizelle insbesondere im Hinblick auf molekulare Veränderungen untersucht werden.
Der direkte Vergleich von in vivo gereiften, durch die OPU-Methode gewonnenen Oozyten
und in vitro unter dem Einfluss verschiedener Progesteronkonzentrationen gereiften Eizellen
soll eventuelle Veränderungen in der Genexpression bezüglich qualitätsanzeigender Gentranskripte
deutlich machen. Die Analyse der Expression der Progesteronrezeptoren gibt Aufschluss
über die Rolle von Progesteron während der Reifung. Somit könnte diese Arbeit ein wertvoller
Beitrag zum besseren Verständnis der Wirkung von Progesteron auf die reifende Eizelle sein.
28

3 Material und Methoden
Die genaue Zusammensetzung der in den Versuchen eingesetzten Medien und Chemikalien ist
in Anhang A beschrieben.
3.1 Ovum Pick-Up (OPU)
Die Abbildung 3.1 zeigt die einzelnen Arbeitsschritte des OPU-Versuchsteiles. Die Gewinnung
von Kumulus-Oozyten-Komplexen (KOK) erfolgt mittels OPU ab dem siebten Tag nach der
Brunst (Brunst=Tag 0). Bei jeder OPU-Session erfolgt eine Blutprobenentnahme für die spätere
Ermittlung des Serumprogesterongehaltes. Weiterhin werden morphologische Eigenschaften
der C.l. sowie Anzahl und Größen der punktierten Follikel erfasst. Nach jeder OPU-Session
erfolgt die Entfernung der Kumuluszellen und die Konservierung der Oozyten für die spätere
RT-qPCR. Die einzelnen Arbeitsschritte sollen im Folgenden ausführlich erläutert werden.
3.1.1 Auswahl der Versuchstiere und Feststellung des Versuchsbeginns
Die Versuchstiergruppe bestand aus insgesamt drei trockenstehenden Kühen sowie sechs Färsen
der Rasse Deutsche Holstein, die alle einen physiologischen Zyklus aufwiesen. Durch routinemäßige
tägliche Brunstkontrolle erfolgte zunächst eine Bestimmung des Zyklusstandes. Ab dem
siebten Tag (±1) nach Brunst (= Tag 0) wurden die Tiere dann über einen Zeitraum von 5-6 Wochen
regelmäßig dem OPU-Verfahren unterzogen. Im erstem Durchgang mit zweimal wöchentlichen
OPU-Sitzungen bestand die Versuchsgruppe aus sechs Tieren, davon je drei Kühe und
Färsen. Aufgrund auftretender Zwischenbrunsten wurde bei zwei Tieren der Punktionsdurchlauf
an Tag 21 des Zyklus abgebrochen und nach erneuter natürlicher Brunst neu begonnen.
Ein erneuter Durchgang des OPU-Versuches mit vier Tieren des ersten Durchganges erfolgte
nach einer zweimonatigen Ruhepause. Bei zwei Tieren fand die Punktion zweimal wöchentlich
statt, bei zwei Tieren dreimal. Drei Tiere, die vor Versuchsbeginn noch keiner OPU-Sitzung
unterzogen worden waren, bildeten den dritten Versuchsdurchgang mit zweimal wöchentlichen
Punktionen.
29

3 Material und Methoden
Abbildung 3.1: Schematische Darstellung des Arbeitsablaufs der OPU-Versuche
3.1.2 Gewinnung von Kumulus-Oozyten-Komplexen im OPU-Verfahren
Das Equipment für das OPU bestand aus einem Ultraschallgerät, einem Sondenträger mit Nadelführung,
einer Vakuumpumpe mit angeschlossenem Schlauchsystem mit Auffanggefäß sowie
einem Wasserbad (Abbildung 3.2). Die ultraschallgeleitete Follikelpunktion wurde mit Hilfe
eines Ultraschallgerätes der Marke GE Logiq Book XP und einer 7,5 MHz-Konvexsonde
(Modell 8C-RS, Fa. GE, München) durchgeführt. Die Einstellungen des GE Ultraschallgerätes
finden sich im Anhang. Der Sondenträger aus PVC wurde durch die Feinmechanik-Werkstatt
des Institutes für Nutztiergenetik des Friedrich-Löffler-Institutes in Mariensee in Zusammenarbeit
mit der Klinik für Rinder der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover gebaut. Dabei
war die Ultraschallsonde in leicht geneigtem Winkel zur Nadelführung eingebettet, um den toten
Winkel der Sonde im Bereich der Punktionslinie zu minimieren. Oberhalb der Sonde befand
sich eine Führungsrinne für das Edelstahlrohr, welches die Nadelführung bildet. An dessen einem
Ende war ein einschraubbarer Adapter angebracht, an dem die Punktionsnadel sowie am
anderen Ende ein Schlauch zum Abführen des Punktates befestigt wurden.
Der ableitende Schlauch aus Polyethylen mit einem Innendurchmesser von 0,6 mm mündete
nach Durchtritt durch einen Silikonstopfen in einem 50 ml Röhrchen (Fa. Greiner Bio-One,
Frickenhausen), welches als Auffanggefäß fungierte und in einem Wasserbad mit einer Temperatur
von 39 ◦ C warm gehalten wurde. Zum Abführen des Punktates wurde mittels einer über ein
Fußpedal bedienten Pumpe (Fa. Cook, Mönchengladbach) ein Vakuum von -75 mmHg generiert
und über einen handelsüblichen PVC-Schlauch (Aussendurchmesser 8 mm, Innendurchmesser
5 mm) zugeführt. Der Durchfluss betrug durchschnittlich ca. 22 ml pro Minute. Zur Punktion
wurden handelsübliche Einmalkanülen der Firma Braun aus Melsungen der Größe 20 G x 2“
(0,9 mm x 50 mm) und einem kurzen Anschliff verwendet. Der kurze Anschliff sollte hierbei
30

3.1 Ovum Pick-Up (OPU)
Abbildung 3.2: OPU-Equipment: (1) Vakuumpumpe, (2) Ultraschallgerät, (3) Sondenträger;
Wasserbad, Schlauchsystem und Auffanggefäß nicht abgebildet;
Abbildung nach HANSTEDT (2009)
gewährleisten, dass die Öffnung der Kanüle vollständig auch in kleineren Follikeln verborgen
ist, um Druck- und Flüssigkeitsverluste beim Absaugen zu verhindern.
Zu Beginn jeder OPU-Sitzung wurde der Punktionsschlauch mehrfach intensiv mit ca. 10 ml
PBS Complete gespült, um eine Verunreinigung des Punktates mit Rückständen von Reinigungsmitteln
auszuschliessen. Ein erneutes Spülen nach dem Anbringen der Punktionsnadel
sollte gewährleisten, dass sich der kapillare Spalt zwischen Nadel und Schlauchadapter schloss.
Weitere Spülungen des Schlauchsystems erfolgten jeweils nach dem Absaugen aller Follikel
eines Ovars bzw. nach Bedarf. Nach Applikation von 4 ml des Lokalanästhetikums Procainhydrochlorid
ohne Sperrkörper (Procasel 2 % der Fa. Selectavet, Weyarn-Holzolling) in den
epiduralen Spalt zwischen dem letzten Sakral- und dem ersten Schwanzwirbel wurde die Vulva
trocken gereinigt und das Punktionsgerät vaginal eingeführt. Auf die rektale Exploration
folgte eine transrektale Positionierung des jeweiligen Ovars vor der Ultraschallsonde, um das
Ovar und seine Funktionskörper darzustellen. Die Größe der Follikel sowie Lokalisation (linkes
oder rechtes Ovar), Größe und Beschaffenheit (Homogenität, Vorhandensein eines Hohlraumes
und dessen Größe) des Gelbkörpers wurden ermittelt und protokolliert. Ein Absaugen des Inhaltes
der Follikel ab einer Größe von 3 mm folgte. Das gewonnene, im Wasserbad bei 39 ◦ C
warmgehaltene Punktat wurde zunächst mit Hilfe von warmer PBS Complete-Lösung durch ein
Analysensieb mit einer Maschenweite von 50 µm gespült. Es erfolgte eine Überführung der auf
dem Sieb verbliebenen KOKs und Zellbestandteile mittels PBS Complete in eine Petrischale
der Größe 94 x 16 mm (Fa. Greiner Bio-One, Frickenhausen) um die KOKs unter einem Stereomikroskop
(Fa. Olympus, Hamburg, Modell SZX-ILLK200) mit Wärmeplatte (Fa. Minitüb,
Modell HAT 200) in einer 20fachen Vergrößerung herauszusuchen.
31

3 Material und Methoden
Abbildung 3.3: OPU-Sondenträger mit Nadelführung sowie Vergrößerung des vorderen
Teiles; Abbildung nach HANSTEDT (2009)
Abbildung 3.4: Schematische Darstellung der Follikelpunktion;
Abbildung nach HANSTEDT (2009)
Nach erneuter Überführung der KOKs mit Hilfe einer 0,25 µl Glaspipette (Fa. Hirschmann,
Eberstadt) und eines Pipettierhelfers (Fa. Brand, Wertheim) in eine 2 ml TCM air enthaltende
Petrischale der Größe 35 x 10 mm (Fa. Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen) fand eine
Beurteilung der KOK hinsichtlich ihrer Qualität sowie eine Einteilung in 5 Kategorien (siehe
Tabelle 3.1) statt.
Tabelle 3.1: Klassifizierungsschema für bovine KOK
Klasse Mindestanzahl an Kumulus- Zytoplasma
Kumuluszelllagen beschaffenheit
1 3 Lagen keine Expansion homogen
2 1 Lage keine Expansion homogen
3 einzelne Zellen keine Expansion homo-/heterogen
4 keine Zellen keine Expansion homo-/heterogen
5 keine/einzelne Zellen expandiert homo-/heterogen
leere Zonae
deformiert
32

3.1 Ovum Pick-Up (OPU)
Abbildung 3.5: Apparatur zur Separation von KOK aus Follikelpunktaten;
Abbildung nach HANSTEDT (2009)
Abbildung 3.6: IVP-taugliche bovine Kumulus-Oozyten-Komplexe, 50fache Vergrößerung
Kumulus-Oozyten-Komplexe der Kategorien 1-3 wurden tierindividuell in auf 37 ◦ C temperierte
PBS Complete-Lösung mit Zusatz von 0,1 % Hyaluronidase (Sigma-Aldrich, H 3506) und
0,1 % Bovinem Serum Albumin (BSA-FAF, Sigma-Aldrich) gegeben und für 5 Min. inkubiert.
Darauf folgte eine mechanische Entfernung der Kumuluszellen mittels eines Strippers (The
Stripper, MXL3-STR, Mid Atlantic Diagnostics, Inc., Mount Laurel, USA) und einer Stripper-
Spitze (Stripper Tip, Mid Atlantic Diagnostics, Inc., Mount Laurel, USA) mit einem Durchlass
von 135 bzw. 125 µm. Nach dreimaligem Pipettieren durch Polyvinylalkohol (PVA 0,1 %) wurden
die denudierten Oozyten einzeln in 0,5 ml fassende, nicht-DNA-bindende Reaktionsgefäße
(Fa. Eppendorf, Hamburg) verbracht und bei -80 ◦ C eingefroren.
3.1.3 Blutentnahme und Konservierung der Blutproben
Nach jeder OPU-Sitzung wurde den Tieren je ein Serumröhrchen (Fa. Sarstedt, Sarstedt) sowie
ein EDTA-Röhrchen (Fa. Sarstedt, Sarstedt) Blut entnommen. Die Entnahme erfolgte aus der
Vena bzw. Arteria coccygea mittels einer handelsüblichen Einmalkanüle der Größe 18 G x 1,5 “.
Die Blutproben wurden innerhalb von 2 h bei 2000 x g und 4 ◦ C für 15 Min zentrifugiert
(Hettich Zentrifuge Universal 30RF, Fa. Andreas Hettich GmbH u. Co. KG, Tuttlingen). Je
33

3 Material und Methoden
1 ml Serum bzw. EDTA-Plasma wurde in 2 ml fassenden Reaktionsgefäßen (Fa. Eppendorf,
Hamburg) bei -20 ◦ C asserviert.
3.1.4 Bestimmung der Progesteronkonzentration im Blut
Die Bestimmung des Serumprogesterongehaltes erfolgte mittels Radioimmunoassay (RIA Progesteron
PITKPG-9, Fa. Siemens Healthcare Diagnostics GmbH, Eschborn). Das Prinzip des
Verfahrens beruht auf der kompetitiven Bindung des P4 in der zu analysierenden Probe und
einer mit 125 I radioaktiv markierten Variante von P4 an spezifische Antikörper, die an die Wandung
eines Reaktionsgefäßes aufgebracht waren (Festphasen-Immunoassay). Die Menge des
P4 in der Probe lässt sich anhand der Verdrängung des radioaktiven P4 mit Hilfe eines Gamma-
Counts ermitteln, wobei die Anzahl der gemessenen Counts umgekehrt proportional zur eingesetzten
Konzentration ist. Durch den Vergleich mit den eingesetzten Standards kann dann die
Progesteronkonzentration der Proben aus der Standardkurve ermittelt werden.
Zuerst wurden die asservierten Serumproben bei Raumtemperatur aufgetaut. Die Messung
erfolgte routinemäßig als Doppelbestimmung. Für die Messung wurde eine Standardreihe mit
0, 0,1, 0,5, 2, 10, 20 und 40 ng/ml Progesteron angelegt und je 100 µl der Standards sowie
100 µl der zu analysierenden Proben in Antikörper-beschichtete Röhrchen pipettiert. Nach Zugabe
von 1,0 ml des radioaktiv markierten Progesterons ( 125 I Progesteron) in jedes Röhrchen
erfolgte eine 3stündige Inkubation bei Raumtemperatur (15-28 ◦ C). Anschließend wurde die
Flüssigkeit in den Röhrchen dekantiert und die Röhrchen für eine Minute zur Messung in den
Gamma-Counter (LKB 1272 Clinigamma, Fa. Perkin-Elmer, Monza, Italien) verbracht. Anhand
der gemessenen Counts pro Minute (cpm) der Standardreihe erfolgte die Erstellung einer Standardkurve
und die Berechnung der Progesteronkonzentration der Proben anhand dieser Kurve.
Der Interassayvariationskoeffizient betrug 3,9 % und der Intraassayvariationskoeffizient 3,5 %.
Die Spezifität des Antikörpers für Progesteron wurde vom Hersteller mit 100 % angegeben. Die
vom Hersteller angegebenen Kreuzreaktivitäten des Antikörpers sind in Tabelle 3.2 aufgeführt.
34

3.2 In-vitro-Produktion boviner Embryonen
Tabelle 3.2: Kreuzreaktivität des im RIA genutzten Antikörpers
Substrat Kreuzreaktivität in %
Kortikosterone 0,9
Kortisol 0,03
Danazol 0,006
11-Deoxykortikosteron 2,2
11-Deoxycortisol 0,01
DHEA-SO 4 0,002
20alpha-Dihydroprogesteron 0,2
17alpha-Hydroxyprogesteron 3,4
Medroxyprogesteron 0,3
5beta-Pregnen-3alphaol-20-one 0,05
5alpha-Pregnan-3,20-dione 9,0
5beta-Pregnan-3,20-dione 3,2
Pregnenolon 0,1
5-Pregnen-3beta-ol-20-one-sulfat 0,05
Testosteron 0,1
3.2 In-vitro-Produktion boviner Embryonen
Der in Abbildung 3.7 dargestellte Arbeitsablauf wird im Folgenden ausführlich erläutert.
3.2.1 Herkunft der Ovarien
Einmal wöchentlich wurden Ovarien frisch geschlachteter Tiere an einem Schlachthof gesammelt,
wobei Ovarien von Tieren, deren Schlachtkörper sichtbare krankhafte Veränderungen aufwiesen,
ausschieden. Weiterhin beschränkte sich die Auswahl auf Ovarien von Tieren, die weder
trächtig noch juvenil waren und an deren Ovarien keine zystischen Veränderungen sichtbar waren.
Die Lagerung der Ovarien nach dem Abschneiden bis zur weiteren Bearbeitung erfolgte in
37 ◦ C warmem PBS Complete in einem Thermobehälter.
3.2.2 Vorbereitung und Selektion der Kumulus-Oozyten-Komplexe
Zuerst fand eine dreimalige Spülung der Ovarien mit je 350 ml Natrium-Chlorid (NaCl)-Komplett-Lösung,
die zuvor im Wasserbad auf 37 ◦ C erwärmt worden war, statt. Zur Isolation der
Oozyten aus den Ovarien fand die Slicing-Methode (NIEMANN und MEINECKE 1993) Anwendung.
Hierbei wird das mit einer Arterienklemme fixierte Ovar in eine Petrischale mit ca.
100 ml PBS Complete getaucht. Das Schneiden erfolgt dann mit einem Block bestehend aus
zehn parallel im Abstand von 3-5 mm zueinander befestigten Rasierklingen. Auf diese Weise
werden oberflächliche und tiefe Follikel eröffnet und die KOK zusammen mit der Follikelflüssigkeit
herausgespült. Anschließend giesst man die so gewonnene Flüssigkeit gemeinsam mit
35

3 Material und Methoden
KOK aus Schlachthofovarien
Selektion nach morpholog. Kriterien
IVM +/-Progesteron
RT-qPCR
IVM-Medium
gereifte KOK
Denudierung
P4-Analyse
IVF
Reifungskontrolle
IVC
Morulae/Blastozysten an Tag 7 und 8
Beurteilung der Teilungs-und Entwicklungsraten
Abbildung 3.7: Schematische Darstellung des IVP-Versuchsteils
dem bereits in der Petrischale enthaltenen PBS Complete durch ein herkömmliches Sieb in ein
Becherglas, um überschüssige Gewebestücke zu entfernen. Die Petrischale und das Sieb werden
noch zweimal mit je ca. 50 ml PBS Complete gespült, um noch eventuell in der Petrischale
vorhandene KOK zu erhalten. Dann erfolgt eine 10minütige Sedimentation der Flüssigkeit im
Becherglas. Um ein Auskühlen der Flüssigkeit zu verhindern bzw. zu verlangsamen, steht das
Becherglas auf Styropor. Nach dem Absaugen des Flüssigkeitsüberstandes bis auf ca. 100 ml
mit einer herkömmlichen Vakuumpumpe erfolgt eine gleichmäßige Verteilung des Sediments
auf Falconröhrchen (Fa. Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen) mit je 15 ml Fassungsvermögen
und eine erneute 10minütige Sedimentation auf einer Wärmeplatte mit einer Temperatur
von 37 ◦ C. Das Sediment in jedem Reagenzgefäß wird nun mittels einer Pasteurpipette abgesaugt,
in eine Petrischale überführt und auf ca. 80 ml mit PBS Complete aufgefüllt. Das
Heraussuchen der KOK aus dem verdünnten Sediment erfolgt unter einem Stereomikroskop
(Fa. Olympus, Hamburg, Deutschland) mit Wärmeplatte (Fa. Minitüb, Modell HAT 200) bei
20facher Vergrößerung.
Nach Durchsicht aller Reagenzgefäße und Überführung der KOK mit Hilfe einer 0,25 µl
fassenden Glaspipette und eines Pipettierhelfers in 2 ml TCM air erfolgte die Selektion der
KOK bezüglich ihrer Qualität. Eine Übersicht der Klassifizierungskriterien ist in Tabelle 3.1 zu
sehen. Als für die In-vitro-Produktion taugliche KOK wurden solche der Kategorien 1, 2 und 3
angesehen.
36

3.2 In-vitro-Produktion boviner Embryonen
3.2.3 In-vitro-Maturation (IVM)
Zunächst wurde eine 40 µM Progesteronstocklösung aus Progesterone minimum 99 % (Fa.
Sigma) und unvergälltem Ethanol (EtOH; Rotipuran ≥ 99,8 %, Fa. Carl Roth GmbH + Co.
KG, Karlsruhe) hergestellt und aliquotiert. Dem Reifungsmedium des jeweiligen Versuchsdurchlaufes
wurde die Progesteronlösung zugesetzt, sodass die Endkonzentrationen im Reifungsmedium,
in Anlehnung an DIELEMAN et al. (1983), 0,16 µM, 0,48 µM, 0,95 µM oder
1,4 µM betrugen. Um während der In-vitro-Reifung der Oozyten den Einfluss verschiedener
Progesteronkonzentrationen zu ermitteln, erfolgte eine Modifizierung des konventionellen Invitro-Maturationssystems
mit Ölüberschichtung. Ein Diffundieren des lipophilen Progesterons
in die Ölphase wurde verhindert, indem einzelne, mit 200 µl Reifungsmedium gefüllte Wells
einer 96-Well-Plate (Fa. Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen) ohne Ölüberschichtung Anwendung
fanden. Je zwei Wells standen in einer Petrischale. Die Petrischale enthielt ca. 10 ml
destilliertes Wasser, um Verdunstungsverluste gering zu halten. Der aufgelegte Deckel der Petrischale
diente der Vermeidung von Schmutzeinträgen in die Kultur.
Die Kontrollwells enthielten Reifungsmedium ohne jeglichen Zusatz (Normalkontrolle) sowie
Reifungsmedium mit 2 µl, 4 µl oder 8 µl unvergälltem Ethanol ≥ 99,8 % (Alkoholkontrolle).
Die Medien wurden für mindestens eine Stunde im Brutschrank (HeraCell, Fa. Heraeus,
Thermo Fisher Scientific, USA) bei 39 ◦ C und 5 % CO 2 und gesättigter Feuchtigkeit äquilibriert.
Als IVP-tauglich angesehene KOK wurden in Gruppen zu 30-40 KOK durch je eine Reihe mit
3 Tropfen aus 100 µl Reifungsmedium ohne Zusatz, die mit Siliconöl (Fa. Serva, Deutschland)
überschichtet waren (sogenannte „Waschdrops“), pipettiert (nachfolgend "waschen"genannt)
und in die Gefäße mit dem Reifungsmedium überführt. Die Maturation erfolgte für 24 h bei
39 ◦ C, 5 % CO 2 und feuchtigkeitsgesättigter Atmosphäre im Brutschrank. Der Zeitraum von
der Entnahme der Ovarien am Schlachthof bis zum Beginn der In-vitro-Reifung betrug maximal
6 h.
3.2.4 Progesteronbestimmung im Reifungsmedium und Einteilung der
Versuchsgruppen
Zur Kontrolle der eingesetzten Progesteronzugaben zum Reifungsmedium wurde das Medium
nach der Entnahme der gereiften KOK zunächst in 0,5 ml fassenden Reaktionsgefäßen (Fa. Eppendorf,
Hamburg) bei -20 ◦ C asserviert. Die Bestimmung des Progesterongehaltes im Medium
erfolgte wie bei den Blutproben (siehe Kapitel 3.1.4) mittels Radioimmunoassay. Da jedoch die
zugegebenen Progesteronmengen den Messbereich des Assays überschritten, war eine Verdünnung
der Proben (1:5, 1:10, 1:20) mit Boratpuffer erforderlich. Um etwaige Veränderungen des
Progesterongehaltes im Medium durch die KOK oder das Milieu im Brutschrank zu detektieren,
wurden auch Medienansätze ohne KOK (Leerkontrollen) in den Brutschrank verbracht,
dort für 24 Stunden inkubiert und dann asserviert. Zusätzlich fand auch eine Analyse von reinem,
nicht inkubiertem Reifungsmedium statt, um Kontaminationen der Medienkomponenten
mit Progesteron auszuschließen. Die endgültige Einteilung der einzelnen IVP-Durchgänge in
die Versuchsgruppen erfolgte anhand der im Medienansatz und den Leerkontrollen gemessenen
37

3 Material und Methoden
Progesterongehalte in die Gruppen < 50 ng/ml, 150 ng/ml, 300 ng/ml und 450 ng/ml, entsprechend
0,16 µM, 0,48 µM, 0,95 µM und 1,43 µM.
3.2.5 Reifungskontrolle
An einer repräsentativen Anzahl an KOK fand eine Kontrolle der Reifung nach der IVM statt.
Nach Verbringen der KOK auf einen Objektträger mit vorsichtig angedrücktem Deckgläschen
erfolgte eine Fixierung in Essiglösung (Fixierlösung) für 24 h. Danach wurde die Färbelösung
(Lacmoid-Arbeitslösung) eingebracht und nach 10 Min mit Fixierlösung wieder entfernt. Die
Beurteilung des Kernreifestadiums erfolgte unter dem Mikroskop (Zeiss, Axiostar plus, Carl
Zeiss, Jena) bei 40facher Vergrößerung unter Einsatz eines Phasenkontrastfilters 2. Oozyten,
welche das Meiosestadium II (MII), erkennbar an Metaphasenplatte und ausgeschleustem Polkörperchen
erreicht hatten, galten als gereift, solche, die in der Meiosephase I (MI) verblieben
waren, galten als unreif.
3.2.6 In-vitro-Fertilisation (IVF)
Die gereiften KOK wurden dreimal in 100 µl Waschdrops aus FertTALP-Gebrauchslösung gewaschen
und anschließend in Gruppen von 15-20 KOK in die Fertilisationstropfen pipettiert.
In einer Petrischale mit dem Durchmesser von 35 mm waren jeweils vier Tropfen von 100 µl
aufgebracht und mit Silikonöl überschichtet. Die Fertilisationstropfen waren zur Äquilibrierung
mindestens eine Stunde vor dem Umsetzen der KOK bei 39 ◦ C und 5 % CO 2 in den Brutschrank
verbracht worden. Das Tiergefriersperma eines IVF-gestesteten Bullen wurde für die Fertilisation
zunächst 10 Sekunden lang in 30 ◦ C warmem Wasser aufgetaut. Direkt nach dem Auftauen
erfolgte eine Überprüfung der Motilität der Spermien und danach die Zentrifugation für 16 Min
bei 380 x g in einer Zentrifuge (Mini Spin plus, Fa. Eppendorf, Hamburg) mit einem 90 %igen
Gradienten aus Sperm Filter R○ (Gynemed GmbH und Co., Lensahn) und FertTALP-Lösung in
einem Eppendorfgefäß. Der Überstand wurde nach Ende der Zentrifugation bis auf 50 µl abgenommen
und verworfen. Das im Eppendorfgefäß verbliebene Pellet wurde in 750 µl FertTALP-
Gebrauchslösung resuspendiert und erneut für 3 Min bei 380 x g zentrifugiert. Daraufhin wurde
der Überstand wieder bis auf 50 µl abgesogen und verworfen. Eine erneute Resuspendierung
erfolgte mit 750 µl HHE-Lösung. Abschließend wurden die Spermien nochmals bei 380 x g
zentrifugiert. Der Überstand wurde nun bis auf 100 µl abgenommen und die Spermatozoen im
offenen Eppendorfgefäß im Brutschrank bei 39 ◦ C und 5 % CO 2 und feuchtigkeitsgesättigter
Atmosphäre aufbewahrt. Schließlich wurde die Dichte der Spermiensuspension mittels einer
Thomakammer ermittelt. Anhand der Dichte wurde die erforderliche Menge der Spermalösung
errechnet, um pro Fertilisationsdrop mit 20 KOK 100 000 Spermien zuzugeben. Der Zusatz der
Spermien erfolgte 24 h nach Maturationsbeginn direkt in die Fertilisationstropfen mit den KOK.
Es folgte eine 19stündige Kokultur von Spermien und KOK in einem Brutschrank (HeraCell,
Fa. Heraeus, Thermo Fisher Scientific, USA) mit 39 ◦ C und 5 % CO 2 in feuchtigkeitsgesättigter
Atmosphäre.
38

3.2 In-vitro-Produktion boviner Embryonen
3.2.7 In-vitro-Kultur (IVC)
Die vermeintlichen Zygoten wurden 19 h nach Beginn der Fertilisation in eine Petrischale mit
35 mm Durchmesser mit 2 ml auf 37 ◦ C erwärmten TCM air verbracht und die Kumuluszellen
mittels eines Strippers (The Stripper, MXL3-STR, Mid Atlantic Diagnostics, Inc.) und einer
Stripper-Spitze (Stripper Tip, Mid Atlantic Diagnostics, Inc.) mit einem Durchlass von 135 bzw.
125 µm mechanisch unter stereomikroskopischer Sichtkontrolle bei 20facher Vergrößerung entfernt.
Zur Temperaturerhaltung des Mediums wurde auf einer Wärmebank (Modell HAT 200,
Fa. Minitüb GmbH, Tiefenbach) bei einer Temperatur von 37 ◦ C gearbeitet. Die von den Kumuluszellen
vollständig befreiten Zygoten wurden nach drei Medienausdünnungsschritten in
Gruppen à sechs Stück in 30 µl Tropfen SOFaa-Kulturmedium unter Öl (Fa. Serva, Heidelberg)
bei 39 ◦ C, 5 % CO 2 , 5 % O 2 , 90 % N 2 und feuchtigkeitsgesättigter Atmosphäre für insgesamt
sieben Tage (= 8 Entwicklungstage) kultiviert.
3.2.8 Beurteilung der Embryonen
An Tag 7 und 8 (IVF = Tag 0, Beginn der IVC = Tag 1) erfolgten die Kontrollen hinsichtlich der
Teilungs- und Entwicklungsrate. Die Teilungsrate bezeichnet den Anteil (in %) der gefurchten
Embryonen an den in die In-vitro-Kultur eingebrachten vermeintlichen Zygoten, die Entwicklungsrate
ergibt sich dementsprechend aus dem Anteil (in %) der Embryonen im Morula- oder
Blastozystenstadium an den in die Kultur eingesetzten vermeintlichen Zygoten.
Abbildung 3.8: a: 8-Zell-Embryo, b: Morula, c: expandierte Blastozysten, d: geschlüpfte
Blastozysten
3.2.9 Archivierung von gereiften Oozyten für die mRNA-Analyse
Jeweils 3-5 Oozyten der einzelnen Gruppen der IVP-Durchgänge wurden vor dem Umsetzen in
das Fertilisationsmedium entnommen und in eine Petrischale (35 mm Durchmesser) mit vorgewärmtem
TCM air verbracht. Diese KOK wurden dann unter dem Stereomikroskop auf einer
Wärmeplatte mechanisch mit Hilfe eines Strippers denudiert, dreimal in PVA 0,1 % gewaschen
und einzeln in 0,5 ml nicht-DNA-bindenden Eppendorf-Cups bei -80 ◦ C eingefroren.
39

3 Material und Methoden
3.3 mRNA-Analyse der Oozyten zur Darstellung qualitätsanzeigender
Gentranskripte
3.3.1 Aufbereitung der Proben zur Isolierung der mRNA
Zur Analyse der Transkripte aus den einzelnen Eizellen wurde der Dynabeads mRNA DIRECT
Micro Kit (Fa. Invitrogen, Karlsruhe) verwendet. Zuerst erfolgte ein Prewash der Dynabeads-
Lösung mit entsprechender Separation von Flüssigkeit und Dybnabeads im Magnetic Particle
Concentrator (MPC). Jeder zu analysierenden Eizelle wurden 150 µl des Lysis/Binding-Puffers
sowie 1 µl Kaninchen-Globin-mRNA (1 pg/µl ) zugegeben. Die Kaninchen-Globin-mRNA
dient als externer Standard. Die Proben wurden nun für 10 Sekunden gevortext, zentrifugiert
und 10 Min lang bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Ablauf der Inkubationszeit wurden jeder
Probe 10 µl der vorher gewaschenen, in Lysis/Binding-Puffer befindlichen Dynabeads zugegeben
und erneut für 5 Min bei Raumtemperatur auf einem Thermoblock unter leichtem Schütteln
inkubiert. Während dieser Zeitspanne erfolgte die Bindung des PolyA-Endes der mRNA an die
Dynabeads. Als nächstes wurden die Proben erneut im MPC separiert, und nach Verwerfen des
Überstandes ausserhalb der MPC mit 100 µl Washing- Buffer A (Dynabeads mRNA Micro Kit,
Fa. Invitrogen, Karlsruhe) resuspendiert. Nach einer erneuten Separation und Entfernung des
Überstandes wurde mit 100 µl Washing-Buffer B resuspensiert und dieser Vorgang ein weiteres
Mal durchgeführt. Nach einem letzten Separationsvorgang wurde mit 11 µl sterilem H 2 O
(Ampuwa, Fa. Fresenius, Bad Homburg) resuspensiert. Die Trennung der mRNA von den Dynabeads
erfolgte in einem Thermomixer (Fa. Eppendorf, Hamburg) bei 65 ◦ C für 3 Min. Im
Anschluss wurden die Proben auf Eis in den MPC verbracht. Nach Abnahme des Überstandes
erfolgte sofort die Reverse Transkriptase Reaktion.
3.3.2 Reverse Transkription (RT)
Für die Reaktion der Reversen Transkriptase wurde ein Endvolumen von 20 µl verwendet.
Es wurden ein Globinstandard, eine Negativ-Kontrolle des Standards, eine Negativ-Kontrolle
der Probe, die Probe selbst sowie eine Negativ-Kontrolle mit sterilem Wasser (Ampuwa, Fa.
Fresenius, Bad Homburg) anstelle von mRNA mitgeführt, um Kontaminationen der Reaktionsansätze
ausschließen zu können. Der Master-Mix (MM) wurde für alle Proben gemeinsam
angesetzt (Zusammensetzung siehe Anhang A.33). Diesem wurden 11 µl mRNA aus der vorhergehenden
mRNA-Isolierung zugegeben, die Negativkontrollen wurden mit sterilem Wasser
(Ampuwa, Fa. Fresenius, Bad Homburg) auf dieses Volumen aufgefüllt. Im PCR-Cycler (IQ
Multicolor Real-Time PCR Detection System, Fa. Bio-Rad, München) wurde daraufhin die in
den Proben vorhandene mRNA in cDNA umgewandelt. Dabei fand zunächst eine 10minütige
Inkubation bei 25 ◦ C statt. Dann erfolgte die Reverse Transkription der mRNA in cDNA bei
42 ◦ C für 60 Min. Zur Denaturierung verblieben die Proben dann noch 5 Min bei 99 ◦ C, um
danach sofort bis zur Polymerase-Kettenreaktion auf Eis verbracht zu werden.
40

3.3 mRNA-Analyse der Oozyten zur Darstellung qualitätsanzeigender Gentranskripte
3.3.3 Quantitative Polymerase Kettenreaktion (qPCR)
Die in Tabelle 3.4 aufgelisteten Gene wurden in der RT-qPCR auf die Intensität ihrer mRNA-
Expression hin untersucht. Die Selektion der Primer erfolgte mit Hilfe der Software Primer3
unter Vorgabe der Amplifikatgröße (150-250 bp), des GC-Gehaltes (40-60 %) und der Annealingtemperatur
(59,5-60,5 ◦ C). Die Quantifizierung der Gentranskripte fand in der RT-qPCR
durch die Sichtbarmachung der Fragmente mittels Fluoreszenzen statt. Die eingesetzten Embryonenäquivalente
variieren je nach untersuchtem Gentranskript, wobei ein Embryonenäquivalent
20 µl des Reaktionsansatzes entspricht (siehe Tabelle 3.3).
Das Endvolumen für die PCR betrug 20 µl. Dabei bestand jeder Ansatz aus dem kommerziell
erhältlichen Reaktionsmix, den jeweilig benötigten 5´- und 3´-Primern für die zu untersuchenden
Transkripte sowie der cDNA aus der RT und sterilem Wasser (Ampuwa, Fa. Fresenius, Bad
Homburg).
Für alle Ansätze erfolgte zunächst eine 10minütige Denaturierung bei 95 ◦ C. Danach fanden
43 Zyklen mit folgendem Aufbau statt [vgl. auch HANSTEDT (2009), KUZMANY et al. (2011),
BEILBY et al. (2011), STINSHOF et al. (2012)]:
- Spaltung der cDNA für 15 Sekunden bei 95 ◦ C (Denaturierung)
- Anlagerung der Primer für 30 Sekunden bei 60 ◦ C (Annealing)
- Extension für 30 Sekunden bei 72 ◦ C (Verlängerung)
Anschließend wurde eine Schmelzkurve zur Verifikation der PCR-Fragmente durch eine schrittweise
Erhöhung um 0,5 ◦ C alle zehn Sekunden erstellt. Die Starttemperatur betrug hierbei 55 ◦ C
und die Endtemperatur 95 ◦ C. Die Verifizierung der Größe der spezifischen Fragmente wurde
mittels Agarosegelelektrophorese in einem 2 %igen Agarosegel in TBE-Puffer (90 mM Tris,
90 mM Borsäure, 2 mM EDTA, pH=8,3), welches mit 2 µl Ethidiumbromid gefärbt war, durchgeführt.
Die Auftrennung der PCR-Produkte erfolgte für 4 min bei 100 Volt und anschließende
35 min bei 80 Volt.
Tabelle 3.3: Eingesetzte Oozyten- bzw. Embryonenäquivalente (EÄ; 1 EÄ ˆ= 20 µl des
Reaktionsansatzes) für die jeweiligen Gentranskripte
Gen EÄ
GDF9 0,05
BMP15 0,0125
HIF2α 0,05
SLC2A1 (GLUT1) 0,1
PGR 0,1
PGRMC1 0,025
PGRMC2 0,025
PAQR5 0,05
Globin 0,05
41

3 Material und Methoden
3.4 Auswertung der Daten und statistische Analyse
Alle Daten sind, soweit nicht anders angegeben, als arithmetisches Mittel mit Standardabweichung
(¯n± SD) bzw. Standardfehler (± SEM) dargestellt.
Die Erstellung der Kurven zum Progesteronverlauf der einzelnen Tiere erfolgte unter Verwendung
von Gnuplot 4.4.3 für Windows. Aufgrund des physiologischerweise zyklischen Verlaufes
liegt eine Sinusfunktion zugrunde, deren Verlauf durch die Manipulationen des Versuches
(OPU) exponentiell abfällt. Die Startparameter für den Least Square Fit (LSF) wurden anhand
der Daten so gewählt, dass die Konvergenz des Algorithmus gewährleistet war. Anhand der erstellten
Funktion der Form f(x) = a·(sin((x+b)·c)+1)·exp −d·x erfolgte dann eine Berechnung
der Maxima (Max) und Minima (Min) sowie der Punkte mit y=1 (entspricht P4=1 ng/ml) im
Bereich -5 ≥ x ≤ 52.
Die statistische Analyse der Daten erfolgte mit dem Computerprogramm SigmaStat 2.0 der
Fa. Jandel Scientific, San Rafael, USA. Die Analyse der Daten aus dem OPU und der IVP
fand mittels ANOVA und Tukey Test statt. Alle Daten wurden mittels Komolgorow-Smirnow-
Test auf Normalverteilung geprüft. Die anschließende Varianzanalyse wurde mit dem Levene
Median Test durchgeführt. Unterschiede von P ≤ 0,05 galten als statistisch signifikant.
42

3.4 Auswertung der Daten und statistische Analyse
Tabelle 3.4: Verwendete Primer
Gen Primersequenz Primer- Amplifikat- Datenbankvom
5´- zum 3´-Ende position größe (bp) Nr.
GDF9 F:TCC TTT GGT TTT GCT GCT TT 57 204 NM_174681
R:GTT CCC TGT GCC CAT CAT AC 260
BMP15 F:GCA GCC AAG AGG TAG TGA GG 634 194 DQ463368
R:CAA TAC TGC CTG CTT GAC GA 827
HIF2α F:GCG ACG ACA GAA TCA CAG AA 1043 194 AB018399
R:TGT CTC CAG CCA CAC ATA GC 1236
SLC2A1 F:CAG GAG ATG AAG GAG GAG AGC 894 256 M60448
(Glut1) R:CAC AAA TAG CGA CAC GAC AGT 1151
PGR F:TAC CTT AGG CCG GAT TCA GA 1570 197 NM_001205356
R:CAA TCG TTT CTT CCA GCA CA 1766
PGRMC1 F:GGA AGA GAT GCA TCC AGA GG 425 207 NM_001075133.1
R:TGG CTC CTC CTT GTC TGA GT 631
PGRMC1 F:AGT CAG GGG CCT TCA GAA CTG CA 693 207 NM_001099060.1
R:TCA GGA TGA AGC CCC ACC AGA CAT T 899
PAQR5 F:ACA CCT TCA GCT CCA TGT CC 327 203 XM_605853
R:GTA GCA GGA GAG CCA GAT GC 529
Globin F:GCA GCC ACG GTG GCG AGT AT 241 257 X04751
R:GTG GGA CAG GAG CTT GAA AT 555*
*Intron an Position 281-357
43

3 Material und Methoden
44

4 Ergebnisse
4.1 OPU
Da alle sechs Tiere im ersten Versuch nach Regression des bestehenden, nach der natürlichen
Brunst gebildeten Gelbkörpers [nachfolgend „natürliches C.l.“(nat. C.l.) genannt] Zwischenbrunsten
und daran anschließend die Bildung von Gelbkörpern [im Folgenden „induziertes
C.l.“(ind. C.l.) genannt] während des OPU-Zeitraumes zeigten, wurde der Versuch über die
geplanten 5-6 Wochen durchgeführt, sodass die Datenerhebungen zwei nahezu vollständige
Zyklen wiederspiegeln. Ein Tier wurde aufgrund von Zystenbildung aus der Auswertung ausgeschlossen.
Im zweiten Versuch fand die OPU-Prozedur an vier der bereits im ersten Durchlauf genutzten
Tieren statt, wobei zwei Tiere zweimal und zwei Tiere dreimal wöchentlich der OPU-Prozedur
unterzogen wurden. Bei den zweimal wöchentlich punktierten Tieren wurde eines aufgrund
falscher Zyklusbeobachtung und daraus resultierendem falschen Versuchsstart ausgeschlossen.
Ein Tier der dreimal wöchentlich Punktierten zeigte einen persistierenden Gelbkörper mit P4
≥ 3 ng/ml über den gesamten Punktionszeitraum und ging deshalb ebenfalls nicht in die Auswertung
ein. Das zweite Tier der dreimal wöchentlich punktierten zeigte ebenso wie alle zweimal
punktierten eine Zwischenbrunst mit physiologischer Zykluslänge. In die weiteren Auswertungen
der Daten ging dieses Tier jedoch nicht ein, da aufgrund der methodischen Abweichung
(dreimal wöchentliche Punktion statt zweimal) bei nur einem Tier die Vergleichbarkeit der Daten
fraglich ist.
Im dritten Versuchsdurchlauf erfolgte die OPU-Prozedur zweimal wöchentlich an drei nie
zuvor punktierten Tieren. Eines dieser Tiere zeigte weder Zwischenbrunst noch die Bildung
eines ind. C.l.s und wurde daher aus den weiteren Auswertungen ausgeschlossen.
Die Ergebnisse beziehen sich daher auf 7 Tiere und 8 OPU-Durchgänge (ein Tier zweimal
genutzt, siehe auch Tabelle 4.1). Die Gesamtdaten der OPU-Versuche aller Tiere finden sich in
Anhang B.1 Tabellen B.1 -B.32.
45

4 Ergebnisse
Tabelle 4.1: Tiernutzung und Auswertung im OPU-Versuchsteil
OPU-Sessions eingefrorene
Versuch Tier Bezeichnung Datum
(Anzahl) Oozyten
1
2
3
Bemerkung
Betty Betty1 28.01.-25.02.10 9 11 Versuchsstart falsch; nicht gewertet
Crazy Crazy1 25.01.-25.02.10 10 19
Frieda Frieda1a 18.02.-15.03.10 8 19 Zyste; nicht gewertet
Frieda1b 25.03.-29.04.10 11 27
Hera Hera1a 01.02.-15.02.10 5 9 Versuch abgebrochen; nicht gewertet
Hera1b 15.03.-22.04.10 12 39
Queen Queen1a 22.02.-08.03.10 5 9 Versuch abgebrochen; nicht gewertet
Queen1b 15.03.-22.04.10 12 32
Rosa Rosa1 11.02.-11.03.10 9 24
Hera Hera2 31.05.-15.07.10 14 59 Versuchsstart falsch; nicht gewertet
Queen Queen2 07.06.-15.07.10 12 46
Crazy Crazy2 04.06.-09.07.10 15 53 3x wöchentl. OPU;
persistierendes C.l.; nicht gewertet
Rosa Rosa2 02.06.-09.07.10 17 49 3x wöchentl. OPU; nicht gewertet
Stella Stella3 28.10.-09.12.10 13 61
Tiffy Tiffy3 25.10.-29.11.10 11 52
UFO UFO3 25.10.-09.12.10 14 58 kein ind. C.l.; nicht gewertet
46

4.1 OPU
4.1.1 Zyklusverhalten und Gelbkörpereigenschaften
Da alle Tiere während der OPU-Versuchsphase regelmäßig Brunsten zeigten, wurde der Punktionszeitraum
anhand der Serumprogesteronwerte in verschiedene Phasen eingeteilt. Als Grenzwert
für ein funktionelles C.l. wurde dazu 1 ng/ml (SRIKANDAKUMAR et al. 1986) angenommen.
So ergaben sich für jedes Tier eine Lutealphase des nach der natürlichen Brunst entstandenen
C.l., eine daran anschließende Follikelphase sowie eine weitere Lutealphase (ind. C.l.),
die an die während des OPU aufgetretene Brunst anschloss. Ein Beispiel für die mittels Gnuplot
4.4.3 erstellte Funktion ist in Abbildung 4.1 zu sehen. Die Funktionsparameter für die Progesteronkurve
der einzelnen Tiere sowie eine Auflistung der errechneten Kurvenpunkte findet sich
in Anhang B.1.1 Tabelle B.33 sowie B.1.3 Tabellen B.34 und B.35.
Abbildung 4.1: Graphische Darstellung des Progesteronprofils während des Versuchszeitraumes;
+ an den Punktionstagen gemessene Werte, – Näherungsfunktion
Insgesamt gingen die Ergebnisse aus 8 OPU-Durchgängen von 7 Tieren in die Auswertungen
ein. Die durchschnittliche Zykluslänge des ersten Zyklus betrug 23,9 ±1,1 (¯n± SD, n=8)
Tage, der zweite Zyklus während der OPU-Versuchsphase unterschied sich in seiner Länge
(23,5 ±1,7 Tage; ¯n± SD, n=8) nicht vom ersten. Dabei wurde der Tag der Brunst jeweils als
Tag 0 des neuen Zyklus angesehen.
Der Mittelwert des gebildeten Progesterons während der beiden C.l.-Phasen betrug für das natürliche
C.l. 4,6 ±1,9 ng/ml und für das induzierte C.l. 2,8 ±1,0 ng/ml (¯n± SD, n=8, P ≤0,05,
siehe Abbildung 4.2). Die Querschnittsflächen der jeweiligen C.l. unterschieden sich ebenfalls
signifikant (nat. C.l. 246,7 ±56,0 mm 2 , ind. C.l. 140,6 ±55,9 mm 2 ; ¯n± SD, n=8, P ≤0,05, siehe
47

4 Ergebnisse
Abbildung 4.2). Die Länge der Lutealphasen zeigte jedoch keine statistischen Unterschiede (nat.
C.l. 17,0 ±2,3 Tage, ind. C.l. 14,4 ±2,9 Tage, ¯n± SD, n=8, siehe Abbildung 4.2). Der mittlere
Serumprogesterongehalt und die mittlere Querschnittsfläche der beiden C.l. waren nicht korreliert.
Auch die mittlere Querschnittsfläche des natürlichen C.l.s korrelierte nicht mit der des
induzierten C.l.s. Bezüglich des mittleren Serumprogesterongehaltes während der Gelbkörperphasen
bestand insofern ein tendenzieller Zusammenhang zwischen dem natürlichen C.l. und
dem induzierten C.l., als dass eine hohe P4-Produktion während der natürlichen Lutealphase
auch eine höhere P4-Produktion des induzierten C.l.s bedingte.
7
6
a
350
300
a
20
18
16
P4 (ng/ml)
5
4
3
2
4,6
b
2
Fläche in mm
250
200
150
100
246,7
b
Länge der C.l.- Phase (Tage)
14
12
10
8
6
17,0
14,4
2,8
140,6
4
1
50
2
0
nat. C.l.
ind. C.l.
0
nat. C.l.
Abbildung 4.2: Serumprogesterongehalt (links; ¯n±SD, n=8; a:b mit P ≤0,05), Fläche
(Mitte; ¯n±SD, n=8; a:b mit P ≤0,05) und Lutealphasenlänge (rechts;
¯n±SD, n=8) des natürlichen und induzierten C.l.
ind. C.l.
0
nat. C.l.
ind. C.l.
4.1.2 Follikelpunktion, Eizellausbeute und Oozytenqualität
Während der natürlichen C.l.-Phase wurden insgesamt 326 Follikel (32 OPU-Sitzungen), in der
Follikelphase 208 Follikel (21 OPU-Sitzungen) und in der induzierten C.l.-Phase 307 Follikel
(21 OPU-Sitzungen) punktiert. Die Verteilung der Follikelgrößen [Anteile kleiner 3-5 mm, mittelgroßer
5-8 mm, großer ≥ 8 mm Follikel an der Gesamtfollikelzahl (%)] ist der Tabelle 4.2 zu
entnehmen. Die entsprechenden Mittelwerte der punktierten Follikel je OPU-Sitzung und die
Verteilung auf die einzelnen Größenkategorien finden sich in Tabelle 4.3. Bezüglich der Anzahl
der punktierten Follikel und ihrer Größenverteilung in den einzelnen Zyklusphasen konnten
keine signifikanten Unterschiede festgestellt werden.
48

4.1 OPU
Tabelle 4.2: Punktierte Follikel (n) und Größenverteilung während der Zyklusphasen
Zyklusphase Anteile der Follikelgrößen (%)
(n) 3-5 mm 5-8 mm ≥8 mm
natürliches C.l. 77,6 18,4 4,0
(n=326) (n=253) (n=60) (n=13)
Follikelphase 75,5 16,3 8,2
(n=208) (n=157) (n=34) (n=17)
induziertes C.l. 73,0 21,5 5,5
(n=307) (n=224) (n=66) (n=17)
Tabelle 4.3: Punktierte Follikel pro OPU-Sitzung (¯n±SD) in den einzelnen Zyklusphasen
Zyklusphase
Follikelgröße
Follikel
(OPU-Sitzungen)
3-5 mm 6-8 mm >8 mm
natürliches C.l. 10,2 ±3,4 7,9 ±3,1 1,9 ±1,2 0,4 ±0,6
(32)
Follikelphase 9,9 ±3,6 7,5 ±3,6 1,6 ±1,1 0,8 ±0,8
(21)
induziertes C.l. 9,9 ±2,9 7,2 ±2,7 2,1 ±1,3 0,5 ±0,7
(21)
Die mittlere Wiederfindungsrate (Anzahl KOK/Anzahl punktierte Follikelx100) betrug 38,7 %
(326 punktierte Follikel, 126 KOK) in der natürlichen C.l-Phase, 39,9 % (208 punktierte Follikel,
83 KOK) während der Follikelphase und 30,6 % (307 punktierte Follikel, 94 KOK) in
der induzierten C.l.-Phase. In Bezug auf die Anzahl der gewonnenen KOK und deren Qualität
zeigten sich in den einzelnen Zyklusphasen keine statistisch signifikanten Unterschiede. Die
Anzahl der gewonnenen KOK aus den einzelnen Zyklusphasen und deren Verteilung auf die
Qualitätskategorien sind der Tabelle 4.4 zu entnehmen. Die Mittelwerte der Anzahl der gewonnenen
KOK pro OPU-Sitzung und deren Verteilung auf die Qualitätskategorien sind in Tabelle
4.5 dargestellt.
Tabelle 4.4: Gewonnene KOK (n) und Anteile an den einzelnen Kategorien (%)
Zyklusphase Anteile der Qualitätskategorien (%) IVP-
(n) 1 2 3 4 5 tauglich untauglich
natürliches C.l. 22,2 27,0 32,5 8,7 9,6 81,7 18,3
(n=126) (n=28) (n=34) (n=41) (n=11) (n=12) (n=103) (n=23)
Follikelphase 19,3 22,9 42,2 3,6 12,0 84,4 15,6
(n=83) (n=16) (n=19) (n=35) (n=3) (n=10) (n=70) (n=13)
induziertes C.l. 24,5 33,0 27,6 2,1 12,8 85,1 14,9
(n=94) (n=23) (n=31) (n=26) (n=2) (n=12) (n=80) (n=14)
49

4 Ergebnisse
Tabelle 4.5: Gewonnene KOK der einzelnen Kategorien pro OPU-Sitzung in den Zyklusphasen
(¯n±SD)
Zyklusphase
Kategorie
KOK
(OPU-Sitzungen)
1 2 3 4 5
natürliches C.l. 3,9 ±2,7 0,9 ±1,1 1,1 ±1,0 1,3 ±1,1 0,3 ±0,8 0,4 ±0,7
(32)
Follikelphase 4,0 ±2,9 0,8 ±0,9 0,9 ±0,9 1,7 ±2,4 0,1 ±0,4 0,5 ±0,8
(21)
induziertes C.l. 3,0 ±2,0 0,8 ±0,9 1,0 ±1,2 0,8 ±0,9 0,1 ±0,3 0,4 ±0,6
(21)
4.2 Progesteronsupplementation während der In-vitro-Maturation
4.2.1 Progesteronanalyse im Medium
Im IVM-Medium ohne P4-Zusatz wurde kein P4 detektiert (P4 < 0,1 ng/ml). Die Ausgangskonzentrationen
sowie der P4-Gehalt des supplementierten Mediums nach 24stündiger Inkubation
mit/ohne Oozyten sind der Tabelle 4.6 zu entnehmen. Die P4-Konzentration nach 24stündiger
Inkubation mit Oozyten zeigte sich proportional zur Ausgangskonzentration. Dargestellt sind
hier lediglich die P4-Gehalte der Medien der in die weitere Auswertung eingegangenen IVP-
Durchgänge. Die Gesamtdaten zu den Medien sind den Tabellen B.43-B.46 in Anhang B.2.2
zu entnehmen. Die sehr unterschiedlichen Probenanzahlen (n) resultieren aus der Problematik,
stark unterschiedliche P4-Konzentrationen (< 50 ng/ml - 450 ng/ml) zu analysieren, was
mehrere Verdünnungsschritte erforderte. Aufgrund des geringen Probenvolumens konnte in einigen
Fällen die vollständige Analyse nicht durchgeführt werden. Solche Proben wurden von
der Auswertung ausgeschlossen.
50

4.2 Progesteronsupplementation während der In-vitro-Maturation
Tabelle 4.6: Progesterongehalt des Mediums (¯n±SD) der einzelnen Versuchsgruppen
vor der Inkubation (Ansatz), nach 24stündiger Inkubation ohne Oozyten
(Leerkontrolle) sowie nach 24stündiger Inkubation mit Oozyten
Gruppe
P4
Ansatz Leerkontrolle mit Oozyten
≤ 50 ng/ml 26,7 ±18,5 ng/ml 32,9 ±23,0 ng/ml 17,9 ±11,4 ng/ml
(≤ 0,16 µM) 0,09 ±0,06 µM 0,1 ±0,07 µM 0,06 ±0,04 µM
(n=7) (n=12) (n=9)
150 ng/ml 133,6 ±50,2 ng/ml 129,8 ±30,3 ng/ml 33,1 ±12,0 ng/ml
(0,48 µM) 0,42 ±0,0,16 µM 0,41 ±0,10 µM 0,1 ±0,04 µM
(n=11) (n=33) (n=30)
300 ng/ml 297,9 ±39,3 ng/ml 210,7 ±63,4 ng/ml 88,0 ±119,8 ng/ml
(0,95 µM) 0,95 ±0,13 µM 0,67 ±0,20 µM 0,28 ±0,38 µM
(n=9) (n=9) (n=13)
450 ng/ml 406,7 ±57,5 ng/ml 470,8 ±62,3 ng/ml 62,4 ±24,1 ng/ml
(1,43 µM) 1,29 ±0,18 µM 1,5 ±0,20 µM 0,20 ±0,08µM
(n=6) (n=3) (n=11)
4.2.2 In-vitro-Produktion nach Progesteronzusatz im Reifungsmedium
Nach der 24stündigen Reifung waren die mit Progesteronzusatz gereiften KOK mit deutlich
kompakteren Kumuluszellschichten umgeben als die der Kontrollgruppen (siehe Abbildung
4.3).
Abbildung 4.3: a: gereifte Oozyten der Kontrollgruppe; b: mit EtOH gereift; c: mit P4
gereift; Maßstab in allen Bildern gleich
Die Reifungskontrollen zeigten keine statistischen Unterschiede (P >0,05) in den Reifungsraten
zwischen den einzelnen Versuchsgruppen oder in Relation zu den Kontrollgruppen (siehe
Tabelle 4.7, Gesamtdaten siehe Anhang B.2.3 Tabellen B.47 -B.51). Die Teilungs- und Entwicklungsraten
der Embryonen der jeweiligen Versuchsgruppen sowie die der Kontrollgruppen
sind in Tabelle 4.8 dargestellt. Bezüglich der Teilungsraten gab es keine statistisch signifikanten
Unterschiede. Mit < 50 ng/ml P4 gereifte KOK zeigten sowohl an Tag 7 als auch an Tag 8 der
Entwicklung eine signifikant herabgesetzte Entwicklungsrate gegenüber den Kontrollgruppen
(P ≤0,05). Die Daten zu den IVP-Durchgängen der einzelnen Versuchsgruppen befinden sich
51

4 Ergebnisse
in Anhang B.2.1 Tabellen B.36 -B.42. Weiterhin zeigten mit 300 ng/ml gereifte KOK eine gegenüber
der EtOH-Kontrolle signifikant geringere Entwicklungsrate (P ≤0,05). Im Vergleich
mit der zusatzfreien Kontrolle bestand eine Tendenz zur herabgesetzten Entwicklung in dieser
Gruppe (P=0,084).
Tabelle 4.7: Prozentuale Anteile der Meiosestadien M I und M II in den Reifungskontrollen
(¯n±SD; P > 0,05)
Gruppe
Wiederholungen M I M II
Oozyten(n) (%) (%)
Kontrolle 3 17,8 ±3,5 82,2 ±3,5
(n=82) (n=15) (n=67)
EtOH 3 11,9 ±1,8 88,1 ±1,8
(8 µl) (n=84) (n=10) (n=74)
P4=150 ng/ml 3 17,8 ±3,6 82,2 ±3,6
(0,39 µM) (n=85) (n=15) (n=70)
P4=300 ng/ml 3 14,5 ±3,2 85,5 ±3,2
(0,73 µM) (n=86) (n=12) (n=74)
P4=450 ng/ml 3 17,2 ±3,1 82,8±3,1
(1,51 µM) (n=87) (n=15) (n=72)
Tabelle 4.8: Teilungs- (TR) und Entwicklungsraten (ER) der einzelnen Versuchsgruppen
(¯n±SD)
Gruppe
Wiederholungen TR ER d7 ER d8
Oozyten (%) (%) (%)
Kontrolle 26 55,9 ±11,6 20,7 ±6,6 b 25,4 ±8,0 b
(681) (381) (141) (173)
EtOH 29 53,7 ±11,1 21,4 ±10,3 c 27,9 ±9,2 c
(723) (388) (155) (202)
P4 < 50 ng/ml 6 45,2 ±9,9 10,7 ±5,4 a 15,8 ±5,4 a
(< 0,16 µM) (177) (80) (19) (28)
P4=150 ng/ml 11 49,7 ±11,6 18,3 ±8,2 ab 22,4 ±8,5 ab
(0,39 µM) (322) (160) (59) (72)
P4=300 ng/ml 5 48,2 ±15,9 15,5 ±5,0 d 18,0 ±7,2 d
(0,73 µM (278) (134) (43) (50)
P4=450 ng/ml 7 48,3 ±10,2 16,9 ±3,2 ab 22,4 ±10,6 ab
(1,51 µM) (290) (140) (49) (65)
innerhalb einer Spalte: a:b, a:c mit P≤0,05; c:d mit P=0,084
52

4.3 mRNA-Expression verschiedener Gene
4.3 mRNA-Expression verschiedener Gene
4.3.1 mRNA-Expression in OPU-KOK verschiedener Zyklusphasen
Es konnten statistisch signifikante Unterschiede für die Expression der mRNA von GDF9,
HIF2α, BMP15, PGR, PGRMC1, PGRMC2 und PAQR5 in Abhängigkeit von der Zyklusphase
nachgewiesen werden. Bezüglich der Expression des Glukosetransporters SLC2A1 gab es keine
statistisch signifikanten Unterschiede. Im Folgenden soll lediglich die Expression der signifikant
veränderten Gentranskripte dargestellt werden. Eine ausführliche Auflistung aller Daten
findet sich in Anhang B.3.1.
Eizellen aus der Phase des induzierten C.l. zeigten gegenüber Eizellen der natürlichen C.l.-
Phase eine signifikant verringerte Transkriptmenge von GDF9. Weiterhin bestand eine statistische
Tendenz (P=0,075) zur verringerten Expression von GDF9 im Vergleich zur Follikelphase
(siehe Abbildung). Bezüglich HIF2α zeigte sich eine signifikant geringere Expression bei Eizellen
aus der induzierten C.l-Phase gegenüber dem natürlichen C.l. (siehe Abbildung 4.4). Eizellen
der induzierten C.l.-Phase wiesen ausserdem eine signifikant geringere Transkriptmenge
von BMP15 gegenüber Eizellen der anderen Zyklusphasen auf (siehe Abbildung 4.4).
Abbildung 4.4: mRNA-Gehalte der OPU-Oozyten bezüglich GDF9, BMP15 und HIF2α;
a:b mit P < 0,05, * = Tendenz
Bezüglich der Progesteronrezeptoren gab es signifikant weniger Transkripte in den Oozyten
der induzierten C.l.-Phase im Vergleich zu den anderen Zyklusphasen im Hinblick auf
53

4 Ergebnisse
PGRMC1 und PGRMC2. Die Transkriptmenge des nuklearen Rezeptors PGR war in den Oozyten
der induzierten C.l.-Phase signifikant geringer im Vergleich zur Follikelphase, und in
Relation zur natürlichen C.l.-Phase tendenziell verringert (P=0,059). Die Eizellen der induzierten
C.l.-Phase enthielten gegenüber den Oozyten der natürlichen C.l.-Phase eine signifikant
verringerte Menge an PAQR5 (siehe Abbildung 4.5).
Abbildung 4.5: mRNA-Gehalte der OPU-Oozyten bezüglich der Progesteronrezeptoren;
a:b mit P < 0,05, * = Tendenz
4.3.2 mRNA-Expression in gereiften Oozyten nach IVM mit P4-Zusatz
Die relative Transkriptmenge in den Eizellen der Versuchsgruppen verglichen mit unreifen Oozyten
bzw. den Kontrollgruppen war bei GDF9, HIF2α, PGR, PGRMC2 und PAQR5 signifikant
verändert. Bezüglich SLC2A1, BMP15 und PGRMC1 konnten keine statistisch signifikanten
Unterschiede in der mRNA-Expression festgestellt werden. Im Folgenden soll lediglich auf die
statistisch signifikant veränderten Transkripte eingegangen werden. Eine ausführliche Auflistung
aller Daten findet sich in Anhang B.3.2.
54

4.3 mRNA-Expression verschiedener Gene
Im Vergleich zu unreifen Eizellen zeigten Oozyten der Gruppen < 50 ng/ml, 150 ng/ml
und 300 ng/ml eine signifikant verringerte relative Transkriptmenge von GDF9 (siehe Abbildung
4.6). Bezüglich HIF2α war die Transkriptmenge in Oozyten der Gruppen 150 ng/ml und
450 ng/ml gegenüber den unreifen Oozyten signifikant herabgesetzt, bei den Oozyten der Gruppe
300 ng/ml zeigte sich eine Tendenz (P=0,066; siehe Abbildung 4.6).
Abbildung 4.6: mRNA-Gehalte der gereiften Oozyten aus dem IVM-Versuch bezüglich
GDF9 und HIF2α; a:b mit P < 0,05, * = Tendenz
Der nukleare PGR wies signifikant niedrigere Transkriptmengen in den unreifen Oozyten sowie
den Oozyten der Gruppen EtOH, < 50 ng/ml, 150 ng/ml und 450 ng/ml gegenüber der zusatzfreien
Kontrollgruppe N auf (siehe Abbildung 4.7). Die Oozyten der Gruppe 300 ng/ml tendierten
ebenfalls zu niedrigeren Werten (P=0,086). Oozyten der Progesterongruppen < 50 ng/ml,
150 ng/ml und 450 ng/ml zeigten eine signifikant verringerte Expression von PGRMC2 gegenüber
der zusatzfreien Kontrolle N (siehe Abbildung 4.7). Ausserdem enthielten Eizellen der
Gruppe 150 ng/ml tendenziell weniger PGRMC2-Transkripte als Eizellen der Alkoholkontrolle
EtOH (P=0,063). Der Rezeptor PAQR5 war in den Gruppen EtOH, 150 ng/ml und 450 ng/ml gegenüber
unreifen Eiztellen signifikant verringert. Auch die Gruppen < 50 ng/ml und 300 ng/ml
tendierten zu niedrigeren PAQR5-Transkriptgehalten (P=0,071 und P=0,067; siehe Abbildung
4.7).
55

4 Ergebnisse
Abbildung 4.7: mRNA-Gehalte der gereiften Oozyten aus dem IVM-Versuch bezüglich
der Progesteronrezeptoren; a:b mit P < 0,05, * = Tendenz
56

5 Diskussion
5.1 Zyklusverhalten während der OPU-Versuchsphase
Im OPU-Versuchsteil der vorliegenden Arbeit wurden 7 Tiere zweimal wöchentlich über einen
Zeitraum von 5-6 Wochen der OPU-Prozedur zur Gewinnung von Eizellen unterzogen. Während
dieses Zeitraumes zeigten alle Tiere regelmässige Brunsten mit physiologischer Zykluslänge
sowie die Bildung gelbkörper-ähnlicher, progesteronproduzierender Strukturen.
5.1.1 Zwischenbrunsten und Bildung gelbkörperähnlicher Strukturen
Um eine physiologische Brunst hervorzurufen bedarf es einerseits eines dominanten Follikels,
andererseits aber auch der hormonellen Konstellation, die nicht nur zu den äusseren und inneren
Anzeichen der Brunst führt, sondern den dominanten Follikel letztlich ovulieren und einen
Gelbkörper entstehen lässt. Durch Ergebnisse verschiedener Forschungsgruppen (PIETERSE
et al. 1991b, BERGFELT et al. 1994, BONI et al. 1997, PETYIM et al. 2000) ist belegt, dass das
Absaugen aller Follikel durch OPU eine FSH-Ausschüttung bedingt und somit eine neue Follikelwelle
auslöst. Das Auftreten dominanter Follikel bei zweimal wöchentlichen OPU-Sessions
wurde, in Abhängigkeit vom OPU-Intervall, ebenfalls mehrfach beschrieben (BERGFELT et al.
1994, GINTHER et al. 1996, PETYIM et al. 2000, 2001, 2003) und konnte auch im vorliegenden
Versuch zu verschiedenen Zeitpunkten des Zyklus beobachtet werden. Dies kann mit einem
durch OPU beschleunigten Follikelwachstum (BONI et al. 1997) zusammenhängen. Laut
HAYASHI et al. (2008) ist nach der Luteolyse und somit dem Wegfall des hemmenden Einflusses
des Gelbkörpers eine erhöhte Ausschüttung von Wachstumshormonen zusammen mit
einem erhöhten basalen LH-Level für ein schnelleres Follikelwachstum verantwortlich. Dies
deckt sich mit den Erkenntnissen von CARLIN et al. (1999), die ebenfalls ein erhöhtes basales
LH- und FSH-Level bei niedrigen Progesteronwerten durch zweimal wöchentliches OPU
über einen Zeitraum von 16 Wochen verursachen konnten. Im Gegensatz zu den Ergebnissen
der vorliegenden Arbeit haben einige Autoren beobachtet, dass das wiederkehrende Absaugen
aller Follikel den Zyklus ausser Kraft setzt (GIBBONS et al. 1994, BONI et al. 1997). Diese
57

5 Diskussion
Autoren konnten, wie auch später CARLIN et al. (1999), weder dominante Follikel noch Ovulationen
bei zweimal wöchentlich sattfindendem OPU feststellen. Eine unbemerkte Ovulation
nicht punktierter Follikel, wie sie bei BERGFELT et al. (1994) als Ursache für Zwischenbrunsten
beschrieben wurde, konnte in der vorliegenden Arbeit durch eine Ultraschallkontrolle nach
jeder OPU-Session ausgeschlossen werden.
In der vorliegenden Arbeit wurden weder FSH noch LH gemessen, daher ist eine eindeutige
Klärung der Ursachen für die Zwischenbrunsten und die auftretenden dominanten Follikel hier
nicht möglich. Ein beschleunigtes Follikelwachstum durch die oben beschriebenen hormonellen
Veränderungen könnten dies jedoch erklären.
Auf die während des OPU-Versuchszeitraumes beobachtete Brunst folgte bei allen Tieren die
Bildung gelbkörperähnlicher Strukturen. Da am Tage der Brunst eine OPU-Session erfolgte ist
davon auszugehen, dass der jeweilige Brunstfollikel punktiert wurde. Die Bildung gelbkörperähnlicher
Gebilde nach Follikelpunktionen wurde in der Vergangenheit mehrfach beschrieben
(PETYIM et al. 2000, 2001, 2003). Schon 1994 hielten BERGFELT et al. (1994) eine Gelbkörperbildung
nach der Punktion reifer Follikel für möglich. Hiermit übereinstimmend stellten
(PETYIM et al. 2000) die Bildung C.l.-ähnlicher Strukturen nach Punktion dominanter Follikel
bei Tieren, die äussere Brunstanzeichen zeigten, fest. Diese Autoren setzen die östrusnahe Follikelpunktion
mit einer künstlichen Ovulation gleich. Die auf diese Weise induzierten Gelbkörper
waren zwar kleiner, konnten von den Autoren aber als funktionelle Gelbkörper eingestuft werden.
Auch bei der östrusfernen Follikelpunktion bildeten sich in den Studien von PETYIM et al.
(2000) gelbkörperähnliche Strukturen. Dabei handelte es sich entweder um kurzlebige C.l. mit
einem nur vorübergehenden Anstieg von Progesteron oder um C.l. mit normaler Lebensdauer
und insgesamt niedrigen P4-Werten. Im Gegensatz dazu konnte in früheren Studien von PIE-
TERSE et al. (1988, 1991a,b) keine Luteinisierung punktierter Follikel festgestellt werden.
Im vorliegenden Versuch wird davon ausgegangen, dass die jeweiligen Brunstfollikel punktiert
wurden. Das entspricht der durch PETYIM et al. (2000) beschriebenen künstlichen Ovulation
per OPU. Die auch in diesem Versuch beobachtete C.l.-Bildung lässt vermuten, dass keine
Spontanovulation zur Luteinisierung erforderlich ist. Auch BERGFELT et al. (1994) und HAYA-
SHI et al. (2006) halten dies für möglich. BERGFELT et al. (1994) argumentieren, dass weder
die Follikelwand noch die Granulosazellen durch die Punktion derart beschädigt werden, dass
die Luteinisierungsvorgänge gestört ablaufen.
Physiologischerweise gehen der Spontanovulation und der folgenden Luteinisierung des Follikels
der LH-Peak voraus. Mit unzureichenden oder ausbleibenden LH-Peaks werden verspätete
Ovulationen und anovulatorische Zyklen sowie subfunktionale Gelbkörper in Verbindung
gebracht (LEE et al. 1988, RIEGER et al. 1989, BLOCH et al. 2006, HAYASHI et al. 2006). Ist
der LH-Peak jedoch einmal erfolgt, so findet laut HAYASHI et al. (2006) die Luteinisierung
unabhängig von der Ovulation in jedem Fall statt. Folglich wäre für eine erfolgreiche Luteinisierung
weniger eine Ovulation als die hormonelle Konstellation, insbesondere der LH-Peak,
essentiell. Im Gegensatz dazu beobachteten WISE et al. (1994) die Selbstluteinisierung von
Follikeln ohne vorherigen LH-Peak. Es ist bekannt, dass LH die Granulosa- und Thekazellen
stimuliert und sie auf die Luteinisierung vorbereitet (SMITH et al. 1994). Diese Vorgänge finden
bereits während der präovulatorischen Follikelentwicklung statt, die durch das Hormon LH wesentlich
mitgeprägt ist (SMITH et al. 1994, AERTS und BOLS 2010). Dies entspricht auch den
58

5.1 Zyklusverhalten während der OPU-Versuchsphase
Schlussfolgerungen von DIAZ et al. (2002), die das pulsatil ausgeschüttete LH als essentiell für
ein normales luteales Wachstum einstufen. So könnten funktionelle Gelbkörper durchaus auch
ohne einen LH-Peak entstehen.
Ob und wann in der vorliegenden Studie LH-Peaks stattgefunden haben, wurde nicht untersucht.
Dementsprechend lässt sich auch keine Aussage über die Notwendigkeit des LH-Peaks
für die Luteinisierung treffen. Inwiefern die oben erwähnten, durch OPU eventuell erhöhten
basalen FSH- und LH-Level die Luteinisierung begünstigen, bleibt ebenfalls offen.
Dass in einigen Fällen am Tage der Brunst unmittelbar vor der OPU-Session eine Spontanovulation
stattgefunden hat ist höchst unwahrscheinlich. Letztlich ist dies jedoch nicht vollständig
auszuschliessen, da durch die häufigen Punktionen im Abstand von 3-4 Tagen stets mehrere
blutgefüllte Follikel auf den Ovarien zu sehen waren. Ein kürzlich spontan rupturierter Follikel,
der sich anschließend mit Blut aufgefüllt hat, ist davon nicht zu unterscheiden.
5.1.2 Eigenschaften der gelbkörperähnlichen Gebilde
Die Progesteronproduktion der zu Beginn des Versuches bestehenden, natürlichen Gelbkörper
entspricht den Ergebnissen früherer Studien (SCHAMS et al. 1977, DIAZ et al. 1986, KASTELIC
et al. 1990, RIBADU et al. 1994, FIELDS und FIELDS 1996, SIANANGAMA und RAJAMAHEN-
DRAN 1996, TOM et al. 1998, HERZOG et al. 2010). Dagegen zeigten die während der OPU-
Versuchsphase induzierten, gelbkörperähnlichen Strukturen eine signifikant geringere mittlere
Progesteronproduktion (natürliches C.l. 4,6 ±1,9 ng/ml vs. induziertes C.l. 2,8 ±1,0 ng/ml,
P ≤0,05) bei einer Lebensdauer von 14,4 ±2,9 Tagen. Laut FORDE et al. (2011) dauert die
physiologische Lutealphase 14-18 Tage. Die im vorliegenden Versuch entstandenen induzierten
Gelbkörper liegen somit noch im physiologischen Bereich. Auch PETYIM et al. (2000) beschreiben
das Auftreten funktioneller C.l. mit geringerer oder normaler Progesteronproduktion und
normaler Lebensdauer nach Follikelpunktion. Ursache für die geringe Progesteronproduktion
könnte eine inadäquate präovulatorische Follikelentwicklung sein. SIANANGAMA und RAJA-
MAHENDRAN (1996) beobachteten bei induzierten C.l. eine geringere P4-Produktion, die, wie
in der vorliegenden Arbeit, ebenfalls mit einer geringeren C.l.-Größe einherging. Allerdings
wurden diese Gelbkörper durch hCG-Gaben zu unphysiologischen Zeitpunkten im Zyklus hervorgerufen.
Demgegenüber wurde im vorliegenden Versuchsaufbau keine hormonelle Manipulation
vorgenommen. Die OPU-Prozedur war der einzige artifizielle Einfluss. Veränderungen
des hormonellen Milieus sind dennoch nicht auszuschliessen, da Langzeit-OPU zu veränderten
P4-, LH- und FSH-Profilen führen kann (CARLIN et al. 1999). Immer wieder durch OPU ausgelöste
FSH-Schübe (PIETERSE et al. 1991b, BERGFELT et al. 1994, BONI et al. 1997, PETYIM
et al. 2000) führen zu einem beschleunigten Follikelwachstum (PETYIM et al. 2000, HAYASHI
et al. 2008), welches das Vorkommen der C.l. erklären könnte. Der Zeitpunkt der Luteinisierung,
normalerweise durch die Spontanovulation nach dem LH-Peak bestimmt, wird jedoch
durch die artifizielle Ovulation per OPU vorverlegt. Dementsprechend könnte die Luteinisierung
ohne vorherigen LH-Peak erfolgt sein. SMITH et al. (1994) bringen sowohl das präovulatorisch
ausgeschüttete FSH als auch LH mit den morphologischen, endokrinologischen und biochemischen
Vorgängen der Luteinisierung in Verbindung. Weiterhin zeigten DIELEMAN et al.
(1983), dass im Zeitfenster vom LH-Peak bis hin zur Ovulation wesentliche hormonelle und
59

5 Diskussion
strukturelle Veränderungen im präovulatorischen Follikel stattfinden. So konnte in der Phase
6-20h nach dem LH-Peak ein Größenwachstum der Granulosazellen belegt werden (DIELE-
MAN et al. 1983). Aus den Granulosazellen entstehen im weiteren Verlauf der Luteinisierung
die sogenannten large luteal cells [LLCs; MILVAE et al. (1991), NISWENDER et al. (2000)], deren
Progesteronproduktion wesentlich für die über längere Zeit hohen Serumprogesterongehalte
verantwortlich ist (MILVAE et al. 1991, DIAZ et al. 2002). Demnach könnte eine unzureichende
oder fehlende LH-Exposition oder eine verkürzte Zeit zwischen LH-Peak und künstlicher
Ovulation über die Beeinflussung der follikulären Zellen letztlich zu geringerer Progesteronproduktion
der induzierten C.l. führen.
Weiterhin zeigten die induzierten, gelbkörperähnlichen Gebilde eine signifikant geringere
Querschnittsfläche (nat. C.l. 246,7 ±56,0 mm 2 , ind. C.l. 140,6 ±55,9 mm 2 , P ≤0,05) als ihre
natürlichen Pendants. Verschiedene Autoren vermuten Zusammenhänge zwischen der Größe
des ovulatorischen Follikels und dem daraus resultierenden Gelbkörper (OUSSAID et al.
2000, VASCONCELOS et al. 2001, PERRY et al. 2005, ECHTERNKAMP et al. 2009, CERRI et al.
2011b). PERRY et al. (2005) stellten fest, dass eine GnRH-induzierte Ovulation bei Follikeln
≤ 11 mm eine geringere Fertilität in Bezug auf die Etablierung und Unterhaltung einer Trächtigkeit
durch geringe Progesteronwerte zur Folge hatte. Durch die Abstände der OPU-Sitzungen
von 3 bzw. 4 Tagen konnten die Follikel, aus denen die Gelbkörper entstanden, hier höchstens 4
Tage lang wachsen. Dies entspricht der Wachstumszeit der Follikel in einem 3-Welligen Zyklus
(SIROIS und FORTUNE 1988). Im vorliegenden Versuch stammten die induzierten Gelbkörper
vermutlich aus den jeweiligen Brunstfollikeln. Deren Größen variierten je nach Individuum von
9 mm bis 15 mm. In allen Fällen waren die Progesteronwerte und die gemessenen Querschnitte
jedoch geringer als im Vergleich zum vorhergehenden, natürlichen Gelbkörper. Ein Zusammenhang
mit der Größe der Brunstfollikel zum Zeitpunkt der Punktion ist daher nicht zu vermuten.
Die geringere Größe des C.l. könnte jedoch ebenfalls eine Folge der verkürzten finalen Wachstumsphase
des dominanten Follikels vor der induzierten Ovulation sein. Die Größe des C.l.
wird einerseits durch die Größe der LLC´s, andererseits über die Anzahl der Small Luteal Cells
(SLCs) determiniert (FARIN et al. 1986, NISWENDER et al. 2000). Deren Vorläuferzellen, die
Theka- und Granulosazellen, werden, wie oben schon beschrieben, durch LH stimuliert und beginnen
schon vor der Ovulation sich zu verändern. So könnte neben der Progesteronproduktion
auch die Größe des Gelbkörpers durch die intrafollikulären Vorgänge vor der Ovulation beeinflusst
werden. Anders als in den Studien von PIETERSE et al. (1991a), RIBADU et al. (1994),
OUSSAID et al. (2000), PERRY et al. (2005), CERRI et al. (2009), HERZOG et al. (2010), LÜTT-
GENAU et al. (2011), RIZOS et al. (2012) konnte kein statistischer Zusammenhang zwischen
der Größe der Gelbkörper und ihrer Progesteronproduktion hergestellt werden. Andere Studien
weisen allerdings darauf hin, dass nicht die Größe, sondern vielmehr Reife und Alter des
ovulatorischen Follikels die Steroidsynthesekapazitäten des resultierenden C.l. determinieren
(CERRI et al. 2011b).
Die Progesteronproduktion bzw. die Lebensdauer eines Gelbkörpers haben eine Schlüsselrolle
in der Regulation der Zykluslänge (NISWENDER et al. 2000). Sowohl die Zykluslänge als
auch die Länge der Lutealphasen beider beobachteter Zyklen zeigten keine statistisch signifikanten
Unterschiede. Verschiedene Autoren konnten zeigen, dass die luteale Funktionsdauer
sowie die Produktion von Progesteron weitgehend autoreguliert sind (ROTCHILD 1981, PATE
1988, 1996, SKARZYNSKI und OKUDA 1999, SKARZYNSKI et al. 2000, SCHAMS und BE-
60

5.2 Follikeleigenschaften, Eizellausbeute und Oozytenqualität
RISHA 2002, AROSH et al. 2004, KOTWICA et al. 2004, LISZEWSKA et al. 2005). Weiterhin
reguliert Progesteron die Lebensdauer des Gelbkörpers (SCHAMS und BERISHA 2002). Im vorliegenden
Fall war die Menge des produzierten Progesterons der induzierten, gelbkörperähnlichen
Strukturen im Mittel zwar geringer als die der natürlichen Gelbkörper, konnte jedoch
trotzdem die Aufrechterhaltung der Gelbkörperaktivität über eine physiologische Zeitspanne
hin gewährleisten.
Als subfunktional gelten C.l. mit normaler Lebensdauer und P4-Konzentrationen ≤1,5 ng/ml
an Zyklustag 10 (SCHRICK et al. 1992, BURNS et al. 1997, PETYIM et al. 2000) oder C.l.
mit normaler P4-Sekretion und kurzen Zykluslängen (PETYIM et al. 2000). Dies trifft auf die
hier induzierten, gelbkörperähnlichen Strukturen nicht zu. Daher ist davon auszugehen, dass
sich trotz zweimal wöchentlichem OPU Gelbkörper mit physiologischen Eigenschaften gebildet
haben, welche sich jedoch von ihren natürlichen Pendants entsprechend unterscheiden.
5.2 Follikeleigenschaften, Eizellausbeute und Oozytenqualität
Die mittlere Anzahl der punktierten Follikel pro OPU-Sitzung betrug 10,2 ±3,4 in der natürlichen
C.l.-Phase, 9,9 ±3,6 in der Follikelphase und 9,9 ±2,9 in der induzierten C.l.-Phase. Es
gab keinen statistischen Unterschied zwischen den einzelnen Zyklusphasen. Bezüglich der Anzahl
punktierter Follikel konnten andere Forschungsgruppen bei zweimal wöchentlichen OPU-
Sitzungen teilweise weniger (PETYIM et al. 2003, CHAUBAL et al. 2006, DE ROOVER et al.
2008, HANSTEDT 2009) und teilweise mehr Follikel (BONI et al. 1997, GARCIA und SA-
LAHEDDINE 1998, RAMOS et al. 2010) pro OPU-Session punktieren. Diese Variation in den
Punktionsergebnissen lässt sich auf den Einfluss des Individuums auf die Follikelanzahl zurückführen
(LANSBERGEN et al. 1995). Im Gegensatz zu den Ergebnissen von PETYIM et al.
(2000) konnte kein Einfluss der Zyklusphase auf die Follikelanzahl festgestellt werden. Dies
entspricht den Beobachtungen von DOMINGUEZ (1995) und BOEDIONO et al. (1995).
In Bezug auf die Anzahl der KOK pro OPU-Session konnten in dieser Arbeit ähnliche Ergebnisse
erzielt werden wie in den Arbeiten anderer Autoren (HANENBERG und VAN WAGTEN-
DONK-DE LEEUW 1997, PETYIM et al. 2000, 2003, CHAUBAL et al. 2006, LOPES et al. 2006,
DE ROOVER et al. 2008). RAMOS et al. (2010) und GALLI et al. (2001) erhielten mehr KOK pro
OPU-Session. Hier sei auf den nachgewiesenen Einfluss des Punkteurs auf die Eizellausbeute
hingewiesen (LANSBERGEN et al. 1995, MERTON et al. 2003). Weiterhin kann bei mehreren
wöchentlichen OPU-Sitzungen durch die erneute Punktion blutgefüllter, alter Follikel oder
durch das Durchstechen C.l.-ähnlicher Strukturen Blut in das Schlauchsystem gelangen, was
die Wiederauffindung von Eizellen im Punktat durch die Bildung von Blutkoagula erschwert
(PETYIM et al. 2000). Dies erklärt auch die in dieser Arbeit relativ geringen Wiederfindungsraten
[vergleiche auch PIETERSE et al. (1991b), PETYIM et al. (2003), CHAUBAL et al. (2006),
DE ROOVER et al. (2008)]. Ein Einfluss der Zyklusphase auf die Anzahl der KOK wurde, entsprechend
den Beobachtungen von BOEDIONO et al. (1995), nicht festgestellt.
Die Anzahl der IVP-tauglichen KOK entsprach den Ergebnissen anderer Autoren (LOPES
et al. 2006, HANSTEDT 2009). Im Hinblick auf die morphologische Qualität der gewonnenen
KOK zeigten sich ebenfalls keine Unterschiede zwischen den einzelnen Zyklusphasen. Auch
DE WIT et al. (2000), VASSENA et al. (2003) und PETYIM et al. (2003) konnten keine Unter-
61

5 Diskussion
schiede in der Eizellqualität bezogen auf den Zyklusstand des Donortieres feststellen. Ebenso
hatten die in jeder Zyklusphase auftretenden dominanten Follikel offenbar keinen Einfluss auf
die morphologische Qualität der KOK. Um, analog zu BOEDIONO et al. (1995), LANSBERGEN
et al. (1995), STUBBINGS und WALTON (1995) bzw. HENDRIKSEN et al. (2004) und CHAU-
BAL et al. (2006), einen Einfluss den Zyklusstandes oder eines dominanten Follikels auf die
Teilungs- und Entwicklungsraten sowie die Qualität der resultierenden Embryonen zu verifizieren,
wären weiterführende Untersuchungen mit einer vollständigen IVP notwendig.
5.3 MessengerRNA-Häufigkeiten in den OPU-Oozyten
Da verschiedene äussere Faktoren sich nicht immer auf das morphologische Erscheinungsbild
der Eizelle auswirken (HAGEMANN 1999, JEWGENOW et al. 1999, MERMILLOD et al. 1999,
COTICCHIO et al. 2004, FENG et al. 2007), wurde in den vergangenen Jahren der Fokus auf die
Veränderungen auf molekularer Ebene gerichtet. Dabei konnten verschiedene Gentranskripte
als Marker für Qualität und Entwicklungskompetenz identifiziert werden (WRENZYCKI et al.
2007). Bei der Interpretation von Daten aus der RT-PCR-Analyse ist jedoch zu beachten, dass
sich nicht alle Veränderungen in der mRNA-Expression auch auf funktionaler Ebene bzw. in
der Expression der Proteine wiederfinden.
Um einen möglichen Einfluss der Zyklusphase auf die Qualität bzw. die Entwicklungskompetenz
der Oozyten zu detektieren, wurden die mRNA-Häufigkeiten von vier qualitätsanzeigenden
Genen (GDF9, BMP15, SCL2A1, HIF2α) in den Eizellen der verschiedenen Zyklusphasen gemessen.
Oozyten der induzierten C.l.-Phase zeigten verringerte Transkriptmengen von GDF9,
HIF2α und BMP15. Der Glukosetransporter SCL2A1 war nicht verändert.
Ein verringerter GDF9-Gehalt wurde von verschiedenen Autoren mit einer verminderten Eizellqualität
in Verbindung gebracht (TAN und LU 1990, PAVLOK et al. 1992, BORDIGNON
et al. 1997, HUMBLOT et al. 2005). Die Untersuchungen von DONNISON und PFEFFER (2004)
ergaben eine verringerte Transkriptmenge in Eizellen aus Follikeln ≤ 2 mm gegenüber Follikeln
mit ≥ 5 mm. Auch in vitro gereifte Oozyten enthalten weniger GDF9 als in vivo gereifte
(LONERGAN et al. 2003a). Bei Mäusen konnten ausserdem Störungen der Kumuluszellfunktionen
bei veränderter GDF9-Expression nachgewiesen werden (YAN et al. 2001). Somit scheint
die GDF9-Expression ein Indikator für die Entwicklungskompetenz zu sein. In Bezug auf die
vorliegende Studie würde das bedeuten, dass Eizellen, die während der induzierten Gelbkörperphase
gewonnen wurden, eine geringere Entwicklungskompetenz aufweisen.
Bezüglich der BMP15-Expression in unreifen, in vivo gewonnenen Oozyten gibt es keine
vergleichbaren Studien. In Versuchen von EL-SAYED et al. (2006) enthielten Embryonen, die
sich nicht zu einem Kalb entwickelten, weniger BMP15 als solche, deren Entwicklung bis zum
gesunden Kalb vonstatten ging. Dies könnte einen Einfluss von BMP15 auf die Entwicklungskompetenz
des Embryos implizieren. Inwiefern schon der Gehalt der Oozyte an BMP15 für die
spätere embryonale Entwicklung relevant ist, bleibt jedoch offen.
Genprodukte des HIF2α-Gens sind an der Stressprotektion beteiligt. Eine Herunterregulation
der Genexpression, wie es hier der Fall ist, könnte sich dementsprechend negativ auf die
Anpassungsfähigkeit an das Reifungsmilieu und damit auf die In-vitro-Kompetenz auswirken.
62

5.3 MessengerRNA-Häufigkeiten in den OPU-Oozyten
Weiterhin wurde die Regulation anderer Gene durch HIF2α belegt (SEMENZA 1998, HARVEY
et al. 2007). Eine veränderte HIF2α-Expression könnte demnach weitreichende Konsequenzen
für das Entwicklungspotential haben.
Weiterhin wurden im Hinblick auf einen möglichen Einfluss von Progesteron auf die Eizellreifung
die Transkriptmengen der Progesteronrezeptoren PGR, PAQR5, PGRMC1 sowie
PGRMC2 ermittelt. Sämtliche Progesteronrezeptoren waren in den Oozyten der induzierten
Gelbkörperphase herunterreguliert.
Bezüglich des PGR ist bekannt, dass seine Expression durch umgebendes Progesteron in vitro
verändert wird (APARICIO et al. 2011). Ein Einfluss des Mikromilieus als Ursache für diese
Veränderung ist also zu vermuten. Reife Oozyten enthalten laut LUCIANO et al. (2010) und
SALHAB et al. (2011) mehr PGR als unreife, was auf eine aktive Transkription während der
Reifung hindeutet. Im vorliegenden Versuch wurden nur unreife Eizellen der Kategorien I-III
für die mRNA-Analyse genutzt. Ob eine geringere Ausgangsmenge an PGR, wie hier in den
Eizellen der induzierten Gelbkörperphase, durch eine höhere Transkription während der Reifung
kompensiert werden kann, ist fraglich. Falls nicht, könnte es nachhaltige Folgen für die
embryonale Entwicklung haben und somit auf eine geringere Entwicklungskompetenz hindeuten.
Der Rezeptor PAQR5 zeichnet sich durch eine hohe Bindungsaffinität zu P4 mit begrenzter
Kapazität aus (ZHU et al. 2003b). Ausserdem unterliegt er einer hormonellen Regulation (ZHU
et al. 2003b, CAI und STOCCO 2005). Die verringerte Expression könnte hier ein Ausdruck der
Regulation sein. Für ein tieferes Verständnis der zugrunde liegenden Regelkreise und eventuell
weitere beteiligte Hormone sind jedoch weitere Versuche notwendig. So bleibt in diesem Fall
unklar, ob der Rezeptor als eine Reaktion auf ein Überangebot an P4 vermindert exprimiert
wurde oder ob eine zur P4-Konzentration proportionale Expression zu einem früheren Zeitpunkt
vorliegt.
Auch die membranständigen Rezeptoren PGRMC1 und PGRMC2 sind in ihrer Expression
variabel (KOWALIK und KOTWICA 2008). Verschiedene Autoren (LUCIANO et al. 2010, SAL-
HAB et al. 2011) sprechen dem PGRMC1 eine Rolle bei der Reifung, genauer bei der Trennung
der Chromosomen, zu. Eine wie hier vorliegende verminderte Expression könnte den Ablauf
der Reifung stören und die Teilungs- und Entwicklungsraten verringern. Analog dazu wird dem
PGRMC2 eine Rolle bei der Blastulation zugeschrieben (LUCIANO et al. 2010). Veränderungen
in der Transkriptmenge könnten die embryonale Entwicklung empfindlich stören und zu
verminderten Blastozystenraten führen.
Allgemein ist noch zu wenig über die Progesteronrezeptoren, ihre Aufgaben und ihre Regulation
bekannt. Der Nachweis der P4-Rezeptoren in unreifen und reifen Eizellen lässt jedoch
eine Rolle von P4 bei den Reifungsvorgängen vermuten (APARICIO et al. 2011). Die Tatsache,
dass im vorliegenden Versuch sämtliche Veränderungen in den mRNA-Expressionsmustern bei
Oozyten der induzierten Gelbkörperphase vorlagen, wirft die Frage nach der Ursache auf. Ob
die verringerte P4-Produktion des induzierten Gelbkörpers und somit die geringerte periphere
P4-Konzentration diese Veränderungen bewirkt hat, kann nur vermutet werden. Nach wie vor
ist unklar, ob und wie peripher zirkulierendes P4 die Komposition der Follikelflüssigkeit beeinflusst.
Eine Analyse der endokrinologischen Situation im Follikel über die Follikelflüssigkeit
63

5 Diskussion
in Abhängigkeit von der Zyklusphase bzw. dem peripheren P4 könnte diesen Zusammenhang
klären.
Insgesamt werden deutliche Unterschiede in den Genexpressionsmustern der Eizellen aus den
verschiedenen Zyklusphasen deutlich. Diese lassen auf eine verminderte Qualität der Eizellen
der induzierten Gelbkörperphase schließen. Inwiefern die zyklusabhängigen Veränderungen des
peripheren P4 oder die endokrinologischen Veränderungen durch die OPU-Prozedur die veränderte
Genexpression bewirken und welche Folgen dies für die Entwicklungskompetenz hat,
bedarf weiterer Untersuchungen.
5.4 Progesteronsupplementation während der Eizellreifung
Bezüglich der Reifungsraten wurden keine statistischen Unterschiede zwischen den Oozyten
der einzelnen Gruppen festgestellt. Die Erlangung des Meiosestadiums II wird demnach durch
den Zusatz von Progesteron weder gestört noch gefördert. Dies entspricht den Ergebnissen von
FUKUI et al. (1982). SIROTKIN (1992) hingegen stellten einen positiven Einfluss von P4 auf die
Eizellmaturation fest. Diese unterschiedlichen Ergebnisse könnten eine Folge der Verwendung
unterschiedlicher Medien sein. So enthielt das IVM-Medium im Versuch von SIROTKIN (1992)
FCS.
Im vorliegenden Versuch waren die Teilungsraten in allen Gruppen konstant. Lediglich die
Entwicklungsraten der Gruppe < 50 ng/ml waren an Tag 7 und 8 signifikant verringert. Dies
widerspricht den Ergebnissen von SIROTKIN (1992), die bei P4-Supplementation (0,16 µmol/l,
0,8 µmol/l, 3,2 µmol/l, 16 µmol/l) einen positiven Effekt bezüglich der Oozytenreifung feststellen
konnten. Auch KARLACH (1987) stellten einen positiven Effekt auf die Teilungs- und Entwicklungsraten
fest. Die Studie von SILVA und KNIGHT (2000) hingegen ergab ebenfalls keine
Beeinflussung der Teilungsraten durch P4. Eine Konzentration von 0,3 µmol/l zeigte jedoch
einen negativen Einfluss auf die Entwicklungsrate. Die in der vorliegenden Studie verwendeten,
wesentlich höheren P4-Konzentrationen (0,93 µmol/l, 1,42 µmol/l) scheinen jedoch keinen
Einfluss auf die Teilungs- und Entwicklungsraten zu haben. Auch hier sei auf den Einfluss des
verwendeten Kulturmediums hingewiesen. FUKUI et al. (1982) beobachteten verschiedene Effekte
von Progesteron in Abhängigkeit vom eingesetzten Medium. Dementsprechend sollte beachtet
werden, dass das in den Versuchen von SILVA und KNIGHT (2000) verwendete Medium
Estrous Cow Serum (ECS) enthielt, während bei SIROTKIN (1992) FCS und im vorliegenden
Versuch BSA mit eCG und hCG benutzt wurden. In welchem Maße die eingesetzten Medien
die Progesteronwirkung beeinflussen, bleibt unklar.
Der P4-Gehalt des Mediums wurde in der vorliegenden Arbeit vor und nach der Reifung
gemessen und eine zur Ausgangskonzentration proportionale Reduktion der eingesetzten Konzentrationen
beobachtet. Dies deutet auf einen aktiven Progesteronstoffwechsel und eine Regulation
des Steroidmilieus durch die KOK hin. Es ist weithin akzeptiert, dass die Kumuluszellen
wichtige Aufgaben bei der Regulation des Mikromilieus während der Reifung übernehmen.
Sowohl die Synthese (MINGOTI et al. 2002, SCHOENFELDER et al. 2003, WANG
et al. 2006, NUTTINCK et al. 2008, APARICIO et al. 2011, SALHAB et al. 2011) als auch
die Fähigkeit zum Abbau (NUTTINCK et al. 2008) von P4 durch KOK sind belegt. Da in P4-
64

5.4 Progesteronsupplementation während der Eizellreifung
supplementierten Medienportionen, die ohne Oozyten für 24 h inkubiert wurden, keine Reduktion
der P4-Konzentration gemessen wurde, ist ein chemischer Zerfall auszuschließen.
5.4.1 Einfluss der Progesteronsupplementation auf die Genexpression
Von den hier untersuchten, qualitätsanzeigenden Gentranskripten SCL2A1, GDF9, BMP15 und
HIF2α waren lediglich GDF9 und HIF2α bei den mit P4 gereiften Oozyten signifikant verändert.
Die Expression des Glukosetransporters SCL2A1 zeigte im vorliegenden Versuch keine
statistischen Unterschiede zwischen den Oozyten der Versuchsgruppen bzw. im Vergleich zu
den unreifen Eizellen. Dies entspricht der Beobachtung anderer Autoren, die einen Anstieg des
Glukosestoffwechsels erst im 8- bis 16-Zellstadium beobachteten (JAVED und WRIGHT 1991,
RIEGER et al. 1992, KHURANA und NIEMANN 2000a). Eine Abnahme des Transkriptes, wie
sie durch LEQUARRE et al. (1997) beschrieben wurde, konnte hier nicht bestätigt werden. Allerdings
scheint das SCL2A1-Gen in seiner Expression durch die Reifungsumgebung beeinflusst
zu sein (GARDNER und KAYE 1995, SAGIRKAYA et al. 2007, VAN HOECK et al. 2011).
Bezüglich GDF9 konnte eine signifikant verringerte Menge des Transkriptes in den Progesteronruppen
gegenüber den unreifen Eizellen festgestellt werden. Der Vergleich der ohne Zusatz
gereiften Kontrollgruppe mit unreifen Oozyten ergab keinen Unterschied. Dies widerspricht den
Beobachtungen anderer Autoren, nach denen sich der Gehalt an GDF9 in den Oozyten während
der Maturation verringert (SOMFAI et al. 2011, CHU et al. 2012).
Die Expression von BMP15 war in Oozyten aller untersuchten Gruppen gleich. Ob dies einem
nicht vorhandenen Einfluss der Reifungsumgebung, einer fehlenden Transkription oder einem
fehlenden Verbrauch während der Reifung geschuldet ist, bleibt unklar. Zwar gibt es Hinweise
auf einen Einfluss der BMP15-Expression auf die Entwicklungskompetenz der Oozyte (HOSOE
et al. 2011), dieser könnte allerdings auch erst in den frühen Embryonalstadien relevant werden,
die hier nicht untersucht wurden.
Transkripte des HIF2α Gens wurden sowohl in den unreifen als auch den gereiften Oozyten
nachgewiesen, wobei die Oozyten der Gruppen 150 ng/ml, 300 ng/ml und 450 ng/ml im Vergleich
zu den unreifen Oozyten geringere Mengen des Transkriptes aufwiesen. Dies lässt einen
konzentrationsabhängigen Einfluss von Progesteron auf die Expression vermuten. Ein regulatorischer
Einfluss von HIF2α auf die Expression von SCL2A1 (WRENZYCKI et al. 1998, 2001,
HARVEY et al. 2004) wurde hier nicht offensichtlich.
Für die untersuchten Progesteronrezeptoren ergaben sich veränderte Transkripthäufigkeiten
im Hinblick auf den nukleären Progesteronrezeptor PGR, den membranständigen Progesteronrezeptor
PGRMC2 und PAQR5.
In Bezug auf PGR fällt zunächst die signifikant niedrigere Transkriptmenge in unreifen Oozyten
gegenüber den ohne Zusatz gereiften Oozyten auf. Dies spricht für eine aktive Transkription
während der Reifung. Auch SALHAB et al. (2011) beobachteten eine steigende mRNA-
Expression von PGR in Oozyten während der Maturation und berichten sogar von einer Überexpression
nach 10 h Reifung. In der Studie von CLEMENTE et al. (2009) zeigten hingegen
unreife Oozyten die höchste Expression von PGR. Unter Progesteroneinfluss gereifte Eizellen
enthielten signifikant weniger Transkripte des PGR-Gens. Offenbar ist die Expression des Re-
65

5 Diskussion
zeptors je nach Progesterongehalt der Reifungsumgebung variabel und wird dem Steroidmilieu
angepasst, in diesem Fall durch Herunterregulation. Dies entspricht den Ergebnissen von APA-
RICIO et al. (2011), die auf Proteinebene eine geringere Menge von PGR bei Progesteronzusatz
(100 ng/ml, 500 ng/ml) verzeichneten. Im Hinblick auf eine potenzielle Rolle bei der Blastozystenformation
(LUCIANO et al. 2010) könnte sich dies kritisch auf die Entwicklungsraten und
die weitere Embryonalentwicklung auswirken.
Von den membranständigen Progesteronrezeptoren unterlag der PGRMC1 in diesem Versuch
keiner Veränderung. Es konnte weder ein Unterschied zwischen unreifen und gereiften KOK
noch ein Einfluss der Medienzusätze festgestellt werden. Dies widerspricht den Ergebnissen
von CLEMENTE et al. (2009), die die höchste Transkriptmenge für PGRMC1 und PGRMC2
in unreifen Oozyten ermittelten und einen sinkenden Gehalt während Reifung und Fertilisation
beobachteten. LUCIANO et al. (2010) schreiben dem PGRMC1 eine bedeutende Rolle während
der Reifung, speziell bei der Trennung der Chromosomen, zu. Basierend auf dieser Annahme ist
zu folgern, dass Progesteron auf diesen Mechanismus wohl keinen erkennbaren Einfluss hat, da
das Meiose II-Stadium und damit die nukleäre Reifung in diesem Versuch bei allen Versuchsgruppen
unabhängig vom Progesteroneinfluss in gleichem Maße vollendet wurden. Etwaige
Veränderungen bezüglich der zytoplasmatischen Reifung wurden hier jedoch nicht untersucht.
Auch PGRMC2 soll laut (CLEMENTE et al. 2009) in der unreifen Oozyte zu seiner höchsten
Expression kommen und während der Reifung bis hin zur Aktivierung des embryonalen
Genoms weniger werden. Dies hat sich in der vorliegenden Studie nicht bestätigt. Es konnte
kein Unterschied zwischen unreifen und ohne Zusatz gereiften Oozyten festgestellt werden. Bei
P4-Supplementation zeigte sich jedoch bei allen eingesetzten Konzentrationen eine Herunterregulation
des Rezeptors. Da dem Rezeptor eine Rolle in der frühen embryonalen Entwicklung
zugeschrieben wird (LUCIANO et al. 2010), könnte dies wesentlichen Einfluss auf die Entwicklungsraten
und die Embryonenqualität haben.
Bezüglich PAQR5 konnten keine Unterschiede zwischen reifen und unreifen Oozyten festgestellt
werden. Dies spricht gegen eine Beteiligung an der Oozytenreifung, wie in anderen
Spezies belegt wurde (THOMAS et al. 2002, ZHU et al. 2003b, QIU et al. 2008). In allen Versuchsgruppen
mit P4 sowie der EtOH-Kontrolle war, verglichen mit unreifen Oozyten, eine
geringere Menge an PAQR5 vorhanden. Dies könnte einen Effekt des Alkohols auf die PAQR5-
Expression anzeigen.
Insgesamt scheinen die Prozesse der Eizellreifung während der IVM weitgehend vom Progesteron
unbeeinflusst abzulaufen. Auf molekularer Ebene führt Progesteron jedoch zu einschneidenden
Veränderungen in der Genexpression von GDF9, HIF2α sowie den Progesteronrezeptoren
PGR, PGRMC2 und PAQR5. Besonders letztere könnten durch ihre verringerte Expression
zu massiven Störungen in der frühen embryonalen Entwicklung führen und sich somit auf die
Embryonenqualität auswirken. Um die genauen Mechanismen sowie die Auswirkungen auf die
Embryonen und deren molekulare Struktur näher zu beschreiben, sind jedoch weitere Untersuchungen
notwendig.
66

5.5 Einfluss des Progesterons auf die Eizellqualität in vivo und in vitro
5.5 Einfluss des Progesterons auf die Eizellqualität in vivo und in
vitro
Trotz der unterschiedlichen Herkunft der Oozyten in den beiden Versuchsteilen lassen sich auf
Genexpressionsebene Parallelen erkennen. Sowohl GDF9 und HIF2α als auch die Progesteronrezeptoren
zeigen sich in beiden Fällen massiv beeinflusst. Progesteronzusatz während der
In-vitro-Maturation führt offensichtlich ebenso zu einer Herunterregulation dieser Transkripte
wie die induzierte Gelbkörperphase. Obwohl diesbezüglich noch weitere Untersuchungen notwendig
sind, deuten die Ergebnisse dieser Arbeit auf einen negativen Einfluss von P4 auf die
Entwicklungskompetenz der Eizelle hin.
5.6 Schlussfolgerungen
Aus den Ergebnissen dieser Arbeit lassen sich folgende Erkenntnisse festhalten:
Zweimal wöchentliches OPU
• stört den natürlichen Zyklus und das endokrinologische Profil
• kann zu C.l.-ähnlichen Strukturen führen
Der Zyklusstand des Tieres
• hat keinen Einfluss auf die Anzahl und Größenverteilung der Follikel
• hat keinen Einfluss auf Anzahl oder Morphologie der Oozyten
• beeinflusst die mRNA-Expression entwicklungsrelevanter Gene und somit die Entwicklungskompetenz
der Oozyten
Eine Progesteronsupplementation während der IVM
• hat keinen Einfluss auf die Eizellreifung
• führt zu veränderten Genexpressionsmustern in den reifen Oozyten
• verringert die Entwicklungsraten in der IVP
5.7 Kritische Würdigung der Arbeit
Die Eignung des Versuchsaufbaues für die Fragestellung der Arbeit soll hier kritisch betrachtet
werden. Das OPU-Verfahren gilt allgemein als einfaches, wiederholbares und minimal invasives
Verfahren zur Gewinnung von Eizellen, welches die Gesundheit des Tieres weitestgehend
unbeeinflusst lässt (siehe auch Kap. 2.1.1 und 2.2). Da ohne hormonelle Stimulation gearbeitet
werden kann, lässt sich die Eizelle aus ihrer physiologischen Umgebung heraus gewinnen
und betrachten. Die regelmässige Anwendung der OPU-Prozedur bewirkt jedoch offensichtlich
einschneidende Veränderungen im endokriologischen Profil (siehe Kap. 5.1.1), sodass in der
Folge keine physiologische Situation mehr vorliegt. Die Veränderungen in der Genexpression
der OPU-Oozyten könnten dementsprechend auch eine Folge des Eingriffes in die physiologischen
Vorgänge durch das OPU sein. Die Ergebnisse beim OPU sind in hohem Maße von
67

5 Diskussion
der durchführenden Person abhängig (MERTON et al. 2003). Um die Variation gering zu halten
wurden die OPU-Sessions immer von derselben Person durchgeführt. Um die hier vorgestellten
Ergebnisse zu untermauern oder zu ergänzen, könnte eine Gewinnung und Analyse von Follikelflüssigkeit
aufschlussreich sein. Leider ist es mit dem OPU-Equipment verfahrenstechnisch
noch nicht möglich, aus einem Follikel sowohl die Eizelle als auch die Follikelflüssigkeit zu
gewinnen, da zur Lösung der Eizelle von der Follikelwand ein Unterdruck nötig ist, der zur Vaporisierung
der sehr geringen Mengen an Follikelflüssikeit führt [vgl. auch HANSTEDT (2009)].
Einen der wichtigsten Einfluss nehmenden Faktoren stellt in der IVP die Komposition der
Medien in den einzelnen IVP-Schritten dar. Im vorliegenden Versuch wurde dem auf TCM199
basierenden Medium unter anderem die semi-definierte Komponente BSA zugesetzt. Um zu
prüfen, ob die beobachteten Effekte sich tatsächlich auf das zugegebene P4 bezogen, wurden
zu allen Zeitpunkten (vor der IVM, nach der IVM mit/ohne Eizellen) Kontrollen der Medien
bezüglich unerwünschter Progesterongehalte untersucht. Die Reifungskontrollen und Entwicklungsraten
der Kontrollgruppen lassen auf eine ausreichende Versorgung der Eizellen bzw. Embryonen
schließen. Es bleibt jedoch offen, inwiefern die zytoplasmatische Reifung durch P4
beeinflusst wird.
Die real-time RT-PCR ist die bevorzugte Methode für die Ermittlung quantitativer mRNA-
Expression in kleinen Probenmengen wie Oozyten und präimplantatorische Embryonen (GÁL
et al. 2006), da sie die Ermittlung der exakten Menge der Transkripte erlaubt. Die RT-PCR
hingegen ermöglicht lediglich den Vergleich der relativen Menge einer mRNA zwischen verschiedenen
Proben, da die Effizienz der Amplifikation für die Primer in den einzelnen Zyklen
nicht bekannt ist (TEMELES et al. 1994). Um etwaige Schwankungen durch die durchführende
Person zu vermeiden, wurden die PCR-Analysen von einer erfahrenen Mitarbeiterin durchgeführt.
Die ausgewählten qualitätsanzeigenden Gene haben sich in ihrer Expression bereits von
unterschiedlichen Faktoren beeinflusst gezeigt (WRENZYCKI et al. 2007). Bei der Interpretation
von Daten aus der PCR-Analyse ist jedoch zu beachten, dass eine Relevanz auf funktioneller
Ebene (Proteinebene) nur angenommen werden kann [vgl. auch DRALLMEYER (2008)].
Die hier analysierten OPU-Oozyten stellen weiterhin eine relativ kleine Stichprobenmenge
dar. Zum Zeitpunkt des höchsten, des niedrigsten und wiederum des höchsten Progesteronwertes
gewonnen, sind diese Eizellen auch als eine Momentaufnahme zu betrachten. Die jeweilige
Zyklusphase umfasst jedoch längere Zeiträume mit ansteigenden und wieder abfallenden P4-
Werten. Um ein vollständiges Bild zu erhalten und zu beurteilen, ob und zu welchem Zeitpunkt
das periphere P4 sich auf die Eizelle auswirkt, wäre eine umfassendere Analyse einer größeren
Anzahl von Oozyten aus dem gesamten Zyklus notwendig. Hier wäre eventuell auch die jeweilige
Größe des Follikels, aus dem die Eizelle stammt, interessant, da in Abhängigkeit der Größe
ein unterschiedliches follikuläres Mikromilieu (KRUIP und DIELEMAN 1985) die jeweilige Oozyte
beeinflusst. Je nach follikulärem Entwicklungsstadium unterscheiden sich die Eizellen in
ihrer Qualität (TAN und LU 1990, PAVLOK et al. 1992, LONERGAN et al. 1994, RIZOS et al.
2002). Es wäre also möglich, dass Progesteron zu verschiedenen Zeitpunkten der follikulären
Entwicklung unterschiedlich auf die Eizelle und ihre Qualität einwirkt.
68

6 Zusammenfassung
Nicole Schlüter
Einfluss unterschiedlicher Progesteronkonzentrationen auf die Oozytenmaturation in vivo und
in vitro
In dieser Arbeit sollte der Einfluss verschiedener Progesteronkonzentrationen auf die Eizellreifung
untersucht werden. Dazu wurden im ersten Versuchsteil Oozyten mittels der OPU-
Methode in unterschiedlichen Zyklusstadien gewonnen. Als Beginn des Versuches wurde Tag
7 (Brunst=Tag 0) des Zyklus gewählt. Einer morphologischen Beurteilung der erhaltenen KOK
folgte eine Analyse der mRNA-Expression hinsichtlich GDF9, BMP15, SCL2A1, HIF2α, PGR,
PGRMC1, PGRMC2 und PAQR5. Weiterhin fand eine Analyse des Serumprogesterongehaltes
an bei jeder OPU-Session entnommenen Blutproben statt.
Alle Versuchstiere zeigten trotz zweimal wöchentlichem Absaugen aller Follikel > 2mm
einen physiologischen Zyklus mit Bildung von C.l. (ind. C.l.) während des Versuchszeitraumes.
Diese Gelbkörper zeichneten sich durch eine geringere Größe (ind. C.l. 140,6 ±155,9 mm 2 , nat.
C.l. 246,7 ±56,0 mm 2 ; P ≤0,05) sowie eine geringere P4-Produktion (ind. C.l. 2,8 ±1,0 ng/ml,
nat. C.l. 4,6 ±1,9 ng/ml; P ≤0,05) gegenüber den natürlich entstandenen, zu Beginn des OPU-
Versuches bestehenden C.l. (nat.C.l.), aus. Der Zyklusstand beeinflusste weder die Follikelanzahl
und -größe noch die Eizellausbeute und -qualität. Hinsichtlich der mRNA-Expression bestand
eine verringerte Transkriptmenge von GDF9, BMP15, HIF2α, PGR, PGRMC1, PGRMC2
und PAQR5 bei Eizellen aus der induzierten Gelbkörperphase.
Im zweiten Versuchsteil wurden aus Schlachthofovarien gewonnene KOK unter Zugabe verschiedener
P4-Konzentrationen (< 50 ng/ml, 150 ng/ml, 300 ng/ml, 450 ng/ml) in vitro gereift
und einer vollständigen IVP unterzogen. Gereifte Oozyten der Versuchsgruppen wurden hinsichtlich
der Erlangung des Meiose II-Stadiums beurteilt und ebenfalls mittels RT-qPCR auf
die Expression der oben genannten Gene untersucht.
Die unterschiedlichen Progesteronzusätze zeigten keinen Einfluss auf die Reifung und die
Teilungsraten. Die Entwicklungsraten der Gruppe < 50 ng/ml waren an Tag 7 (10,7 ±5,4 %) und
8 (15,8 ±5,4 %) gegenüber der zusatzfreien Kontrollgruppe (d7: 20,7 ±6,6 %, d8: 25,4 ±8,0 %)
signifikant verringert. Unter Progesteroneinfluss gereifte Oozyten zeigten im Vergleich zu unreifen
Oozyten eine signifikant verringerte Expression von GDF9, HIF2α, PGR, PGRMC2 und
PAQR5.
Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit festgestellt werden, dass zweimal wöchentliche
OPU-Sessions den natürlichen Zyklus beeinflussen und die Bildung von C.l. mit veränderten
Eigenschaften verursachen kann. Die Ergebnisse des OPU sowie die morphologischen Eigenschaften
der KOK sind vom Zyklusstand unbeeinflusst, es gibt jedoch Veränderungen auf molekularer
Ebene, die sich negativ auf die Entwicklungskompetenz auswirken können.
69

6 Zusammenfassung
Die hier untersuchten Parameter zur In-vitro-Reifung von Oozyten zeigten sich durch die Anwesenheit
von Progesteron nicht beeinflusst. Allerdings führt die Progesteronexposition während
der Reifung zu einer veränderten Genexpression, die sich negativ auf die embryonale Entwicklung
auswirken kann.
70

7 Summary
Nicole Schlüter
Influence of different progesterone concentrations on bovine oocyte maturation in vivo and in
vitro
The influence of different progesterone concentrations on oocyte maturation was investigated.
In the first part of the experiments oocytes were retrieved by twice-weekly OPU. The first
OPU-session was performed on day 7 of the natural cycle (oestrus = day 0). Cumulus-oocytecomplexes
(COC) were classified by morphological criteria and mRNA expression of GDF9,
BMP15, SCL2A1, HIF2α, PGR, PGRMC1, PGRMC2 und PAQR5 was measured via RT-qPCR.
Bloodsamples were taken at every OPU-session and serum progesterone levels measured by
radioimmunoassey (RIA).
Despite twice weekly removal of all follicles > 2mm from the ovaries all animals showed
a natural cycle and formation of C.l. (induced C.l.) during the OPU period. Induced C.l. were
smaller (ind. C.l. 140,6 ±55,9 mm 2 , nat. C.l. 246,7 ±56,0 mm 2 ; P ≤0,05) and produced less
progesterone (ind. C.l. 2,8 ±1,0 ng/ml, nat. C.l. 4,6 ±1,9 ng/ml; P ≤0,05) than their natural
counterparts at the beginning of the experiment. There was neither an influence of the cycle on
number or size of follicles nor on number and quality of retreived oocytes. Messenger RNA
expression levels showed a reduced abundance of GDF9, BMP15, HIF2α, PGR, PGRMC1,
PGRMC2 und PAQR5 transcripts in oocytes of the induced c.l.-phase.
In the second part of the experiments oocytes from slaughterhouse ovaries were matured in
vitro with different progesterone concentrations (< 50 ng/ml, 150 ng/ml, 300 ng/ml, 450 ng/ml)
followed by in vitro production of embryos. Matured oocytes were rated for meiosis II stages
and the expression of GDF9, BMP15, SCL2A1, HIF2α, PGR, PGRMC1, PGRMC2 und PAQR5
was measured.
There was no influence of progesterone on maturation and cleavage rates. Oocytes of the
< 50 ng/ml group showed a significant reduction of developmental rates on day 7 and 8 when
compared to those of the control group (d7: 10,7 ±5,4 % vs. 20,7 ±6,6 %; d8: 15,8 ±5,4 %
vs. 25,4 ±8,0 %). Oocytes from all progesterone treatment groups contained less transcripts of
GDF9, HIF2α, PGR, PGRMC2 und PAQR5 compared to immature oocytes.
In conclusion, twice-weekly OPU has an influence on the natural cycle in cattle and may
induce C.l.s with different characteristics. The cycle has no influence on OPU results and morphological
quality of COC. There are alterations in the molecular structure of the oocyte that
may influence their developmental competence.
Supplementation of progesterone did not show an influence on oocyte maturation and cleavage
rates. Gene expression in oocytes matured in progesterone supplemented medium was
altered and may have negative effects on early embryonic development.
71

A Medien und Chemikalien
A.1 Medien für das OPU
Tabelle A.1: Zusammensetzung der PBS-Lösung
Substrat Einheit Menge Firma Produkt-Nr.
Dulbecco´s phosphate buffered saline g/l 9,7 Sigma-Aldrich D 5773
Penicillin IE/ml 50,0 Sigma-Aldrich PENK
Streptomycinsulfat µg/ml 50,0 Sigma-Aldrich S 6501
Natrium-Pyruvat µg/ml 36,0 Sigma-Aldrich P 3662
D-Glukose mg/ml 1,0 Riedel-deHaen 16301
CaCl 2 xH 2 O µg/ml 133,0 Sigma-Aldrich C4901
Tabelle A.2: Zusätze für die PBS-Gebrauchslösung (PBS Complete)
Substrat Einheit Menge Firma Produkt-Nr.
Heparin IE/ml 2,2 Serva 24900
BSA (Fraktion V) mg/ml 1,0 Sigma-Aldrich A 9647
A.2 Medien für die IVP
PBS-Lösung: siehe oben
Tabelle A.3: Zusammensetzung des TCM air
Substrat Einheit Menge Firma Produkt-Nr.
TCM199 g/100 ml 1,5 Sigma-Aldrich M 2520
Gentamycinsulfat mg/100 ml 5,0 Sigma-Aldrich G 3632
Na-Pyruvat mg/100 ml 2,2 Sigma-Aldrich P 3662
NaHCO 3 mg/100 ml 35,0 Riedel-deHaen 31437
ad. X ml H 2 O ml 100,0 Fresenius Ampuwa
BSA (FAF) mg/100 ml 100,0 Sigma-Aldrich A 7030
Tabelle A.4: Zusammensetzung der NaCl-Lösung
Substrat Einheit Menge Firma Produkt-Nr.
NaCl g 9,0 Sigma-Aldrich S 5886
Aqua bidest. l 1
73

A Medien und Chemikalien
Tabelle A.5: Zusammensetzung der NaCl-Complete-Lösung
Substrat Einheit Menge Firma Produkt-Nr.
NaCl g 9,0 Sigma-Aldrich S 5886
Aqua bidest. l 1
Penicillin g 0,06 Sigma-Aldrich P 3414
Tabelle A.6: Zusammensetzung des Reifungsmediums
Substrat Einheit Menge Firma Produkt-Nr.
TCM199 g/100 ml 1,51 Sigma-Aldrich M 2520
Gentamycinsulfat mg/100 ml 5,0 Sigma-Aldrich G 3632
Natrium-Pyruvat mg/100 ml 2,2 Sigma-Aldrich P 3662
NaHCO 3 mg/100 ml 35,0 Riedel-deHaen 31437
ad. X ml H 2 O ml 100,0 Fresenius Ampuwa
BSA (FAF) mg/100 ml 100,0 Sigma-Aldrich A 7030
PMSG IE/ml 10,0 Intervet Suigonan
HCG IE/ml 5,0 Intervet Suigonan
Tabelle A.7: Zusammensetzung der FertTALP-Stocklösung
Substrat Einheit Menge Konzentration Firma Produkt-
(mM)
Nr.
NaCl mg/100 ml 665,8 114,0 Sigma-Aldrich S 5886
KCl mg/100 ml 23,9 3,2 Sigma-Aldrich P 5405
NaHCO 3 mg/100 ml 210,0 25,0 Riedel-deHaen 31437
NaH 2 Po 4 x H 2 O mg/100 ml 4,1 0,3 Merck 1.065.800.500
CaCl 2 x 2 H 2 O mg/100 ml 29,4 2,0 Sigma-Aldrich C 4901
MgCl 2 mg/100 ml 4,8 0,5 Sigma-Aldrich M 8266
Phenolrot mg/100 ml 1,0 0,01 µl/ml Sigma-Aldrich P 5530
Penicillamin mg/100 ml 0,3 20,0 Sigma-Aldrich P 4875
Na-Laktat 60 % mg/100 ml 186,0 10,0 Sigma-Aldrich L 4263
ad. X ml H 2 O ml 100,0 Fresenius Ampuwa
Tabelle A.8: Zusammensetzung der FertTALP-Gebrauchslösung
Substrat Einheit Menge Firma Produkt-Nr.
FertTALP-Stocklösung ml 10,14
Gentamycinsulfat µg 50 Sigma-Aldrich G 3632
BSA (Fraktion V) mg 60,0 Sigma-Aldrich A 9647
Na-Pyruvat µg 280,0 Sigma-Aldrich P 3662
74

A.2 Medien für die IVP
Tabelle A.9: Zusammensetzung der Epinephrin-Lösung
Substrat Einheit Menge Firma Produkt-Nr.
Epinephrin mg 1,83 Sigma-Aldrich E 4250
Na-Metabisulfit mg 40,00 Fluka 71928
Na-Laktat (60 %) mg 132,0 Sigma-Aldrich L 4263
H 2 O ml 40,0 Fresenius Ampuwa
Tabelle A.10: Zusammensetzung der Hypotaurin-Lösung
Substrat Einheit Menge Firma Produkt-Nr.
Hypotaurin mg 1,09 Sigma-Aldrich H 1384
H 2 O ml 10,0 Fresenius Ampuwa
Tabelle A.11: Zusammensetzung der Heparin-Lösung
Substrat Einheit Menge Firma Produkt-Nr.
Heparin mg 2,82 Serva 24900
H 2 O ml 10,0 Fresenius Ampuwa
Tabelle A.12: Zusammensetzung der HHE-Stocklösung
Substrat Einheit Menge Firma Produkt-Nr.
Hypotaurin-Lsg. ml 10,0
Epinephrin-Lsg. ml 4,0
H 2 O ml 26,0 Fresenius Ampuwa
Tabelle A.13: Zusammensetzung der HHE-Gebrauchslösung
Substrat Einheit Menge
HHE-Stocklsg. µl 80,0
Heparin-Lsg. µl 40,0
Tabelle A.14: Zusammensetzung des Fertilisationsmediums
Substrat Einheit Menge
HHE-Gebrauchslsg. µl 120,0
FertTALP-Gebrauchslsg. ml 2,0
75

A Medien und Chemikalien
Tabelle A.15: Zusammensetzung der Spermfilter-Gebrauchslösung
Substrat Einheit Menge Firma Produkt-Nr.
Spermfilter µl 900,0 Gynemed 3SF0010
FertTalp-Gebrauchslsg. µl 100
Tabelle A.16: Zusammensetzung der SOF-Stocklösung A
Substrat Einheit Menge Konzentration Firma Produkt-
(mM)
Nr.
NaCl g/100 ml 6,3 108,0 Sigma-Aldrich S 5886
KCl g/100 ml 0,5 7,2 Sigma-Aldrich P 5405
KH 2 PO 4 g/100 ml 0,2 1,2 Sigma-Aldrich P 5655
MgSO 4 g/100 ml 0,2 1,5 Sigma-Aldrich M 2643
H 2 O ml 98,4 Sigma-Aldrich W 1503
Na-Laktat ml 0,6 4,2 Sigma-Aldrich l 4263
Tabelle A.17: Zusammensetzung der SOF-Stocklösung B
Substrat Einheit Menge Konzentration Firma Produkt-
(mM)
Nr.
NaHCO 3 g/100 ml 2,10 25,0 Sigma-Aldrich S 4019
Phenolrot g/100 ml 0,01 10 mg/100 ml Sigma-Aldrich P 5530
H 2 O ml 100,00 Sigma-Aldrich W 1503
Tabelle A.18: Zusammensetzung der SOF-Stocklösung C
Substrat Einheit Menge Konzentration Firma Produkt-
(mM)
Nr.
Na-Pyruvat mg 80,0 0,73 Sigma-Aldrich P 3662
H 2 O ml 10,00 Sigma-Aldrich W 1503
Tabelle A.19: Zusammensetzung der SOF-Stocklösung D
Substrat Einheit Menge Konzentration Firma Produkt-
(mM)
Nr.
CaCl 2 x 2 H 2 O mg 262,0 1,78 Sigma-Aldrich C 7902
H 2 O ml 10,00 Sigma-Aldrich W 1503
76

A.3 Medien für die Reifungskontrolle
Tabelle A.20: Zusammensetzung der Glutamin-Stocklösung
Substrat Einheit Menge Firma Produkt-Nr.
Glutamin mg 292,0 Sigma-Aldrich G 6392
H 2 O ml 10,00 Sigma-Aldrich W 1503
Tabelle A.21: Zusammensetzung des Kulturmediums (SOFaa-Medium)
Substrat Einheit Menge Konzentration Firma Produkt-
(mM)
Nr.
myo-Inositol mg 50,0 2,77 Sigma-Aldrich I 7508
tri-Na-Zitrat mg 10,0 0,34 Sigma-Aldrich S 4641
Gentamycin mg 5,0 50 µg/ml Sigma-Aldrich G 3632
H 2 O ml 78,0 Sigma-Aldrich W 1503
SOF-Stocklsg. A ml 10,0
SOF-Stocklsg. B ml 10,0
SOF-Stocklsg. C ml 1,0
SOF-Stocklsg. D ml 1,0
Glutamin-Stocklsg. µl 100,0 4,2
BME 50x ml 3,0 10 µg/ml Sigma-Aldrich B 6766
MEM 100x ml 1,0 30 µg/ml Sigma-Aldrich M7145
A.3 Medien für die Reifungskontrolle
Tabelle A.22: Zusammensetzung der Fixierlösung
Substrat Einheit Menge Firma Produkt-Nr.
Essigsäure 100 % ml 20 Carl Roth GmbH 3738.1
Ethanol ≥99,8 % ml 60 Carl Roth GmbH 9065.1
Tabelle A.23: Zusammensetzung der Lacmoid-Stocklösung
Substrat Einheit Menge Firma Produkt-Nr.
Lacmoid g 1 Sigma-Aldrich 274720-10G
Essigsäure 100 % ml 45 Carl Roth GmbH 3738.1
Tabelle A.24: Zusammensetzung der Lacmoid-Arbeitslösung
Substrat Einheit Menge
Lacmoid-Stocklösung ml 5
H 2 O bidest. ml 5,5
77

A Medien und Chemikalien
Tabelle A.25: Zusammensetzung des PVA 0,1 %
Substrat Einheit Menge Firma Produkt-Nr.
Polyvinylalkohol mg 10 Sigma-Aldrich P8136-250G
PBS-Stocklösung ml 100
A.4 Medien für den Radioimmunoassay
Tabelle A.26: NaCl-Lösung
Substrat Einheit Menge Firma Produkt-Nr.
NaCl g 0,9 Sigma-Aldrich S 5886
H 2 O bidest. ml 100
Tabelle A.27: Boratpuffer
Substrat Einheit Menge Firma Produkt-Nr.
NaCl-Lösung 0,9%ig 1 l
Borax wasserfrei g 4,02 Fluka 71996-250G
A.5 Medien für die RT-qPCR
Tabelle A.28: Herkunft der bei der RT-PCR eingesetzten Medien
Substanz Firma Produkt-Bez.
MgCl 2 Invitrogen 18067-017
PCR-Puffer Invitrogen 1867-017
dNTPs Eurogentec NU-0010-50
Primer Applied Biosystems
RNAse-Inhibitor Applied Biosystems N8080119
MuLV RT Applied Biosystems N8080018
mRNA Globin Sigma-Aldrich R1253-20UG
Master-Mix RT-qPCR Eurogentec
H 2 O Fresenius Ampuwa
Tabelle A.29: Tris-HCl
Substanz Konzentration pH
Tris-HCL 10 mM 7,5
78

A.5 Medien für die RT-qPCR
Tabelle A.30: Lysis/Bindingpuffer
Substanz Konzentration pH
Tris-HCL 100 mM 7,5
LiCl
500 mM
EDTA 10 mM 8,0
LiDS
1 %ig
DTT(Dithiothreitol) 5 mM
Tabelle A.31: Waschpuffer A
Substanz Konzentration pH
Tris-HCL 10 mM 7,5
LiCl 0,15 mM
EDTA 1 mM 8,0
LiDS 1 %ig
Tabelle A.32: Waschpuffer B
Substanz Konzentration pH
Tris-HCL 10 mM 7,5
LiCl 0,15 mM
EDTA 1 mM 8,0
Tabelle A.33: Zusammensetzung des Mastermixes für die Reverse Transkription
Komponente Volumen Endkonzentration
10 x PCR Puffer 2 µl 1 x
MgCl 2 (50 mM) 2 µl 5 mM
dNTPS (10mM) 2 µl 1 mM
Hexamer Primer (50 µM) 1 µl 2,5 µM
RNase Inhibitor (20IE/µl) 1 µl 20 U
Reverse Transkriptase (50IE/µl) 1 µl 50 U
Tabelle A.34: Zusammensetzung des Reaktionsgemisches für die RT-qPCR
Komponente Konzentration einfacher Ansatz
Master-Mix RT-qPCR 10 µl
Primer Forward 0,2 µM 0,4 µl
Primer Reverse 0,2 µM 0,4 µl
cDNA 2-0,25 µl
H 2 0 ad 20 µl
79

B Verzeichnis der Gesamtdaten
B.1 Daten aus dem OPU-Versuch
Tabelle B.1: C.l.-Eigenschaften und Serumprogesteronwerte von „Betty1“; Versuchsstart
unklar, nicht gewertet
Datum Zyklustag
Blutprobe
C.l.
Nr. P4 ng/ml Ovar Größe (cmxcm) Homogenität Hohlraum (cm)
28.01.2010 8 3 7 links 2 x 2,5 ja nein
01.02.2010 12 5 4,1 links 2 x 1,5 ja nein
04.02.2010 15 8 0,7 links 2 x 1,5 ja nein
08.02.2010 19/1 11 0,2 links 2 x 1,0 ggr. Inhomogen nein
11.02.2010 22/4 14 0,5 links 1,5 x 1,5 ggr. Inhomogen nein
15.02.2010 26/8 18 2,8 links 1,5 x 1,5 inhomogen 0,5
18.02.2010 29/11 22 3,4
22.02.2010 33/15 26 6,3 (rechts?) (1,5 x 1) (inhom.) nein
25.02.2010 36/18 31 3,7
Tabelle B.2: C.l.-Eigenschaften und Serumprogesteronwerte von „Crazy1“
Datum Zyklustag
Blutprobe
C.l.
Nr. P4 ng/ml Ovar Größe (cmxcm) Homogenität Hohlraum (cm)
25.01.2010 8 1 3,1 links 2 x 1,5 ja nein
28.01.2010 11 2 4,6 links 2 x 1,5 ja nein
01.02.2010 15 4 4,1 links 2 x 2,5 ja nein
04.02.2010 18 7 4,4 links 2 x 1,5 ggr. Inhomogen nein
08.02.2010 22/1 10 0,1 links 1 x 1,5 ja nein
11.02.2010 25/4 13 0,1 0
15.02.2010 29/8 17 0,7 0
18.02.2010 32/11 21 1,0 0
22.02.2010 36/15 25 2,5 0
25.02.2010 39/18 30 1,4 0
Tabelle B.3: C.l.-Eigenschaften und Serumprogesteronwerte von "Frieda1a“; nicht gewertet,
C.l. aus Zyste
Datum Zyklustag
Blutprobe
C.l.
Nr. P4 ng/ml Ovar Größe (cmxcm) Homogenität Hohlraum (cm)
18.02.2010 6 24 1,9 rechts 2x1,5 ja 0,7 cm
22.02.2010 10 28 0,9 rechts 1,5 x 1,5 inhomogen 0,2 cm
25.02.2010 13/1 33 0,1 rechts 1 x 1 inhomogen 0
01.03.2010 17/5 36 1 links??? 1,5 x 1,5 ja 0,5
04.03.2010 20/8 39 2,7 links 2 x 1 ggr. Inhomogen nein
08.03.2010 24/12 42 3,3 links 2 x 2 ja 0,1
11.03.2010 27/15 44 4,8 links 2 x 1,7 ja nein
15.03.2010 31/19 45 1,7 links 1,5 x 1,5 ja 0,1
81

B Verzeichnis der Gesamtdaten
Tabelle B.4: C.l.-Eigenschaften und Serumprogesteronwerte von „Frieda1b“
Datum Zyklustag
Blutprobe
C.l.
Nr. P4 ng/ml Ovar Größe (cmxcm) Homogenität Hohlraum (cm)
25.03.2010 7 54 1,4 links 1,5 x 1,5 ja 0,2
29.03.2010 11 57 2,2 links 1 x 1; 1,5 x 1,5 ja;ja nein; nein
01.04.2010 14 60 2,1 links 1,5 x 1,5; 1x1,5 ja;ja nein; nein
05.04.2010 18 63 1,2 links 1,5 x 1,5 inhomogen nein
08.04.2010 21 66 0,1 links 1 x 1; 1x1 inhomogen nein
12.04.2010 25/1 69 0,2 0
15.04.2010 28/4 72 0,6 rechts 0,8 x 0,8 ja 0,2
19.04.2010 32/8 75 1 rechts 1 x 1 ja 0,2
22.04.2010 35/11 78 1,3 rechts 1 x 1 ja 0,2
26.04.2010 39/15 79 1,8 rechts 0,8 inhomogen nein
29.04.2010 42/18 80 0,1 rechts 0,5 x 0,5 Rest-CL
Tabelle B.5: C.l.-Eigenschaften und Serumprogesteronwerte von „Hera1a“, Durchgang
wegen C.l.-Bildung abgebrochen
Datum Zyklustag
Blutprobe
C.l.
Nr. P4 ng/ml Ovar Größe (cmxcm) Homogenität Hohlraum (cm)
01.02.2010 7 6 2,9 links 1 x1,5 ja nein
04.02.2010 10 9 4,7 links 1 x 1,5 ja 0,4
08.02.2010 14 12 6,3 links/links 1 x1 ,5 / 1 x 1 ja nein
11.02.2010 17 15 4,9 links/links 1,5x1,5/1x1 ja nein
15.02.2010 21/0 19 0,5 0
Tabelle B.6: C.l.-Eigenschaften und Serumprogesteronwerte von „Hera1b“
Datum Zyklustag
Blutprobe
C.l.
Nr. P4 ng/ml Ovar Größe (cmxcm) Homogenität Hohlraum (cm)
15.03.2010 7 47 3 links 1,5 x 2 inhomogen nein
18.03.2010 10 49 3,8 links 2 x 2 ja 0,2
22.03.2010 14 51 4,7 links 2 x 2 central heller 0.2
25.03.2010 17 53 7,5 links 2 x 1,5 ja 0,2
29.03.2010 21/1 56 0,8 0
01.04.2010 24/4 59 0,2 0
05.04.2010 28/8 62 1 0
08.04.2010 31/11 65 2,8 rechts? 1 x 1 inhomogen nein
12.04.2010 35/15 68 3,3 rechts 1,2 x 1,2 ja nein
15.04.2010 38/18 71 3,3 rechts 1, 4 x 1,4 ja nein
19.04.2010 42/22 74 4 rechts 2 x 2 ja nein
22.04.2010 45/25 77 0,9 rechts 1 x 1 inhomogen nein
82

B.1 Daten aus dem OPU-Versuch
Tabelle B.7: C.l.-Eigenschaften und Serumprogesteronwerte von „Queen1a“, Durchgang
wegen C.l.-Bildung abgebrochen
Datum Zyklustag
Blutprobe
C.l.
Nr. P4 ng/ml Ovar Größe (cmxcm) Homogenität Hohlraum (cm)
22.02.2010 5 29 3,2 rechts 1,5 x 1,5 ja 0.8
25.02.2010 8 34 2,5 rechts 1,5 x 1,5 ja 0,7
01.03.2010 12 37 5,1 rechts 1,5 x 1,5 ja 0,8
04.03.2010 15 40 2,1 rechts 2 x 1,5 ggr. Inhomogen 0,1
08.03.2010 19/0 keine 0
Tabelle B.8: C.l.-Eigenschaften und Serumprogesteronwerte von „Queen1b“
Datum Zyklustag
Blutprobe
C.l.
Nr. P4 ng/ml Ovar Größe (cmxcm) Homogenität Hohlraum (cm)
15.03.2010 7 46 3,0 links 1 x 1,5 +1 x 2 ja; ja nein; nein
18.03.2010 10 48 3,5 links 1,5 x 1,5+1,5 x 1,5 ja; ja nein; nein
22.03.2010 14 50 7,9 links 1 x 1,5 + 1 x 1,5 ja;ja nein; nein
25.03.2010 17 52 2,9 links 1x1; 1x1 ja;ja nein; nein
29.03.2010 21/1 55 0,4 0
01.04.2010 24/4 58 0,4 0
05.04.2010 28/8 61 2,9 links? 1,5 x 1,5
08.04.2010 31/11 64 3,7 links 1 x 1,5 + 1 x 1,5 inhomogen nein
12.04.2010 35/14 67 4,8 links 1,5 x 1,5 ja nein
15.04.2010 38/17 70 3,7 links 1,2 x 1,2 ja nein
19.04.2010 42/21 73 0,3 links 1,2 x 1,2 ggr. Inhomogen nein
22.04.2010 45/23 76 0,2 links 0,8 x 0,8 ggr. inhomogen nein
Tabelle B.9: C.l.-Eigenschaften und Serumprogesteronwerte von „Rosa1“
Datum Zyklustag
Blutprobe
C.l.
Nr. P4 ng/ml Ovar Größe (cmxcm) Homogenität Hohlraum (cm)
11.02.2010 5 16 2,6 links 2 x 1,5 ja 0,4
15.02.2010 9 20 5 links 2 x 2,5 ja 0,5
18.02.2010 12 23 4,4 links 1,5 x 1,5 ja 0,5 x 0,7
22.02.2010 16 27 4,3 links 1,8 x 1,5 ja 0,3
25.02.2010 19 32 0,6 links 2 x 1 inhomogen nein
01.03.2010 23/1 35 0,1 links Rest-CL 1x1 inhomogen nein
04.03.2010 26/4 38 0,3 0 nein
08.03.2010 30/8 41 2,8 rechts 1 x 1,5 inhomogen 0,2
11.03.2010 33/11 43 3,3 rechts 1 x 1,5 inhomogen nein
83

B Verzeichnis der Gesamtdaten
Tabelle B.10: C.l.-Eigenschaften und Serumprogesteronwerte von „Hera2“, unklarer Versuchsstart, nicht gewertet
Blutprobe C.l.
Datum Zyklustag
Nr. P4 ng/ml Ovar Größe (cmxcm) Homogenität Hohlraum (cm)
31.05.2010 7? 101 8,9 rechts 2 x 2 ja nein
03.06.2010 10? 103 12 rechts 1,5 x 1,8/0,8x0,8 ja/inhomogen nein/nein
07.06.2010 ?/1 106 0,5 rechts 1 x 1 inhomogen nein
10.06.2010 ?/4 112 0,2 0 0
14.06.2010 8 116 1,3 rechts 1,5 x1,5 inhomogen 0,5
17.06.2010 11 122 3,9 rechts 2x2 inhomogen 1; 0,5;0,5
21.06.2010 15 126 4,5 rechts 1,8x1,8 inhomogen 1
24.06.2010 18 132 5,2 rechts 1,8 x 1,5 ja 0,4
28.06.2010 22 139 4,3 rechts 1,8x1,8 ggr. Inhom. 0,4
01.07.2010 25 142 0,8 Rechts Rest-C.l. inhomogen nein
05.07.2010 29/1 146 0,7 0
08.07.2010 32/4 152 1,3 links 1x1 ja nein
12.07.2010 36/8 156 2,2 links 1 x 1 ja nein
15.07.2010 39/11 158 3,0
Tabelle B.11: C.l.-Eigenschaften und Serumprogesteronwerte von „Queen2“
Blutprobe C.l.
Datum Zyklustag
Nr. P4 ng/ml Ovar Größe (cmxcm) Homogenität Hohlraum (cm)
07.06.2010 7 107 4,2 links 2 x 2 ja nein
10.06.2010 10 113 6,8 links 1,8 x 1,5 ja 0,2
14.06.2010 14 117 8,1 links 2x2 ja nein
17.06.2010 17 123 9,0 links 1,5 x 1,8 ja nein
21.06.2010 21 127 9,3 links 1,2x 1,2 ja nein
24.06.2010 24/1 133 0,3 links 1,8 x 1,5 ja nein
28.06.2010 28/5 138 1,6 0
01.07.2010 31/8 143 1,4 links Hämatom
05.07.2010 35/11 147 7,2 rechts/links 1,2x1,2/2x1,8 ja/nein 0,2/nein
08.07.2010 38/14 153 6,6 rechts/links/links 1x1/0,8x0,8/1x1 inhom/ja/ja nein/nein/0,4
12.07.2010 42/18 157 5,1 rechts 1 x 1 ggr. Inhom. nein
15.07.2010 45/21 159 0,5
84

B.1 Daten aus dem OPU-Versuch
Tabelle B.12: C.l.-Eigenschaften und Serumprogesteronwerte von „Rosa2“; dreimal wöchentliche Punktion, nicht gewertet
Datum Zyklustag
Blutprobe C.l.
Nr. P4 ng/ml Ovar Größe (cmxcm) Homogenität Hohlraum (cm)
02.06.2010 7 102 4,2 links/rechts 1x1/0,8x0,8 ja/ja nein/nein
04.06.2010 9 104 7,3 links/rechts 1,5x1,8/1,4x1 ja/inhomogen 0,4/0,1
07.06.2010 12 108 7,3 rechts/links 1,5x1,5/1,5x2 ggr.inhom./ja nein/0,5
09.06.2010 14 110 9,1 rechts/links 1,4x1,4/1,4x1,4 inhomogen/ja nein/0,4
11.06.2010 16 114 9,6 rechts/links 1,4x1,4/1,8x1,6 inhomogen/ja nein/0,4
14.06.2010 19 118 5,6 rechts/links 1x1/1x1,5 inhom/ja nein
16.06.2010 21 120 7,1 links 1,5x1,8 ggr.inhom. nein
18.06.2010 23 124 7,0 links 1,5 x 1,5 ggr. Inhom. nein
21.06.2010 26/1 128 0,2 0
23.06.2010 28/3 130 0,1 0
25.06.2010 30/5 134 0,3 0
28.06.2010 33/8 136 1,1 0
30.06.2010 35/10 140 1,5 0
02.07.2010 37/12 144 1,8 0
05.07.2010 40/15 148 1,9 0
07.07.2010 42/17 150 2,6 0
09.07.2010 44/19 154 2,0 0
85

B Verzeichnis der Gesamtdaten
Tabelle B.13: C.l.-Eigenschaften und Serumprogesteronwerte von „Crazy2“; dreimal wöchentliche Punktion, persistierendes
C.l.; nicht gewertet
Blutprobe C.l.
Datum Zyklustag
Nr. P4 ng/ml Ovar Größe (cmxcm) Homogenität Hohlraum (cm)
04.06.2010 5 105 2,8 rechts 1,4X1,4 ja nein
07.06.2010 8 109 4,9 rechts 1,8x1,8 ja nein
09.06.2010 10 111 5,9 rechts 1,5x2 ja nein
11.06.2010 12 115 7,5 rechts 2x2 ja nein
14.06.2010 15 119 7,0 rechts 1,5x1,5 ja nein
18.06.2010 19 125 7,8 rechts 1,5x1,8 ja nein
21.06.2010 22 129 7,2 rechts 1,5x1,5 ggr. inhom. nein
23.06.2010 24 131 5,2 rechts 1,5 x 1,8 ja nein
25.06.2010 26/1 135 5,1 rechts 1,5 x 1,8 ja nein
28.06.2010 29/4 137 3,1 rechts 1,5x1,8 ggr. inhom. nein
30.06.2010 31/6 141 5,0 rechts 2x2 ja nein
02.07.2010 33/8 145 3,9 rechts 1,5x1,5 ggr. inhom. nein
05.07.2010 36/11 149 4,7 rechts 2x1,5 inhom. nein
07.07.2010 38/13 151 4,2 rechts 2x1,8 ja nein
09.07.2010 40/15 155 3,6 rechts 1,8x1,8 inhom. nein
86

B.1 Daten aus dem OPU-Versuch
Tabelle B.14: C.l.-Eigenschaften und Serumprogesteronwerte von „Stella3“
Datum Zyklustag
Blutprobe
C.l.
Nr. P4 ng/ml Ovar Größe Homogenität Hohlraum
28.10.2010 7 205 1,5 rechts 1,3x1,7 ja 0,3x0,5
01.11.2010 11 208 4,2 rechts 2,2x2,7 ja 0,5x0,3
04.11.2010 14 211 5,7 rechts 2,6x1,8 ja 0,5x0,2
08.11.2010 18 214 5,8 rechts 2,6x2 ja nein
11.11.2010 21 216 0,2 rechts 1,8x1,3 inhomogen nein
15.11.2010 25 220 0,1 0 0 0 0
18.11.2010 28/1 221 0,0 0 0 0 0
22.11.2010 32/5 226 0,1 0 0 0 0
25.11.2010 35/8 229 0,2 0 0 0 0
29.11.2010 39/12 232 2,5 0 0 0 0
02.12.2010 42/15 234 3,4 links? 0 0 0
06.12.2010 46/19 236 2,0 links? 2x1,3 ja nein
09.12.10 49/22 238 0,2 0 0 0 0
Tabelle B.15: C.l.-Eigenschaften und Serumprogesteronwerte von „UFO3“; kein induziertes
C.l., nicht gewertet
Datum Zyklustag
Blutprobe
C.l.
Nr. P4 ng/ml Ovar Größe Homogenität Hohlraum
25.10.2010 7 201 2,4 rechts 1,7 x 1,2 ja nein
28.10.2010 10 203 6,8 rechts 2x2,6 ja nein
01.11.2010 14 206 6,4 rechts 2,3x1,7 ja nein
04.11.2010 17 209 6,7 rechts 2,3x1,7 ja nein
08.11.2010 21 212 7,2 rechts 2,3x1,7 inhomogen nein
11.11.2010 24 217 0,2 rechts 1,8x1,2 inhomogen nein
15.11.2010 28 218 0,1 0 0 0 0
18.11.2010 31 223 0,1 0 0 0 0
22.11.2010 35/1 224 0,3 0 0 0 0
25.11.2010 38/4 227 0,2 0 0 0 0
29.11.2010 42/8 230 0,9 0 0 0 0
02.12.2010 45/11 233 0,8 0 0 0 0
06.12.2010 49/15 235 1,5 0 0 0 0
09.12.10 52/18 237 0,6 0 0 0 0
87

B Verzeichnis der Gesamtdaten
Tabelle B.16: C.l.-Eigenschaften und Serumprogesteronwerte von „Tiffy3“
Datum Zyklustag
Blutprobe
C.l.
Nr. P4 ng/ml Ovar Größe Homogenität Hohlraum
25.10.2010 7 202 3,0 rechts 2,2 x 1,5 ja nein
28.10.2010 10 204 6,4 rechts 2,5x1,4 ja nein
01.11.2010 14 207 8,0 rechts 3x1,8 ja nein
04.11.2010 17 210 10,4 rechts 2,2x1,6 ggr. Inhom. nein
08.11.2010 21 213 7,0 rechts 2,3x1,5 hgr. Inhom. nein
11.11.2010 24 215 0,4 rechts 1,7x1,6 inhomogen nein
15.11.2010 28/1 219 0,6 0 0 0 0
18.11.2010 31/4 222 1,1 0 0 0 0
22.11.2010 35/8 225 3,8 rechts 1,4x1 ja nein
25.11.2010 38/11 228 3,8 rechts 1,4x1 ja nein
29.11.2010 42/15 231 2,3 rechts 1,4x1 inhomogen nein
88

B.1 Daten aus dem OPU-Versuch
Datum
Tabelle B.17: Punktierte Follikel und gewonnene Eizellen von „Betty1“; Versuchsstart unklar, nicht gewertet
punktierte Follikel Eizellen (n) der Kategorie
3 mm 4 mm 5 mm 6 mm 7 mm 8 mm 9 mm 10 mm > 10 mm Anzahl (n) 1 2 3 4 5
Box Nr.
28.01.2010 3 1 1 2 0 1 0 0 0 2 0 1 1 0 0 2, 798-799
01.02.2010 1 2 2 1 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 2, 808
04.02.2010 2 2 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 2, 828
08.02.2010 3 0 0 0 1 0 0 2 0 1 1 0 0 0 0 2, 837
11.02.2010 0 1 2 2 0 1 1 0 0 5 0 3 2 0 0 2, 844-847
15.02.2010 2 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
18.02.2010 1 1 2 1 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 1 2, 875
22.02.2010 2 4 3 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 2, 895
25.02.2010 2 0 0 1 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0
Datum
Tabelle B.18: Punktierte Follikel und gewonnene Eizellen von „Crazy1“
punktierte Follikel Eizellen (n) der Kategorie
3 mm 4 mm 5 mm 6 mm 7 mm 8 mm 9 mm 10 mm > 10 mm Anzahl (n) 1 2 3 4 5
Box Nr.
25.01.2010 4 2 1 0 0 0 0 1 0 1 0 0 1 0 0 2, 796
28.01.2010 1 2 5 1 0 0 0 0 0 3 0 2 1 0 0 2, 800-802
01.02.2010 2 2 2 1 0 0 0 1 0 2 0 1 1 0 0 2, 806-807
04.02.2010 2 3 2 4 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0
08.02.2010 1 2 2 1 1 1 0 2 0 2 0 1 1 0 0 2, 835+836
11.02.2010 2 2 2 0 0 0 0 0 0 2 1 0 1 0 0 2, 842+843
15.02.2010 1 3 1 1 0 1 0 0 1 3 1 1 0 1 0 2, 864-866
18.02.2010 1 2 4 3 0 2 0 1 0 3 0 2 1 0 0 2, 874
22.02.2010 2 3 3 3 0 1 0 0 0 3 0 2 0 1 0 2, 899+900
25.02.2010 1 1 2 1 2 1 0 0 0 3 1 1 1 0 0 2, 904-906
89

B Verzeichnis der Gesamtdaten
Datum
Tabelle B.19: Punktierte Follikel und gewonnene Eizellen von „Frieda1a“; nicht gewertet, C.l. aus Zyste
punktierte Follikel Eizellen (n) der Kategorie
3 mm 4 mm 5 mm 6 mm 7 mm 8 mm 9 mm 10 mm > 10 mm Anzahl (n) 1 2 3 4 5
Box Nr.
18.02.2010 3 1 2 1 0 0 0 0 1 2 1 0 1 0 0 2, 878+879
22.02.2010 0 1 1 4 0 1 0 0 0 3 2 1 0 0 0 2, 901-903
25.02.2010 2 1 1 0 0 0 0 0 1 3 1 1 0 0 1 2, 907-909
01.03.2010 1 2 3 2 1 0 0 1 0 3 2 1 0 0 0
04.03.2010 3 3 4 1 0 0 0 0 0 3 1 0 2 0 0 2, 927-929
08.03.2010 1 1 3 1 1 2 0 0 0 4 0 2 1 1 0 2, 952+953
11.03.2010 2 2 1 2 1 0 0 0 0 3 0 1 2 0 0
15.03.2010 2 1 0 2 2 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Datum
Tabelle B.20: Punktierte Follikel und gewonnene Eizellen von „Frieda1b“
punktierte Follikel Eizellen (n) der Kategorie
3 mm 4 mm 5 mm 6 mm 7 mm 8 mm 9 mm 10 mm > 10 mm Anzahl (n) 1 2 3 4 5
Box Nr.
25.03.2010 1 2 2 2 0 0 0 1 0 2 1 1 0 0 0 2a, 1013+1014
29.03.2010 1 2 1 0 0 1 0 0 2 2 1 0 1 0 0 2a, 1033+1034
01.04.2010 3 3 1 1 0 0 0 0 0 3 0 2 1 0 0 2a, 1043-1045
05.04.2010 2 1 2 5 1 0 0 0 0 4 0 2 1 1 0 2a, 1050-1053
08.04.2010 1 3 1 1 0 1 0 1 0 3 1 1 1 0 0 2a, 1067-1069
12.04.2010 4 1 0 1 0 0 0 1 1 1 0 1 0 0 0 2a, 1070
15.04.2010 3 3 2 0 1 0 0 1 1 4 2 0 1 0 1 2b, 1088-1090
19.04.2010 2 0 0 1 0 1 0 1 2 1 1 0 0 0 0 2b, 1098
22.04.2010 1 3 3 2 0 0 0 0 0 2 1 0 1 0 1 2b,1112+1113
26.04.2010 1 2 2 1 0 1 0 0 0 3 0 2 0 0 1 2b, 1147-1149
29.04.2010 3 3 0 0 0 0 0 2 0 3 0 0 1 1 1 2b, 1154-1156
90

B.1 Daten aus dem OPU-Versuch
Tabelle B.21: Punktierte Follikel und gewonnene Eizellen von „Hera1a“; Durchgang wegen C.l.-Bildung abgebrochen
Datum
punktierte Follikel Eizellen (n) der Kategorie
3 mm 4 mm 5 mm 6 mm 7 mm 8 mm 9 mm 10 mm > 10 mm Anzahl (n) 1 2 3 4 5
Box Nr.
01.02.2010 1 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 1 0 0 0 2, 809
04.02.2010 3 1 3 1 0 1 0 0 0 2 0 1 1 0 0 2, 826+827
08.02.2010 1 1 1 0 0 0 0 1 0 1 1 0 0 0 0 2, 838
11.02.2010 2 1 1 0 0 0 0 1 0 4 1 2 0 1 0 2, 848-850
15.02.2010 1 2 0 0 0 0 0 1 0 3 0 1 2 0 0 2, 867+868
Datum
Tabelle B.22: Punktierte Follikel und gewonnene Eizellen von „Hera1b“
punktierte Follikel Eizellen (n) der Kategorie
3 mm 4 mm 5 mm 6 mm 7 mm 8 mm 9 mm 10 mm > 10 mm Anzahl (n) 1 2 3 4 5
Box Nr.
15.03.2010 1 2 2 1 0 0 0 1 0 4 2 2 0 0 0 2, 976-978
18.03.2010 1 2 3 0 1 0 0 0 0 6 0 1 4 0 1 2a, 998-1000
22.03.2010 1 2 2 2 0 0 0 0 0 5 0 2 1 0 2 2a, 1003-1007
25.03.2010 2 2 3 0 0 1 0 0 0 3 1 0 2 0 0 2a, 1010+1011
29.03.2010 1 1 1 0 0 0 0 0 1 1 0 0 1 0 0 2a, 1035
01.04.2010 5 4 1 1 1 0 0 1 0 5 1 3 1 0 0 2a, 1038-1042
05.04.2010 2 2 3 0 0 1 1 0 0 1 1 0 0 0 0 2a, 1049
08.04.2010 2 4 1 0 1 0 0 0 0 2 0 0 2 0 0 2a, 1065+1066
12.04.2010 3 3 0 0 0 2 0 0 0 7 1 4 1 0 1 2b, 1073-1078
15.04.2010 3 7 3 2 0 0 0 0 0 7 2 2 2 0 1 2b, 1084-1087
19.04.2010 2 2 1 1 0 1 0 1 0 1 0 0 1 0 0 2b, 1099
22.04.2010 3 3 2 1 0 0 0 0 0 6 2 2 2 0 0 2b,1116-1121
91

B Verzeichnis der Gesamtdaten
Tabelle B.23: Punktierte Follikel und gewonnene Eizellen von „Queen1a“; Durchgang wegen C.l.-Bildung abgebrochen
punktierte Follikel Eizellen (n) der Kategorie
Datum
Box Nr.
3 mm 4 mm 5 mm 6 mm 7 mm 8 mm 9 mm 10 mm > 10 mm Anzahl (n) 1 2 3 4 5
22.02.2010 1 1 1 0 0 1 0 0 0 2 2 0 0 0 0 2, 896
25.02.2010 1 2 3 2 0 0 0 0 0 3 1 2 0 0 0 2, 910-912
01.03.2010 3 4 0 0 0 1 0 1 0 1 1 0 0 0 0 2, 922
04.03.2010 2 2 1 1 0 1 0 0 0 5 2 2 1 0 0 2, 934-937
08.03.2010 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Datum
Tabelle B.24: Punktierte Follikel und gewonnene Eizellen von „Queen1b“
punktierte Follikel Eizellen (n) der Kategorie
3 mm 4 mm 5 mm 6 mm 7 mm 8 mm 9 mm 10 mm > 10 mm Anzahl (n) 1 2 3 4 5
Box Nr.
18.03.2010 2 2 2 1 1 0 0 0 0 3 1 1 1 0 0 2a, 995-997
22.03.2010 2 1 3 1 1 1 0 0 0 3 1 1 1 0 0 2a, 1001+1002
25.03.2010 4 2 3 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 2a, 1012
29.03.2010 3 1 2 1 1 0 0 0 1 2 2 0 0 0 0 2a, 1031+1032
01.04.2010 0 2 1 2 0 1 0 0 0 3 1 1 0 1 0 2a, 1036+1037
05.04.2010 1 2 2 1 0 1 0 0 1 3 2 0 1 0 0 2a, 1046-1048
08.04.2010 2 2 3 1 0 0 0 0 0 5 2 3 0 0 0 2a, 1060-1064
12.04.2010 2 1 1 1 0 1 0 1 0 2 0 1 0 0 1 2b, 1071+1072
15.04.2010 2 1 4 0 0 0 0 1 0 3 1 1 0 1 0 2b, 1081-1083
19.04.2010 2 2 2 1 0 1 0 0 0 7 1 4 0 0 2 2b, 1094-1097
22.04.2010 3 1 3 2 0 1 0 0 0 2 0 1 0 0 1 2b, 1114+1115
92

B.1 Daten aus dem OPU-Versuch
Datum
Tabelle B.25: Punktierte Follikel und gewonnene Eizellen von „Rosa1“
punktierte Follikel Eizellen (n) der Kategorie
3 mm 4 mm 5 mm 6 mm 7 mm 8 mm 9 mm 10 mm > 10 mm Anzahl (n) 1 2 3 4 5
Box Nr.
11.02.2010 3 3 3 0 0 1 0 0 0 2 0 1 0 1 0 2, 851+852
15.02.2010 1 4 2 2 0 0 0 0 0 4 1 1 0 2 0 2, 869+870
18.02.2010 2 1 0 0 1 0 0 0 0 2 0 1 1 0 0 2, 876+877
22.02.2010 1 3 2 1 1 0 0 0 0 2 0 0 2 0 0 2, 897+898
25.02.2010 3 4 0 1 1 0 0 1 0 5 2 2 0 0 1 2, 913-916
01.03.2010 7 3 2 1 0 0 0 1 0 1 0 1 0 0 0 2, 921
04.03.2010 5 0 4 0 0 0 0 0 0 5 2 2 0 0 1 2, 930-933
08.03.2010 1 2 2 2 1 0 0 0 0 3 0 3 0 0 0 2, 954-956
11.03.2010 3 1 2 1 1 0 0 0 0 4 1 1 2 0 0 2, 965-968
Tabelle B.26: Punktierte Follikel und gewonnene Eizellen von „Crazy2“; dreimal wöchentliche Punktion, persistierendes C.l.,
nicht gewertet
punktierte Follikel Eizellen (n) der Kategorie
Datum
Box Nr.
3 mm 4 mm 5 mm 6 mm 7 mm 8 mm 9 mm 10 mm > 10 mm Anzahl (n) 1 2 3 4 5
04.06.2010 6 2 1 0 0 0 0 0 1 6 1 4 0 0 1 2b, 1266-1271
07.06.2010 1 3 3 2 0 0 0 0 0 4 1 3 0 0 0 2b, 1273-1276
09.06.2010 4 5 4 2 0 0 0 0 0 2 1 0 1 0 0 2b; 1292-1293
11.06.2010 6 3 1 4 0 0 0 0 0 6 0 3 1 0 2 2c, 1324-1327
14.06.2010 4 3 2 3 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 2c, 1333
18.06.2010 6 3 4 1 0 1 0 0 0 6 1 1 4 0 0 2c, 1377-1382
21.06.2010 8 10 0 2 0 1 0 0 0 11 4 3 3 0 1 2c; 1390-1396
23.06.2010 3 6 4 1 0 0 0 0 0 3 1 1 1 0 0 2c; 1402-1404
25.06.2010 5 4 4 0 0 0 0 0 0 3 1 0 2 0 0 2c; 1436-1437
28.06.2010 2 4 1 2 0 2 0 0 0 5 1 1 3 0 0 2c; 1441-1445
30.06.2010 5 3 2 0 1 0 0 0 0 2 0 1 1 0 0 2c; 1457-1458
02.07.2010 3 5 3 1 1 0 0 0 0 6 1 2 1 1 1 2d; 1493-1496
05.07.2010 5 5 4 4 0 1 0 0 0 4 2 0 0 0 2 2d; 1501
07.07.2010 1 5 1 5 0 1 0 0 0 4 2 2 0 0 0 2d; 1508-1511
09.07.2010 3 3 3 2 0 2 0 0 0 1 0 1 0 0 0 2d; 1548
93

B Verzeichnis der Gesamtdaten
Datum
Tabelle B.27: Punktierte Follikel und gewonnene Eizellen von „Queen2“
punktierte Follikel Eizellen (n) der Kategorie
3 mm 4 mm 5 mm 6 mm 7 mm 8 mm 9 mm 10 mm > 10 mm Anzahl (n) 1 2 3 4 5
Box Nr.
07.06.2010 6 5 1 1 0 0 0 1 0 6 2 2 1 0 1 2b, 1283-1287
10.06.2010 7 5 3 1 0 0 0 0 0 8 2 3 3 0 0 2b, 1302-1307
14.06.2010 6 4 1 1 0 1 0 1 0 3 1 0 2 0 0 2c, 1334-1336
17.06.2010 3 5 5 0 2 0 0 0 0 13 3 4 4 0 2 2c, 1367-1376
21.06.2010 7 2 1 2 0 1 0 0 0 2 2 0 0 0 0 2c; 1385+1386
24.06.2010 2 7 0 1 0 2 0 0 1 3 0 2 1 0 0 2c; 1433-1435
28.06.2010 4 5 0 1 0 4 0 0 0 5 2 1 1 0 1 2c; 1446-1450
01.07.2010 3 3 2 1 1 1 0 0 0 4 2 1 1 0 0 2d; 1484-1487
05.07.2010 4 5 1 1 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0
Tabelle B.28: Punktierte Follikel und gewonnene Eizellen von „Rosa2“; dreimal wöchentliche Punktion, nicht gewertet
punktierte Follikel Eizellen (n) der Kategorie
Datum
Box Nr.
3 mm 4 mm 5 mm 6 mm 7 mm 8 mm 9 mm 10 mm > 10 mm Anzahl (n) 1 2 3 4 5
02.06.2010 2 3 2 1 0 0 0 0 0 5 0 1 3 1 0 2b, 1255-1259
04.06.2010 4 2 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 1 2b, 1272
07.06.2010 1 0 1 0 0 0 0 0 0 2 1 0 1 0 0 2b, 1281-1282
09.06.2010 3 3 2 0 1 0 0 0 0 2 0 2 0 0 0 2b, 1290
11.06.2010 8 3 3 0 0 0 0 0 0 5 1 1 3 0 0 2c, 1328-1331
14.06.2010 2 5 1 0 1 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 2c, 1332
16.06.2010 4 3 1 0 0 0 0 0 0 3 1 2 0 0 0 2c, 1351-1353
18.06.2010 5 2 3 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
21.06.2010 8 3 0 0 0 2 0 0 1 3 0 3 0 0 0 2c; 1387-1389
23.06.2010 6 7 1 1 0 0 0 0 0 7 3 1 1 0 2 2c; 1397-1401
25.06.2010 6 4 4 2 1 1 0 1 0 4 1 0 1 1 1 2c; 1438-1439
28.06.2010 3 3 3 1 0 1 0 2 0 1 0 1 0 0 0 2c; 1440
30.06.2010 3 6 0 0 1 1 0 0 0 4 2 2 0 0 0 2c; 1459-1462
02.07.2010 3 4 3 1 0 0 0 0 0 6 1 2 1 0 1 2d; 1488-1492
05.07.2010 1 5 3 1 2 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 2d; 1497
07.07.2010 3 6 1 2 0 0 0 0 0 7 2 3 1 0 1 2d; 1502-1507
09.07.2010 5 4 1 1 0 0 0 0 0 7 1 2 4 0 0 2d; 1549-1553
94

B.1 Daten aus dem OPU-Versuch
Datum
Tabelle B.29: Punktierte Follikel und gewonnene Eizellen von „Hera2“; Versuchsstart unklar, nicht gewertet
punktierte Follikel Eizellen (n) der Kategorie
3 mm 4 mm 5 mm 6 mm 7 mm 8 mm 9 mm 10 mm > 10 mm Anzahl (n) 1 2 3 4 5
Box Nr.
31.05.2010 2 3 1 1 0 0 0 2 0 1 0 0 0 1 0 2b, 1254
03.06.2010 4 3 1 2 0 1 0 0 0 6 2 1 2 1 0 2b, 1260-1265
07.06.2010 3 5 1 1 0 0 0 0 1 4 0 2 1 0 1 2b; 1277-1280
10.06.2010 15 7 5 1 0 0 0 0 0 18 5 6 5 0 1+1* 2b, 1302-1307
14.06.2010 4 5 4 0 0 1 0 1 1 4 2 1 0 0 1 2c, 1337-1340
17.06.2010 10 7 7 1 0 0 0 1 0 3 0 3 0 0 0 2c, 1364-1366
21.06.2010 2 4 2 2 0 1 0 0 0 2 2 0 0 0 0 2c; 1383-1384
24.06.2010 6 8 4 0 0 0 0 0 0 8 3 2 2 0 1 2c; 1428-1432
28.06.2010 3 7 4 2 0 1 0 0 0 7 2 2 2 0 1 2c; 1451-1456
Datum
Tabelle B.30: Punktierte Follikel und gewonnene Eizellen von „Stella3“
punktierte Follikel Eizellen (n) der Kategorie
3 mm 4 mm 5 mm 6 mm 7 mm 8 mm 9 mm 10 mm > 10 mm Anzahl (n) 1 2 3 4 5
Box Nr.
28.10.2010 4 5 3 1 0 2 0 0 0 7 2 0 1 4 0 2d; 1783-1789
01.11.2010 4 6 2 1 1 1 0 0 0 3 0 0 1 1 1 2d; 1798
04.11.2010 3 4 1 1 0 0 0 0 0 2 0 0 1 1 0 2d; 1806
08.11.2010 9 3 0 1 0 0 1 0 0 6 1 0 3 2 0 2e; 1822-1827
11.11.2010 10 3 1 1 0 0 0 0 0 13 1 0 10 0 2 2e; 1839-1849
15.11.2010 6 4 5 0 1 0 0 0 0 5 1 2 0 0 2 2e; 1852-1856
18.11.2010 3 1 3 0 0 1 0 0 0 3 0 1 2 0 0 2e; 1867-1869
22.11.2010 3 7 3 2 0 0 0 0 0 5 3 1 1 0 0 2e; 1878-1881
25.11.2010 2 4 2 2 1 1 0 0 0 8 0 0 5 1 2 2e; 1889-1894
29.11.2010 0 4 2 2 0 2 0 0 1 2 0 1 1 0 0 2e; 1906+1907
02.12.2010 3 5 4 1 0 0 0 0 0 4 0 2 2 0 0 2e; 1929-1932
06.12.2010 3 6 5 2 0 1 0 1 0 8 3 4 1 0 0 2e; 1939-1946
09.12.10 5 5 0 2 1 0 0 0 0 5 0 1 4 0 0 2e; 1951-1955
95

B Verzeichnis der Gesamtdaten
Datum
Tabelle B.31: Punktierte Follikel und gewonnene Eizellen von „Tiffy3“
punktierte Follikel Eizellen (n) der Kategorie
3 mm 4 mm 5 mm 6 mm 7 mm 8 mm 9 mm 10 mm > 10 mm Anzahl (n) 1 2 3 4 5
Box Nr.
25.10.2010 2 4 2 1 0 1 0 1 0 10 5 2 1 1 1 2d, 1764-1771
28.10.2010 2 3 1 1 1 0 0 0 0 7 0 2 3 1 1 2d; 1778-1782
01.11.2010 3 2 2 1 0 1 0 1 0 2 0 2 0 0 0 2d; 1796+1797
04.11.2010 5 6 1 2 1 1 0 0 0 6 2 2 2 0 0 2d; 1800-1805
08.11.2010 1 6 4 1 0 1 0 1 0 3 0 0 3 0 0 2e; 1819-1821
11.11.2010 6 1 3 0 0 0 0 0 0 8 0 0 5 1 2 2e; 1828-1835
15.11.2010 6 6 2 0 0 1 1 0 1 5 1 2 2 0 0 2e; 1850+1851
18.11.2010 3 2 3 0 0 0 0 0 0 6 0 0 3 1 2 2e; 1859-1861
22.11.2010 3 3 4 0 0 1 0 0 0 3 0 0 2 0 1 2e; 1875-1877
25.11.2010 6 3 1 2 0 1 0 1 0 5 2 1 1 0 1 2e; 1885-1888
29.11.2010 2 3 2 4 0 0 0 1 0 5 1 1 3 0 0 2e; 1901-1905
Tabelle B.32: Punktierte Follikel und gewonnene Eizellen von „UFO3“; kein induziertes C.l., nicht gewertet
punktierte Follikel Eizellen (n) der Kategorie
Datum
Box Nr.
3 mm 4 mm 5 mm 6 mm 7 mm 8 mm 9 mm 10 mm > 10 mm Anzahl (n) 1 2 3 4 5
25.10.2010 8 2 1 2 0 0 0 0 0 9 6 0 2 1 0 2d, 1756-1763
28.10.2010 2 5 3 3 0 0 0 0 0 5 1 0 3 1 0 2d; 1773-1777
01.11.2010 2 0 1 3 1 1 0 0 0 6 2 1 1 2 0 2d; 1790-1795
04.11.2010 4 3 0 2 0 1 0 0 0 2 0 0 1 0 1 2d; 1799
08.11.2010 1 2 2 2 0 0 0 1 0 5 1 3 1 0 0 2e; 1814-1818
11.11.2010 6 1 0 0 0 0 0 0 0 3 0 0 2 0 1 2e; 1836-1838
15.11.2010 3 4 1 1 0 0 0 1 0 1 0 1 0 0 0
18.11.2010 4 0 2 1 0 0 1 0 0 4 0 1 3 0 0 2e; 1863-1866
22.11.2010 4 3 3 1 1 0 0 2 0 6 1 2 1 0 2 2e; 1870-1874
25.11.2010 0 3 4 2 0 0 0 0 1 4 1 0 2 0 1 2e; 1882-1884
29.11.2010 3 4 1 0 0 2 0 1 1 6 1 2 3 0 0 2e; 1895-1900
02.12.2010 2 5 4 2 0 0 0 0 1 6 2 2 1 1 0 2e; 1923-1928
06.12.2010 1 3 2 1 1 0 0 0 1 2 0 1 1 0 0 2e; 1937-1938
09.12.10 2 3 3 3 0 1 0 0 0 4 1 1 2 0 0 2e; 1947-1950
96

B.1 Daten aus dem OPU-Versuch
B.1.1 Näherungsfunktionen und Berechnungen für den Verlauf des Serumprogesteronwertes
Die Tabelle B.33 bezieht sich auf die mit Hilfe von Gnuplot ermittelte Näherungsfunktion für
den Verlauf des Serumprogesterongehaltes der Einzeltiere während des Versuchszeitraumes mit
der allgemeinen Funktionsgleichung
f(x) = a · (sin((x + b) · c) + 1) · e (−d·x) .
Tabelle B.33: Die Funktionsparameter mit ihren Standardfehlern (Asymptotic Standard
Error) für die einzelnen Tiere
Tier
Parameter
a b c d
Betty 4.12882 -0.237424 0.255471 0.015388
± 1.008 (24.41%) ± 2.08 (876.1%) ± 0.02276 (8.91%) ± 0.009855 (64.05%)
Crazy 4.37484 -8.36155 0.27077 0.0395779
± 1.017 (23.25%) ± 0.8619 (10.31%) ± 0.02112 (7.8%) ± 0.01188 (30.02%)
Frieda 1.39476 -6.5418 0.268788 0.01741
± 0.2418 (17.34%) ± 0.9339 (14.28%) ± 0.01365 (5.077%) ± 0.007619 (43.76%)
Hera 3.66531 -8.3315 0.266554 0.0146267
± 0.9774 (26.67%) ± 1.155 (13.87%) ± 0.01671 (6.269%) ± 0.0106 (72.49%)
Queen 1 3.42064 -7.88606 0.303657 0.00843052
± 0.7365 (21.53%) ± 0.8206 (10.41%) ± 0.01387 (4.569%) ± 0.008891 (105.5%)
Queen 2 6.71004 -9.70609 0.274973 0.0168831
± 1.795 (26.75%) ± 1.011 (10.42%) ± 0.01613 (5.867%) ± 0.01055 (62.48%)
Rosa 3.0473 -5.46793 0.265753 0.0143687
± 0.6587 (21.62%) ± 1.019 (18.64%) ± 0.02276 (8.563%) ± 0.013 (90.48%)
Stella 3.92724 -8.74304 0.23994 0.0270885
± 1.073 (27.33%) ± 1.265 (14.47%) ± 0.01829 (7.622%) ± 0.01163 (42.93%)
Tiffy 9.32713 -10.1215 0.266051 0.0394403
± 2.183 (23.4%) ± 0.6969 (6.885%) ± 0.01708 (6.421%) ± 0.01118 (28.35%)
UFO 10.4009 -9.80193 0.21255 0.0641817
± 4.307 (41.41%) ± 1.113 (11.36%) ± 0.0223 (10.49%) ± 0.02217 (34.54%)
B.1.2 Progesteronverläufe der Einzeltiere
Für die abgebrochenen, nicht beendeten Versuchsdurchläufe Hera 1a, Frieda 1a und Queen 1a
wurden aufgrund der unvollständigen Daten keine Graphiken erstellt.
97

B Verzeichnis der Gesamtdaten
Abbildung B.1: Graphische Darstellung des Progesteronprofils der Einzeltiere während
des Versuchszeitraumes; Zyklustag = Tag nach natürlicher Brunst; +
gemessene Werte, – Näherungsfunktion
98

B.2 Daten aus dem IVM-Versuch
B.1.3 Berechnungen aus den Funktionen
Tabelle B.34: Berechnungen aus den Funktionen
Zyklus 1 nat. C.l. Zyklus 2 ind. C.l.
Tier (Tage) life span P4 MW Fläche qmm (Tage) life span P4 MW Fläche qmm ∆Max
Crazy 1 23 17 4,1 274,9 23 11 1,7 117,8 3,1
Frieda 1 b 23 12 1,7 225,0 23 9 1,4 62,8 0,8
Hera 1b 24 18 4,7 133,3 24 16 2,9 147,7 1,8
Queen 1b 23 16 4,4 255,3 21 15 3,8 175,5 1,0
Queen 2 25 18 7,5 232,5 23 18 4,4 218,0 3,3
Rosa 3 23 17 4,1 237,6 24 15 3,1 116,2 1,5
Stella 3 26 19 3,5 313,7 27 15 2,7 204,2 2,7
Tiffy 3 24 19 7,0 301,1 23 16 2,7 82,5 6,1
Mittelwert 23,9 17,0 4,6 246,7 23,5 14,4 2,8 140,6 2,5
±SD ±1,1 ±2,3 ±1,9 ±56,0 ±1,7 ±2,9 ±1,0 ±55,9 ±1,7
Tabelle B.35: Vergleich der berechneten und gemessenen Werte
P4-Max 1 gemessenes P4-Max 1 P4-Max 2 gemessenes P4-Max 2 Zyklus 1 beobachteter Zyklus Zyklus 2
Tier Tag ng/ml Tag ng/ml Tag ng/ml Tag ng/ml (Tage) (Tage) (Tage)
Crazy 1 13 5,1 11 4,6 36 2,0 36 2,5 23 21 23
Frieda 1b 12 2,3 11 2,2 35 1,5 39 1,8 23 24 23
Hera 1b 14 6,0 17 7,5 37 4,2 42 4,0 24 20 24
Queen 1b 13 6,1 14 7,9 34 5,1 35 4,8 23 20 21
Qeen 2 15 10,4 21 9,3 38 7,1 35 7,2 25 23 23
Rosa 3 11 5,2 9 5 35 3,7 30 2,8 23 22 24
Stella 3 14 5,3 18 5,8 41 2,6 42 3,4 26 27 27
Tiffy 3 15 10,1 17 10,4 39 4,0 38 3,8 24 27 23
Mittelwert 13,4 6,3 14,8 6,6 36,9 3,8 37,1 3,8 23,9 23,0 23,5
±SD ±1,4 ±2,7 ±4,2 ±2,7 ±2,4 ±1,8 ±4,0 ±1,7 ±1,1 ±2,8 ±1,7
99

B Verzeichnis der Gesamtdaten
B.2 Daten aus dem IVM-Versuch
B.2.1 IVP-Durchgänge der Versuchsgruppen
Datum
Tabelle B.36: IVP-Durchgänge der Gruppe P4

B.2 Daten aus dem IVM-Versuch
Datum
Tabelle B.38: IVP-Durchgänge der Gruppe P4=300 ng/ml
P4 Medium (ng/ml) Teilung Entwicklung
Anzahl (n)
Ansatz leer mit Oozyten
geteilte (n) % d7 (n) % d7 d8 (n) % d8
17.08.2010 267,4 180,2 23,2 56 18 32,1 6 10,7 7 12,5
01.02.2011 346,7 328,2 62 39 62,9 14 22,6 17 27,4
11.04.2011 358,5 55,3 58 33 56,9 10 17,2 13 22,4
03.05.2011 330,5 327,3 40,0 27 7 25,9 3 11,1 3 11,1
15.06.2010 35,8 75 37 49,3 10 13,3 10 13,3
Datum
Tabelle B.39: IVP-Durchgänge der Gruppe P4=450 ng/ml
P4 Medium (ng/ml) Teilung Entwicklung
Anzahl (n)
Ansatz leer mit Oozyten
geteilte (n) % d7 (n) % d7 d8 (n) % d8
01.03.2011 407,1 77,9 60 28 46,7 11 18,3 13 21,7
15.03.2011 464,2 525,3 122,4 25 8 32,0 3 12,0 6 24,0
01.06.2011 330,5 484,3 54,5 29 17 58,6 5 17,2 8 27,6
02.06.2010 301,7 65,8 31 12 38,7 5 16,1 5 16,1
27.07.2010 64,2 59 26 44,1 8 13,6 8 13,6
21.09.2010 65,4 33 18 54,5 7 21,2 15 45,5
07.06.2011 48,9 53 31 58,5 10 18,9 10 18,9
101

B Verzeichnis der Gesamtdaten
Datum
Tabelle B.40: Nicht gewertete IVP-Durchgänge der P4-Gruppen
P4 Medium (ng/ml) Teilung Entwicklung
Anzahl (n)
Ansatz leer mit Oozyten
geteilte (n) % d7 (n) % d7 d8 (n) % d8
02.02.2010 119,7 >40 36,2 55 21 38,2 2 3,6 2 3,6
03.03.2010 >40 27,8 46 14 30,4 2 4,3 4 8,6
17.03.2010 101,7 30,8 12 4 33 1 8 1 8
14.04.2010 87,0 26,3 41 13 53,7 3 7,3 3 7,3
04.05.2010 174,3 162,2 19,0 31 13 41,9 2 6,5 3 9,7
04.08.2010 25,3 53 23 43,4 4 7,5 2 7,5
10.08.2010 281,9 194,0 29,8 27 13 48,1 0 0 2 7,4
07.09.2010 40,9 44 17 38,6 6 13,6 7 15,9
05.10.2010 48,8 45 27 60 7 15,6 9 20
12.10.2010 >40 42,5 22 11 50 6 27,3 9 40,9
26.10.2010 37,8 13 6 46,2 1 7,7 2 15,4
23.11.2010 >40 >40 56 26 46,4 13 23,2 13 23,2
30.11.2010 297,6 209,1 32,9 PILZ
07.12.2010 281,5 206,8 64,1 PILZ
05.01.2011 198,7 190,6 >40 16 5 31,3 1 6,25 1 6,25
18.01.2011 277,3 172,2 17,1 PILZ
18.04.2011 629,9 417,0 0 0 0 0 0 0 0
24.05.2011 504 40,8 51 20 39,2 8 15,7 12 23,5
21.06.2011 410,3 402,8 69,0 30 0 0 0 0 0 0
25.08.2010 252 15,3 26,6 PILZ
102

B.2 Daten aus dem IVM-Versuch
Tabelle B.41: IVP-Durchgänge der zusatzfreien Kontrollgruppe; Durchgänge mit Entwicklungsraten
< 10 % an Tag 7 wurden nicht gewertet
Datum Anzahl (n)
Teilungsrate Entwicklung
% (n) % (n) d7 % (n) d8
12.01.2010 27 33,3 (9) 18,5 (5) 18,5 (5)
19.01.2010 28 71,4 (20) 17,9 (5) 17,8 (5)
26.01.2010 17 58,8 (10) 17,6 (3) 23,5 (4)
02.02.2010 29 37,9 (11) 13,8 (4) 24,1 (7)
09.02.2010 28 67,9 (19) 21,4 (6) 21,4 (6)
23.02.2010 27 37,0 (10) 3,7 (1) 7,4 (2)
02.03.2010 27 59,3 (16) 11,1 (4) 14,8 (4)
09.03.2010 21 61,9 (13) 14,3 (3) 19 (4)
16.03.2010 20 45,0 (9) 0,0 (0) 0,0 (0)
06.04.2010 21 61,9 (13) 14,3 (3) 33,3 (7)
13.04.2010 28 57,7 (16) 25,0 (7) 28,6 (8)
20.04.2010 24 45,8 (11) 4,1 (1) 4,1 (1)
27.04.2010 25 68,0 (17) 36,0 (9) 36,0 (9)
04.05.2010 17 58,8 (10) 5,9 (1) 5,9 (1)
11.05.2010 30 46,6 (14) 16,6 (5) 30,0 (9)
01.06.2010 21 57,1 (12) 23,8 (5) 23,8 (5)
15.06.2010 33 39,4 (13) 12,1 (4) 15,2 (5)
22.06.2010 28 57,1 (16) 3,6 (1) 7,1 (2)
29.06.2010 24 25,0 (6) 4,2 (1) 8,3 (2)
06.07.2010 22 31,8 (7) 9,1 (2) 9,1 (2)
13.07.2010 24 41,7 (10) 25 (6) 29,2 (7)
20.07.2010 21 57,1 (12) 19 (4) 23,8 (5)
27.07.2010 14 7,1 (1) 0,0 (0) 0,0 (0)
03.08.2010 26 61,5 (16) 19,2 (5) 19,2 (5)
10.08.2010 26 46,2 (12) 3,8 (1) 11,5 (3)
17.08.2010 31 58,1 (18) 3,2 (1) 9,7 (3)
19.10.2010 20 35,0 (7) 20,0 (4) 25,0 (5)
23.11.2010 27 59,3 (16) 37,0 (10) 48,1 (13)
01.02.2011 23 69,6 (16) 4,3 (1) 21,7 (5)
01.03.2011 27 51,9 (14) 18,5 (5) 18,5 (5)
15.03.2011 32 3,1 (1) 0,0 (0) 0,0 (0)
29.03.2011 29 58,6 (17) 20,7 (6) 27,6 (8)
11.04.2011 30 73,3 (22) 26,7 (8) 33,3 (10)
18.04.2011 26 50,0 (13) 19,2 (5) 26,9 (7)
02.05.2011 26 50,0 (13) 15,4 (5) 23,1 (6)
24.05.2011 22 72,7 (16) 31,8 (7) 40,9 (9)
30.05.2011 30 70,0 (21) 26,7 (8) 26,7 (8)
01.06.2011 25 56,0 (14) 16,0 (4) 24,0 (6)
07.06.2011 30 56,7 (17) 16,7 (5) 16,7 (5)
103

B Verzeichnis der Gesamtdaten
Tabelle B.42: IVP-Durchgänge der Alkohol(EtOH-)kontrollgruppen; Durchgänge mit
Entwicklungsraten < 10 % an Tag 7 wurden nicht gewertet
Datum EtOH µl Anzahl (n)
Teilungsrate Entwicklung
% (n) % (n) d7 % (n) d8
12.01.2010 2 25 40,0 (10) 16,0 (4) 16,0 (4)
19.01.2010 2 24 58,3 (14) 8,3 (2) 8,3 (2)
26.01.2010 2 24 50,0 (12) 29,2 (7) 25,0 (6)
02.02.2010 2 30 40,0 (12) 6,7 (2) 16,7 (5)
09.02.2010 2 24 62,5 (15) 16,7 (5) 16,7 (5)
16.02.2010 2 12 50,0 (6) 8,3 (1) 16,7 (2)
23.02.2010 2 24 45,8 (11) 0,0 (0) 20,8 (5)
02.03.2010 2 30 43,3 (13) 13,3 (4) 16,6 (5)
09.03.2010 2 24 58,3 (14) 4,2 (1) 4,2 (1)
16.03.2010 2 25 32,0 (8) 8,0 (2) 16,0 (4)
13.04.2010 2 25 52,0 (13) 8,0 (2) 20,0 (5)
27.04.2010 2 20 75,0 (15) 55,0 (11) 55,0 (11)
04.05.2010 2 24 66,6 (16) 25,0 (6) 37,5 (9)
25.05.2010 2 31 32,3 (10) 3,2 (1) 3,2 (1)
07.06.2010 2 23 65,2 (15) 17,4 (4) 30,4 (7)
15.06.2010 2 35 25,7 (9) 5,7 (2) 5,7 (2)
22.06.2010 2 24 54,2 (13) 16,6 (4) 25,0 (5)
29.06.2010 2 29 51,7 (15) 6,9 (2) 10,3 (3)
06.07.2010 2 20 60,0 (12) 15,0 (3) 20,0 (4)
13.07.2010 2 28 28,6 (8) 3,6 (1) 10,7 (3)
20.07.2010 2 20 65,0 (13) 30,0 (6) 30,0 (6)
27.07.2010 4 28 75,0 (21) 46,4 (13) 46,4 (13)
03.08.2010 4 29 55,2 (16) 0,0 (0) 0,0 (0)
10.08.2010 4 30 46,7 (14) 16,6 (5) 16,6 (5)
17.08.2010 4 34 38,2 (13) 11,8 (4) 26,5 (9)
07.09.2010 4 25 48,0 (12) 28,0 (7) 28,0 (7)
14.09.2010 4 31 54,8 (17) 16,1 (5) 22,6 (7)
05.10.2010 4 26 53,8 (14) 15,4 (4) 34,6 (9)
26.10.2010 4 21 61,9 (13) 9,5 (2) 28,6 (6)
23.11.2010 4 31 41,9 (13) 25,8 (8) 32,3 (10)
05.01.2011 4 14 50,0 (7) 7,1 (1) 7,1 (1)
01.02.2011 4 20 70,0 (14) 30,0 (6) 30,0 (6)
01.03.2011 8 23 52,2 (12) 26,1 (6) 30,4 (7)
15.03.2011 8 18 55,6 (10) 27,8 (5) 27,8 (5)
29.03.2011 8 28 39,3 (11) 14,3 (4) 35,7 (10)
11.04.2011 8 30 63,3 (19) 20,0 (6) 40,0 (12)
18.04.2011 8 18 44,4 (8) 22,2 (4) 33,3 (6)
02.05.2011 8 30 43,3 (13) 13,3 (4) 20,0 (6)
24.05.2011 8 18 44,4 (8) 16,7 (3) 22,2 (4)
30.05.2011 8 29 44,8 (13) 20,7 (6) 27,6 (8)
07.06.2011 8 33 69,7 (23) 24,2 (8) 27,3 (9)
104

B.2 Daten aus dem IVM-Versuch
B.2.2 P4 im IVM-Medium
Tabelle B.43: P4-Gehalt des Mediums der Gruppe < 50 ng/ml vor der Inkubation (Ansatz),
nach 24stündiger Inkubation ohne Oozyten (Leerkontrolle) sowie
nach 24stündiger Inkubation mit Oozyten
Datum
P4 (ng/ml)
Ansatz Leerkontrolle mit Oozyten
20.01.10 10,5
27.01.10 15,7 20,6 7,5
09.02.10 52,6
16.02.10 53,9 37,9 12,5
24.02.10 33,4 8,6
17.02.11 15,8 24,7 20,2
17,3 14,8
25,6
31.03.10 23,8 59,3 7,5
48,8 86,5 4,9
25.08.10 14,1 15,3 26,6
13.10.10 30,9 11,2
42,5
Tabelle B.44: P4-Gehalt des Mediums der Gruppe 300 ng/ml vor der Inkubation (Ansatz),
nach 24stündiger Inkubation ohne Oozyten (Leerkontrolle) sowie
nach 24stündiger Inkubation mit Oozyten
Datum
P4 (ng/ml)
Ansatz Leerkontrolle mit Oozyten
15.06.10 133,2 35,8
17.08.10 267,4 180,2 23,2
01.09.10 240,1 171,6 35,7
01.02.11 346,7 328,2
381,5
11.08.10 281,9 194,0 29,8
01.12.10 297,6 209,1 32,9
08.12.10 281,5 206,8 64,1
19.01.11 277,3 172,2 17,1
11.04.11 358,5 55,3
03.05.11 330,5 327,3 41,0
02.06.10 301,7 65,8
33,7
105

B Verzeichnis der Gesamtdaten
Tabelle B.45: P4-Gehalt des Mediums der Gruppe 150 ng/ml vor der Inkubation (Ansatz),
nach 24stündiger Inkubation ohne Oozyten (Leerkontrolle) sowie
nach 24stündiger Inkubation mit Oozyten
P4 (ng/ml)
Datum Ansatz Leerkontrolle mit Oozyten
106
02.02.10 197,5 105,0 36,2
34,1 151,0 35,2
69,5 105,5 23,8
119,7 21,7
03.03.10 104,4 27,8
176,3 23,6
09.03.10 140,6 18,6
17.03.10 101,7 30,8
87,0
117,2
20.04.10 135,3 128,3 52,4
22.06.10 31,3
30.06.10 115,3 116,2 45,4
06.07.10 21,6
13.07.10 32,2
20.07.10 29,9
16.02.11 143,1 139,7 23,5
14.09.10 27,8
28.04.10 130,6 32,1
117,4
30.04.10 125,9
155,7
05.05.10 174,3 162,2 19,0
05.01.11 198,7 190,6 41,0
15.12.10 31,3
34,4
12.05.10 161,1
186,0
19.05.10 172,3
161,1 36,2
26.05.10 155,9
128,9
08.06.10 140,9
137,0
07.04.10 146,6 117,3
92,8
91,0
14.04.10 87,0 22,3
136,9 26,3
24.11.10 104,1 64,3
31.05.11 116,8 65,3
06.10.10 29,5
48,8
27.10.10 75,1 23,4
37,8

B.2 Daten aus dem IVM-Versuch
Tabelle B.46: P4-Gehalt des Mediums der Gruppe 450 ng/ml vor der Inkubation (Ansatz),
nach 24stündiger Inkubation ohne Oozyten (Leerkontrolle) sowie
nach 24stündiger Inkubation mit Oozyten
Datum
P4 (ng/ml)
Ansatz Leerkontrolle mit Oozyten
01.03.11 407,1 77,9
15.03.11 464,2 525,3 122,4
01.06.11 330,5 484,3 54,5
02.06.10 65,8
27.07.10 64,2
21.09.10 65,4
08.06.11 48,9
49,2
39,0
22.06.11 410,3 402,8 69,0
451,5 64,3
406,3
B.2.3 Reifungskontrollen
Durchgänge, bei denen mehr als 10 % der Eizellen nicht auszuwerten waren wurden nicht gewertet.
Tabelle B.47: Gereifte Eizellen der Kontrollgruppe
Datum Anzahl (n)
Meiosestadium
I n (%) II n (%)
nicht auswertbar (n)
25.08.2011 25 12 (85,7%) 3 (14,3%) 10 (41,7%)
26.08.2011 23 18 (85,7%) 3 (14,3%) 2 (8,7%)
08.09.2011 32 18 (85,7%) 3 (14,3%) 11 (34,3%)
22.09.2011 31 23 (82,1%) 5 (17,9%) 3 (9,7%)
23.09.2011 36 26 (78,8%) 7 (21,2%) 3 (8,3%)
29.09.2011 26 15 (78,9%) 4 (21,1%) 7 (26,9%)
Tabelle B.48: Gereifte Eizellen der Alkoholkontrolle
Datum Anzahl (n)
Meiosestadium
I n (%) II n (%)
nicht auswertbar (n)
01.09.2011 38 27 (84,4%) 5 (15,6%) 6 (15,8%)
02.09.2011 31 25 (86,2%) 4 (13,8%) 2 (6,5%)
15.09.2011 34 15 (83,3%) 3 (16,7%) 16 (47,1%)
29.09.2011 28 23 (88,5 %) 3 (11,5%) 2 (7,1%)
14.10.2011 30 26 (89,7%) 3 (10,3%) 1 (3,3%)
107

B Verzeichnis der Gesamtdaten
Tabelle B.49: Gereifte Eizellen der Gruppe P4 150 ng/ml
Datum Anzahl (n)
Meiosestadium
I n (%) II n (%)
nicht auswertbar (n)
15.09.2011 29 14 (82,3%) 3 (17,7%) 12 (41,4%)
22.09.2011 31 25 (86,2%) 4 (13,8%) 2 (6,5%)
23.09.2011 26 19 (79,2%) 5 (20,8%) 2 (7,7%)
13.10.2011 35 26 (81,3%) 6 (18,7%) 3 (8,6%)
Tabelle B.50: Gereifte Eizellen der Gruppe P4 300 ng/ml
Datum Anzahl (n)
Meiosestadium
I n (%) II n (%)
nicht auswertbar (n)
08.09.2011 30 17 (85,0%) 3 (15,0%) 10 (33,3%)
30.09.2011 20 15 (83,3%) 3 (16,7%) 2 (10%)
06.10.2011 40 33 (89,2%) 4 (10,8%) 3 (7,3%)
14.10.2011 34 26 (83,9%) 5 (16,1%) 3 (8,8%)
Tabelle B.51: Gereifte Eizellen der Gruppe P4 450 ng/ml
Datum Anzahl (n)
Meiosestadium
I n (%) II n (%)
nicht auswertbar (n)
02.09.2011 33 26 (83,9%) 5 (16,1%) 2 (6,1%)
16.09.2011 30 23 (85,2%) 4 (14,8%) 3 (10,0%)
07.10.2011 32 23 (79,3%) 6 (20,7%) 3 (9,4%)
108

B.3 Daten aus der RT-qPCR
B.3 Daten aus der RT-qPCR
B.3.1 OPU-Oozyten
Tabelle B.52: Transkripthäufigkeiten in den OPU-Eizellen der natürlichen C.l.-Phase
Analysedatum Eizelle No. GLUT1 PGR GDF9 HIF2a PAQR5 PGRMC1 PGRMC2 BMP15
13.03.2012 798 Betty1 6,12 0,11 542,64 34,15 6,08 28,72 5,15 273,21
14.03.2012 1001 Queen1b 1,61 0,12 256,69 22,22 2,78 21,76 3,82 105,70
15.03.2012 1033 Frieda1b 7,69 0,07 597,94 106,44 10,08 69,74 15,39 394,49
19.03.2012 1800 Tiffy3 9,59 0,67 937,05 68,21 7,68 72,10 11,98 505,65
Mitelwert 6,25 0,24 583,58 57,76 6,66 48,08 9,09 319,76
±SEM ±1,70 ±0,14 ±139,55 ±18,93 ±1,53 ±13,27 ±2,76 ±85,70
Tabelle B.53: Transkripthäufigkeiten in den OPU-Eizellen der Follikelphase
Analysedatum Eizelle No. GLUT1 PGR GDF9 HIF2a PAQR5 PGRMC1 PGRMC2 BMP15
13.03.2012 837 Betty1 3,17 N/A 71,20 20,59 3,30 17,19 3,37 79,55
14.03.2012 1031 Queen 1b 1,26 0,22 256,69 12,41 1,78 11,66 2,29 144,39
15.03.2012 1067 Frieda1b 9,15 0,71 822,49 73,20 6,52 84,67 15,18 485,68
19.03.2012 1828 Tiffy3 4,94 0,42 586,08 45,10 6,61 43,56 9,22 322,90
Mittelwert 4,63 0,45 434,12 37,83 4,55 39,27 7,52 258,13
±SEM ±1,68 ±0,14 ±167,61 ±13,68 ±1,20 ±16,66 ±2,97 ±91,65
Tabelle B.54: Transkripthäufigkeiten in den OPU-Eizellen der induzierten C.l.-Phase
Analysedatum Eizelle No. GLUT1 PGR GDF9 HIF2a PAQR5 PGRMC1 PGRMC2 BMP15
13.03.2012 895 Betty1 4,39 N/A 292,82 21,92 3,67 19,34 4,70 145,40
14.03.2012 1071 Queen1b 1,19 N/A 139,47 14,36 1,85 14,76 2,74 80,66
15.03.2012 1147 Frieda1b 3,30 N/A 149,48 20,73 1,47 16,61 3,13 92,66
19.03.2012 1885 Tiffy3 1,72 0,27 306,74 12,91 1,08 15,57 2,97 137,27
20.03.2012 1072 Queen1b 7,38 N/A 1100,43 75,26 12,85 87,06 15,82 542,64
20.03.2012 1148 Frieda1b 0,48 N/A 13,12 0,40 0,36 6,47 3,69 36,86
20.03.2012 1886 Tiffy3 2,47 0,04 133,51 19,08 1,83 17,68 3,56 105,70
Mittelwert 2,99 0,16 305,08 23,52 3,30 25,36 5,23 163,03
±SEM ±0,88 ±0,12 ±137,93 ±9,05 ±1,64 ±10,40 ±1,78 ±64,74
109

B Verzeichnis der Gesamtdaten
B.3.2 IVM-Versuch
Tabelle B.55: Transkripthäufigkeiten in unreifen Eizellen aus Schlachthofovarien
Analysedatum Eizelle No. GLUT1 PGR GDF9 HIF2a PAQR5 PGRMC1 PGRMC2 BMP15
19.10.2011 622 5,219 N/A 1229,500 36,857 3,467 42,632 13,213 462,675
25.10.2011 528 19,505 0,793 432,261 17,701 2,650 25,559 7,391 197,507
27.10.2011 620 2,049 0,265 249,841 7,647 1,390 14,171 3,084 94,018
14.12.2011 504 8,190 0,699 736,150 43,528 4,671 46,976 11,826 303,143
14.12.2011 530 100,696 18,049 2011,221 74,742 13,966 104,972 42,045 711,074
20.12.2011 566 3,451 0,132 253,735 9,278 1,314 9,944 2,574 111,729
20.12.2011 676 3,516 0,372 324,901 14,359 2,304 30,355 6,207 164,718
20.12.2011 696 8,839 0,803 794,474 38,689 3,716 40,053 15,604 425,748
Mittelwert 18,93 3,02 754,01 30,35 4,18 39,33 12,74 308,83
±SEM ±11,84 ±2,51 ±215,50 ±8,05 ±1,46 ±10,48 ±4,50 ±75,28
Tabelle B.56: Transkripthäufigkeiten in den in vitro gereiften Eizellen der Kontrollgruppe
Analysedatum Eizelle No. GLUT1 PGR GDF9 HIF2a PAQR5 PGRMC1 PGRMC2 BMP15
18.10.2011 2029 1,122 0,139 353,473 14,475 1,288 13,227 5,961 99,419
20.10.2011 1999 3,326 3,147 691,630 63,288 5,872 68,777 16,494 645,313
26.10.2011 2027 4,671 5,751 2140,684 42,632 7,381 91,383 25,525 1308,643
Mittelwert 3,04 3,01 1061,93 40,13 4,85 57,80 15,99 684,46
±SEM ±1,03 ±1,62 ±548,14 ±14,15 ±1,83 ±23,22 ±5,65 ±349,62
Tabelle B.57: Transkripthäufigkeiten in den in vitro gereiften Eizellen der Alkoholkontrolle 2 ng/ml
Analysedatum Eizelle No. GLUT1 PGR GDF9 HIF2a PAQR5 PGRMC1 PGRMC2 BMP15
18.10.2011 2047 1,311 0,763 222,949 14,831 1,215 26,919 7,731 172,514
20.10.2011 2025 5,913 0,338 577,572 40,053 2,628 53,961 12,243 282,843
26.10.2011 2044 4,359 0,699 394,493 42,928 3,147 51,051 19,078 431,691
Mittelwert 3,86 0,60 398,34 32,60 2,33 43,98 13,02 295,68
±SEM ±1,35 ±0,13 ±102,39 ±8,93 ±0,58 ±8,57 ±3,30 ±75,09
110

B.3 Daten aus der RT-qPCR
Tabelle B.58: Transkripthäufigkeiten in den in vitro gereiften Eizellen der Alkoholkontrolle 4 ng/ml
Analysedatum Eizelle No. GLUT1 PGR GDF9 HIF2a PAQR5 PGRMC1 PGRMC2 BMP15
19.10.2011 1991 1,640 1,314 154,756 27,548 3,349 23,165 7,484 141,421
25.10.2011 1973 3,074 0,358 171,252 24,933 2,809 33,128 11,081 170,069
27.10.2011 1988 5,723 1,281 543,739 61,682 5,763 86,628 20,775 620,277
Mittelwert 3,48 0,98 289,92 38,05 3,97 47,64 13,11 310,59
±SEM ±1,20 ±0,31 ±127,00 ±11,84 ±0,91 ±19,70 ±3,97 ±155,06
Tabelle B.59: Transkripthäufigkeiten in den in vitro gereiften Eizellen der Alkoholkontrolle 8 ng/ml
Analysedatum Eizelle No. GLUT1 PGR GDF9 HIF2a PAQR5 PGRMC1 PGRMC2 BMP15
19.10.2011 2187 3,373 2,758 205,623 34,389 7,081 42,928 16,958 215,846
25.10.2011 2100 4,146 4,632 681,110 26,755 2,871 51,688 16,700 347,711
27.10.2011 2143 9,612 9,480 906,956 79,611 9,480 158,121 37,920 1086,061
Mittelwert 5,71 5,62 597,90 46,92 6,48 84,25 23,86 549,87
±SEM ±1,96 ±2,00 ±206,69 ±16,49 ±1,93 ±37,02 ±7,03 ±270,78
Tabelle B.60: Transkripthäufigkeiten in den in vitro gereiften Eizellen der Gruppe >50 ng/ml
Analysedatum Eizelle No. GLUT1 PGR GDF9 HIF2a PAQR5 PGRMC1 PGRMC2 BMP15
08.03.2012 2031 0,66 0,08 107,18 20,03 2,72 39,50 7,18 161,33
12.03.2012 2032 5,83 1,78 489,06 69,74 6,89 66,43 9,74 353,08
18.10.2011 2039 3,15 N/A 143,74 17,84 1,91 17,24 7,55 143,74
20.10.2011 2033 4,90 1,99 114,87 18,56 1,61 30,99 5,91 180,25
26.10.2011 2036 9,88 0,69 446,91 48,63 6,04 50,35 22,38 389,06
Mittelwert 4,88 1,14 260,35 34,96 3,83 40,90 10,55 245,49
±SEM ±1,53 ±0,45 ±85,25 ±10,44 ±1,10 ±8,37 ±3,02 ±51,90
111

B Verzeichnis der Gesamtdaten
Tabelle B.61: Transkripthäufigkeiten in den in vitro gereiften Eizellen der Gruppe 150 ng/ml
Analysedatum Eizelle No. GLUT1 PGR GDF9 HIF2a PAQR5 PGRMC1 PGRMC2 BMP15
08.03.2012 2015 4,77 1,33 172,91 37,89 5,15 33,68 5,67 197,25
08.03.2012 2016 2,32 1,00 209,94 16,84 1,81 18,30 4,15 174,11
08.03.2012 2017 1,49 2,15 193,19 35,60 2,72 35,11 9,15 194,53
21.03.2012 2019 2,16 1,10 263,90 22,85 2,15 31,21 6,04 175,32
Mittelwert 2,69 1,40 209,99 28,30 2,96 29,58 6,25 185,30
±SEM ±0,72 ±0,26 ±19,50 ±5,05 ±0,75 ±3,84 ±1,05 ±6,14
Tabelle B.62: Transkripthäufigkeiten in den in vitro gereiften Eizellen der Gruppe 300 ng/ml
Analysedatum Eizelle No. GLUT1 PGR GDF9 HIF2a PAQR5 PGRMC1 PGRMC2 BMP15
12.03.2012 1982 1,86 2,03 132,87 30,99 5,48 42,04 9,47 153,69
21.03.2012 1984 2,09 0,80 98,62 26,06 2,92 25,17 5,63 111,73
18.10.2011 1986 2,33 1,06 292,50 27,33 2,89 44,09 10,95 201,17
26.10.2011 1981 9,67 6,70 1108,09 104,25 10,01 151,57 29,12 839,77
Mittelwert 3,99 2,65 408,02 47,16 5,33 65,72 13,79 326,59
±SEM ±1,90 ±1,38 ±237,15 ±19,06 ±1,68 ±28,93 ±5,23 ±172,03
Tabelle B.63: Transkripthäufigkeiten in den in vitro gereiften Eizellen der Gruppe 450 ng/ml
Analysedatum Eizelle No. GLUT1 PGR GDF9 HIF2a PAQR5 PGRMC1 PGRMC2 BMP15
12.03.2012 2049 4,77 0,08 736,15 46,98 5,95 57,83 9,61 428,71
12.03.2012 2091 1,81 1,81 57,04 16,49 2,15 13,30 2,26 68,78
21.03.2012 2050 3,44 2,18 565,69 30,99 4,33 39,50 6,38 269,45
25.10.2011 2092 2,69 0,16 111,91 14,28 1,55 30,40 8,61 153,93
Mittelwert 3,18 1,06 367,70 27,19 3,50 35,26 6,72 230,22
±SEM ±0,63 ±0,55 ±167,55 ±7,57 ±1,01 ±9,28 ±1,63 ±77,90
112

Abbildungen
2.1 Schematische Darstellung der IVP beim Rind; modifiziert nach NIEMANN und
MEINECKE (1993) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16
3.1 Schematische Darstellung des Arbeitsablaufs der OPU-Versuche . . . . . . . . 30
3.2 OPU-Equipment: (1) Vakuumpumpe, (2) Ultraschallgerät, (3) Sondenträger;
Wasserbad, Schlauchsystem und Auffanggefäß nicht abgebildet; Abbildung nach
HANSTEDT (2009) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
3.3 OPU-Sondenträger mit Nadelführung sowie Vergrößerung des vorderen Teiles;
Abbildung nach HANSTEDT (2009) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
3.4 Schematische Darstellung der Follikelpunktion;
Abbildung nach HANSTEDT (2009) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
3.5 Apparatur zur Separation von KOK aus Follikelpunktaten;
Abbildung nach HANSTEDT (2009) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33
3.6 IVP-taugliche bovine Kumulus-Oozyten-Komplexe, 50fache Vergrößerung . . 33
3.7 Schematische Darstellung des IVP-Versuchsteils . . . . . . . . . . . . . . . . 36
3.8 a: 8-Zell-Embryo, b: Morula, c: expandierte Blastozysten, d: geschlüpfte Blastozysten
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39
4.1 Graphische Darstellung des Progesteronprofils während des Versuchszeitraumes;
+ an den Punktionstagen gemessene Werte, – Näherungsfunktion . . . . . 47
4.2 Serumprogesterongehalt (links; ¯n±SD, n=8; a:b mit P ≤0,05), Fläche (Mitte;
¯n±SD, n=8; a:b mit P ≤0,05) und Lutealphasenlänge (rechts; ¯n±SD, n=8) des
natürlichen und induzierten C.l. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48
4.3 a: gereifte Oozyten der Kontrollgruppe; b: mit EtOH gereift; c: mit P4 gereift;
Maßstab in allen Bildern gleich . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51
4.4 mRNA-Gehalte der OPU-Oozyten bezüglich GDF9, BMP15 und HIF2α; a:b
mit P < 0,05, * = Tendenz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53
4.5 mRNA-Gehalte der OPU-Oozyten bezüglich der Progesteronrezeptoren; a:b
mit P < 0,05, * = Tendenz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54
4.6 mRNA-Gehalte der gereiften Oozyten aus dem IVM-Versuch bezüglich GDF9
und HIF2α; a:b mit P < 0,05, * = Tendenz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55
4.7 mRNA-Gehalte der gereiften Oozyten aus dem IVM-Versuch bezüglich der
Progesteronrezeptoren; a:b mit P < 0,05, * = Tendenz . . . . . . . . . . . . . . 56
B.1 Graphische Darstellung des Progesteronprofils der Einzeltiere während des Versuchszeitraumes;
Zyklustag = Tag nach natürlicher Brunst; + gemessene Werte,
– Näherungsfunktion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 98
113

Abbildungen
114

Tabellen
2.1 Untersuchungen zu verschiedenen Parametern und deren Einfluss auf die Entwicklungskompetenz
boviner Oozyten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14
2.2 Effekte verschiedener Zusätze zum IVM-Medium auf die Entwicklungsraten in
der IVP boviner Embryonen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
2.3 Effekte verschiedener Steroidsupplementationen im IVM-Medium für Rinder-
KOK . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
3.1 Klassifizierungsschema für bovine KOK . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
3.2 Kreuzreaktivität des im RIA genutzten Antikörpers . . . . . . . . . . . . . . . 35
3.3 Eingesetzte Oozyten- bzw. Embryonenäquivalente (EÄ; 1 EÄ ˆ= 20 µl des Reaktionsansatzes)
für die jeweiligen Gentranskripte . . . . . . . . . . . . . . . . 41
3.4 Verwendete Primer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43
4.1 Tiernutzung und Auswertung im OPU-Versuchsteil . . . . . . . . . . . . . . . 46
4.2 Punktierte Follikel (n) und Größenverteilung während der Zyklusphasen . . . . 49
4.3 Punktierte Follikel pro OPU-Sitzung (¯n±SD) in den einzelnen Zyklusphasen . 49
4.4 Gewonnene KOK (n) und Anteile an den einzelnen Kategorien (%) . . . . . . . 49
4.5 Gewonnene KOK der einzelnen Kategorien pro OPU-Sitzung in den Zyklusphasen
(¯n±SD) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50
4.6 Progesterongehalt des Mediums (¯n±SD) der einzelnen Versuchsgruppen vor
der Inkubation (Ansatz), nach 24stündiger Inkubation ohne Oozyten (Leerkontrolle)
sowie nach 24stündiger Inkubation mit Oozyten . . . . . . . . . . . . . 51
4.7 Prozentuale Anteile der Meiosestadien M I und M II in den Reifungskontrollen
(¯n±SD; P > 0,05) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52
4.8 Teilungs- (TR) und Entwicklungsraten (ER) der einzelnen Versuchsgruppen
(¯n±SD) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52
A.1 Zusammensetzung der PBS-Lösung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73
A.2 Zusätze für die PBS-Gebrauchslösung (PBS Complete) . . . . . . . . . . . . . 73
A.3 Zusammensetzung des TCM air . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73
A.4 Zusammensetzung der NaCl-Lösung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73
A.5 Zusammensetzung der NaCl-Complete-Lösung . . . . . . . . . . . . . . . . . 74
A.6 Zusammensetzung des Reifungsmediums . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74
A.7 Zusammensetzung der FertTALP-Stocklösung . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74
A.8 Zusammensetzung der FertTALP-Gebrauchslösung . . . . . . . . . . . . . . . 74
A.9 Zusammensetzung der Epinephrin-Lösung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75
A.10 Zusammensetzung der Hypotaurin-Lösung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75
A.11 Zusammensetzung der Heparin-Lösung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75
A.12 Zusammensetzung der HHE-Stocklösung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75
115

Tabellen
A.13 Zusammensetzung der HHE-Gebrauchslösung . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75
A.14 Zusammensetzung des Fertilisationsmediums . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75
A.15 Zusammensetzung der Spermfilter-Gebrauchslösung . . . . . . . . . . . . . . 76
A.16 Zusammensetzung der SOF-Stocklösung A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76
A.17 Zusammensetzung der SOF-Stocklösung B . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76
A.18 Zusammensetzung der SOF-Stocklösung C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76
A.19 Zusammensetzung der SOF-Stocklösung D . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76
A.20 Zusammensetzung der Glutamin-Stocklösung . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77
A.21 Zusammensetzung des Kulturmediums (SOFaa-Medium) . . . . . . . . . . . . 77
A.22 Zusammensetzung der Fixierlösung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77
A.23 Zusammensetzung der Lacmoid-Stocklösung . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77
A.24 Zusammensetzung der Lacmoid-Arbeitslösung . . . . . . . . . . . . . . . . . 77
A.25 Zusammensetzung des PVA 0,1 % . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78
A.26 NaCl-Lösung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78
A.27 Boratpuffer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78
A.28 Herkunft der bei der RT-PCR eingesetzten Medien . . . . . . . . . . . . . . . 78
A.29 Tris-HCl . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78
A.30 Lysis/Bindingpuffer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 79
A.31 Waschpuffer A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 79
A.32 Waschpuffer B . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 79
A.33 Zusammensetzung des Mastermixes für die Reverse Transkription . . . . . . . 79
A.34 Zusammensetzung des Reaktionsgemisches für die RT-qPCR . . . . . . . . . . 79
B.1 C.l.-Eigenschaften und Serumprogesteronwerte von „Betty1“; Versuchsstart unklar,
nicht gewertet . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81
B.2 C.l.-Eigenschaften und Serumprogesteronwerte von „Crazy1“ . . . . . . . . . 81
B.3 C.l.-Eigenschaften und Serumprogesteronwerte von "Frieda1a“; nicht gewertet,
C.l. aus Zyste . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81
B.4 C.l.-Eigenschaften und Serumprogesteronwerte von „Frieda1b“ . . . . . . . . . 82
B.5 C.l.-Eigenschaften und Serumprogesteronwerte von „Hera1a“, Durchgang wegen
C.l.-Bildung abgebrochen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82
B.6 C.l.-Eigenschaften und Serumprogesteronwerte von „Hera1b“ . . . . . . . . . 82
B.7 C.l.-Eigenschaften und Serumprogesteronwerte von „Queen1a“, Durchgang wegen
C.l.-Bildung abgebrochen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83
B.8 C.l.-Eigenschaften und Serumprogesteronwerte von „Queen1b“ . . . . . . . . 83
B.9 C.l.-Eigenschaften und Serumprogesteronwerte von „Rosa1“ . . . . . . . . . . 83
B.10 C.l.-Eigenschaften und Serumprogesteronwerte von „Hera2“, unklarer Versuchsstart,
nicht gewertet . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 84
B.11 C.l.-Eigenschaften und Serumprogesteronwerte von „Queen2“ . . . . . . . . . 84
B.12 C.l.-Eigenschaften und Serumprogesteronwerte von „Rosa2“; dreimal wöchentliche
Punktion, nicht gewertet . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 85
116

B.13 C.l.-Eigenschaften und Serumprogesteronwerte von „Crazy2“; dreimal wöchentliche
Punktion, persistierendes C.l.; nicht gewertet . . . . . . . . . . . . . . . . 86
B.14 C.l.-Eigenschaften und Serumprogesteronwerte von „Stella3“ . . . . . . . . . . 87
B.15 C.l.-Eigenschaften und Serumprogesteronwerte von „UFO3“; kein induziertes
C.l., nicht gewertet . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87
B.16 C.l.-Eigenschaften und Serumprogesteronwerte von „Tiffy3“ . . . . . . . . . . 88
B.17 Punktierte Follikel und gewonnene Eizellen von „Betty1“; Versuchsstart unklar,
nicht gewertet . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89
B.18 Punktierte Follikel und gewonnene Eizellen von „Crazy1“ . . . . . . . . . . . 89
B.19 Punktierte Follikel und gewonnene Eizellen von „Frieda1a“; nicht gewertet, C.l.
aus Zyste . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90
B.20 Punktierte Follikel und gewonnene Eizellen von „Frieda1b“ . . . . . . . . . . . 90
B.21 Punktierte Follikel und gewonnene Eizellen von „Hera1a“; Durchgang wegen
C.l.-Bildung abgebrochen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91
B.22 Punktierte Follikel und gewonnene Eizellen von „Hera1b“ . . . . . . . . . . . 91
B.23 Punktierte Follikel und gewonnene Eizellen von „Queen1a“; Durchgang wegen
C.l.-Bildung abgebrochen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92
B.24 Punktierte Follikel und gewonnene Eizellen von „Queen1b“ . . . . . . . . . . 92
B.25 Punktierte Follikel und gewonnene Eizellen von „Rosa1“ . . . . . . . . . . . . 93
B.26 Punktierte Follikel und gewonnene Eizellen von „Crazy2“; dreimal wöchentliche
Punktion, persistierendes C.l., nicht gewertet . . . . . . . . . . . . . . . . 93
B.27 Punktierte Follikel und gewonnene Eizellen von „Queen2“ . . . . . . . . . . . 94
B.28 Punktierte Follikel und gewonnene Eizellen von „Rosa2“; dreimal wöchentliche
Punktion, nicht gewertet . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94
B.29 Punktierte Follikel und gewonnene Eizellen von „Hera2“; Versuchsstart unklar,
nicht gewertet . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95
B.30 Punktierte Follikel und gewonnene Eizellen von „Stella3“ . . . . . . . . . . . . 95
B.31 Punktierte Follikel und gewonnene Eizellen von „Tiffy3“ . . . . . . . . . . . . 96
B.32 Punktierte Follikel und gewonnene Eizellen von „UFO3“; kein induziertes C.l.,
nicht gewertet . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96
B.33 Die Funktionsparameter mit ihren Standardfehlern (Asymptotic Standard Error)
für die einzelnen Tiere . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 97
B.34 Berechnungen aus den Funktionen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 99
B.35 Vergleich der berechneten und gemessenen Werte . . . . . . . . . . . . . . . . 99
B.36 IVP-Durchgänge der Gruppe P4

Tabellen
B.42 IVP-Durchgänge der Alkohol(EtOH-)kontrollgruppen; Durchgänge mit Entwicklungsraten
< 10 % an Tag 7 wurden nicht gewertet . . . . . . . . . . . . . . . . 104
B.43 P4-Gehalt des Mediums der Gruppe < 50 ng/ml vor der Inkubation (Ansatz),
nach 24stündiger Inkubation ohne Oozyten (Leerkontrolle) sowie nach 24stündiger
Inkubation mit Oozyten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 105
B.44 P4-Gehalt des Mediums der Gruppe 300 ng/ml vor der Inkubation (Ansatz),
nach 24stündiger Inkubation ohne Oozyten (Leerkontrolle) sowie nach 24stündiger
Inkubation mit Oozyten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 105
B.45 P4-Gehalt des Mediums der Gruppe 150 ng/ml vor der Inkubation (Ansatz),
nach 24stündiger Inkubation ohne Oozyten (Leerkontrolle) sowie nach 24stündiger
Inkubation mit Oozyten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 106
B.46 P4-Gehalt des Mediums der Gruppe 450 ng/ml vor der Inkubation (Ansatz),
nach 24stündiger Inkubation ohne Oozyten (Leerkontrolle) sowie nach 24stündiger
Inkubation mit Oozyten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 107
B.47 Gereifte Eizellen der Kontrollgruppe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 107
B.48 Gereifte Eizellen der Alkoholkontrolle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 107
B.49 Gereifte Eizellen der Gruppe P4 150 ng/ml . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 108
B.50 Gereifte Eizellen der Gruppe P4 300 ng/ml . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 108
B.51 Gereifte Eizellen der Gruppe P4 450 ng/ml . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 108
B.52 Transkripthäufigkeiten in den OPU-Eizellen der natürlichen C.l.-Phase . . . . . 109
B.53 Transkripthäufigkeiten in den OPU-Eizellen der Follikelphase . . . . . . . . . 109
B.54 Transkripthäufigkeiten in den OPU-Eizellen der induzierten C.l.-Phase . . . . . 109
B.55 Transkripthäufigkeiten in unreifen Eizellen aus Schlachthofovarien . . . . . . . 110
B.56 Transkripthäufigkeiten in den in vitro gereiften Eizellen der Kontrollgruppe . . 110
B.57 Transkripthäufigkeiten in den in vitro gereiften Eizellen der Alkoholkontrolle
2 ng/ml . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 110
B.58 Transkripthäufigkeiten in den in vitro gereiften Eizellen der Alkoholkontrolle
4 ng/ml . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 111
B.59 Transkripthäufigkeiten in den in vitro gereiften Eizellen der Alkoholkontrolle
8 ng/ml . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 111
B.60 Transkripthäufigkeiten in den in vitro gereiften Eizellen der Gruppe >50 ng/ml 111
B.61 Transkripthäufigkeiten in den in vitro gereiften Eizellen der Gruppe 150 ng/ml . 112
B.62 Transkripthäufigkeiten in den in vitro gereiften Eizellen der Gruppe 300 ng/ml . 112
B.63 Transkripthäufigkeiten in den in vitro gereiften Eizellen der Gruppe 450 ng/ml . 112
118

Literaturverzeichnis
ABELE, E., STINSHOFF, H., HANSTEDT, A., WILKENING, S., MEINECKE-TILLMANN, S.
und WRENZYCKI, C. (2012):
Influence of selected (pre-)maturational parameters on in vitro development and sex distribution
of bovine embryos.
Zygote, pages 1–9.
ADAMIAK, S. J., MACKIE, K., WATT, R. G., WEBB, R. und SINCLAIR, K. D. (2005):
Impact of nutrition on oocyte quality: Cumulative effects of body composition and diet leading
to hyperinsulinemia in cattle.
Biology of Reproduction, 73(5):918–926.
ADONA, P. R., DE BEM, T. H., MESQUITA, L. G., ROCHETTI, R. C. und LEAL, C. L.
(2011):
Embryonic development and gene expression in oocytes cultured in vitro in supplemented prematuration
and maturation media.
Reprod Domest Anim, 46(1):e31–8.
ADONA, P. R., PIRES, P. R., QUETGLAS, M. D., SCHWARZ, K. R. und LEAL, C. L. (2008):
Nuclear maturation kinetics and in vitro embryo development of cattle oocytes prematured
with butyrolactone i combined or not combined with roscovitine.
Anim Reprod Sci, 104(2-4):389–97.
AERTS, J. M. und BOLS, P. E. (2010):
Ovarian follicular dynamics. a review with emphasis on the bovine species. part II: Antral
development, exogenous influence and future prospects.
Reprod Domest Anim, 45(1):180–7.
AGUNG, B., OTOI, T., WONGSRIKEAO, P., TANIGUCHI, M., SHIMIZU, R., WATARI, H.
und NAGAI, T. (2006):
Effect of maturation culture period of oocytes on the sex ratio of in vitro fertilized bovine
embryos.
J Reprod Dev, 52(1):123–7.
AHMAD, N., SCHRICK, F. N., BUTCHER, R. L. und INSKEEP, E. K. (1995):
Effect of persistent follicles on early embryonic losses in beef cows.
Biology of Reproduction, 52(5):1129–1135.
ALI, A., COENEN, K., BOUSQUET, D. und SIRARD, M. A. (2004):
Origin of bovine follicular fluid and its effect during in vitro maturation on the developmental
competence of bovine oocytes.
Theriogenology, 62(9):1596–606.
ALLER, J. F., MUCCI, N. C., KAISER, G. G., RIOS, G., CALLEJAS, S. S. und ALBERIO,
R. H. (2010):
Transvaginal follicular aspiration and embryo development in superstimulated early postpartum
beef cows and subsequent fertility after artificial insemination.
Anim Reprod Sci, 119(1-2):1–8.
119

Literaturverzeichnis
ANGUITA, B., VANDAELE, L., MATEUSEN, B., MAES, D. und VAN SOOM, A. (2007):
Developmental competence of bovine oocytes is not related to apoptosis incidence in oocytes,
cumulus cells and blastocysts.
Theriogenology, 67(3):537–549.
APARICIO, I. M., GARCIA-HERREROS, M., O’SHEA, L. C., HENSEY, C., LONERGAN, P.
und FAIR, T. (2011):
Expression, regulation, and function of progesterone receptors in bovine cumulus oocyte complexes
during in vitro maturation.
Biol Reprod, 84(5):910–21.
ARIAS-ALVAREZ, M., BERMEJO-ALVAREZ, P., GUTIERREZ-ADAN, A., RIZOS, D., LO-
RENZO, P. L. und LONERGAN, P. (2011):
Effect of leptin supplementation during in vitro oocyte maturation and embryo culture on bovine
embryo development and gene expression patterns.
Theriogenology, 75(5):887–96.
AROSH, J. A., BANU, S. K., CHAPDELAINE, P., MADORE, E., SIROIS, J. und FORTIER,
M. A. (2004):
Prostaglandin biosynthesis, transport, and signaling in corpus luteum: A basis for autoregulation
of luteal function.
Endocrinology, 145(5):2551–2560.
ASSEY, R. J., HYTTEL, P., GREVE, T. und PURWANTARA, B. (1994):
Oocyte morphology in dominant and subordinate follicles.
Mol Reprod Dev, 37(3):335–44.
AUGUSTIN, R., POCAR, P., NAVARRETE-SANTOS, A., WRENZYCKI, C., GANDOLFI, F.,
NIEMANN, H. und FISCHER, B. (2001):
Glucose transporter expression is developmentally regulated in in vitro derived bovine preimplantation
embryos.
Mol Reprod Dev, 60(3):370–6.
BAGE, R., PETYIM, S., LARSSON, B., HALLAP, T., BERGQVIST, A. S., GUSTAFSSON, H.
und RODRIGUEZ-MARTINEZ, H. (2003):
Oocyte competence in repeat-breeder heifers: effects of an optimized ovum pick-up schedule
on expression of oestrus, follicular development and fertility.
Reprod Fertil Dev, 15(1-2):115–23.
BALASUBRAMANIAN, S., SON, W. J., KUMAR, B. MOHANA, OCK, S. A., YOO, J. G., IM,
G. S., CHOE, S. Y. und RHO, G. J. (2007):
Expression pattern of oxygen and stress-responsive gene transcripts at various developmental
stages of in vitro and in vivo preimplantation bovine embryos.
Theriogenology, 68(2):265–275.
BALL, G. D., LEIBFRIED, M. L., AX, R. L. und FIRST, N. L. (1984):
Maturation and fertilization of bovine oocytes in vitro.
J Dairy Sci, 67(11):2775–85.
BANDYOPADHYAY, A., BANDYOPADHYAY, J., CHOI, H. H., CHOI, H. S. und KWON, H. B.
120

(1998):
Plasma membrane mediated action of progesterone in amphibian (Rana dybowskii) oocyte
maturation.
Gen Comp Endocrinol, 109(3):293–301.
BARNES, F. L. und EYESTONE, W. H. (1990):
Early cleavage and the maternal zygotic transition in bovine embryos.
Theriogenology, 33(1):141–152.
BEILBY, K.H., DE GRAAF, S.P., EVANS, G., MAXWELL, W.M.C., WILKENING, S.,
WRENZYCKI, C. und GRUPEN, C.G. (2011):
Quantitative mrna expression in ovine blastocysts produced from x- and y-chromosome bearing
sperm, both in vitro and in vivo.
Theriogenology, 76(3):471 – 481.
BELLIN, M. E. und AX, R. L. (1984):
Chondroitin sulfate: An indicator of atresia in bovine follicles.
Endocrinology, 114(2):428–434.
BERGFELT, D.R., LIGHTFOOT, K.C. und ADAMS, G.P. (1994):
Ovarian synchronization following ultrasound-guided transvaginal follicle ablation in heifers.
Theriogenology, 42(6):895 – 907.
BESENFELDER, U., HAVLICEK, V., MOSSLACHER, G. und BREM, G. (2001):
Collection of tubal stage bovine embryos by means of endoscopy. a technique report.
Theriogenology, 55(3):837–45.
BHOJWANI, S., ALM, H., TORNER, H., KANITZ, W. und POEHLAND, R. (2007):
Selection of developmentally competent oocytes through brilliant cresyl blue stain enhances
blastocyst development rate after bovine nuclear transfer.
Theriogenology, 67(2):341–345.
BISINOTTO, R.S., CHEBEL, R.C. und SANTOS, J.E.P. (2010):
Follicular wave of the ovulatory follicle and not cyclic status influences fertility of dairy cows.
Journal of Dairy Science, 93(8):3578–3587.
BISINOTTO, R. S. und SANTOS, J. E. P. (2011):
The use of endocrine treatments to improve pregnancy rates in cattle.
Reproduction, Fertility and Development, 24:258–266.
BLOCH, A., FOLMAN, Y., KAIM, M., ROTH, Z., BRAW-TAL, R. und WOLFENSON, D.
(2006):
Endocrine alterations associated with extended time interval between estrus and ovulation in
high-yield dairy cows.
Journal of Dairy Science, 89(12):4694 – 4702.
BLOCK, J., WRENZYCKI, C., NIEMANN, H., HERRMANN, D. und HANSEN, P. J. (2008):
Effects of insulin-like growth factor-1 on cellular and molecular characteristics of bovine blastocysts
produced in vitro.
Mol Reprod Dev, 75(5):895–903.
121

Literaturverzeichnis
BLONDIN, P., COENEN, K., GUILBAULT, L. A. und SIRARD, M. A. (1997):
In vitro production of bovine embryos: developmental competence is acquired before maturation.
Theriogenology, 47(5):1061–75.
BLONDIN, P. und SIRARD, M. A. (1995):
Oocyte and follicular morphology as determining characteristics for developmental competence
in bovine oocytes.
Mol Reprod Dev, 41(1):54–62.
BODENSTEINER, K. J., WILTBANK, M. C., BERGFELT, D. R. und GINTHER, O. J. (1996):
Alterations in follicular estradiol and gonadotropin receptors during development of bovine
antral follicles.
Theriogenology, 45(2):499–512.
BOEDIONO, A., RAJAMAHENDRAN, R., SAHA, S., SUMANTRI, C. und SUZUKI, T. (1995):
Effect of the presence of a CL in the ovary on oocyte number, cleavage rate and blastocyst
production in vitro in cattle.
Theriogenology, 43(1):169–169.
BOEDIONO, A., TAKAGI, M., SAHA, S. und SUZUKI, T. (1994):
Influence of day-0 and day-7 superovulated cow serum during development of bovine oocytes
in vitro.
Reprod Fertil Dev, 6(2):261–4.
BOLS, P. E. J., VANDENHEEDE, J. M. M., VAN SOOM, A. und DE KRUIF, A. (1995):
Transvaginal ovum pick-up (OPU) in the cow: A new disposable needle guidance system.
Theriogenology, 43(3):677–687.
BOLS, P. E., VAN SOOM, A., YSEBAERT, M. T., VANDENHEEDE, J. M. und DE KRUIF, A.
(1996):
Effects of aspiration vacuum and needle diameter on cumulus oocyte complex morphology
and developmental capacity of bovine oocytes.
Theriogenology, 45(5):1001–14.
BOLS, P. E. J., YSEBAERT, M. T., LEIN, A., CORYN, M., VAN SOOM, A. und DE KRUIF,
A. (1998):
Effects of long-term treatment with bovine somatotropin on follicular dynamics and subsequent
oocyte and blastocyst yield in an OPU-IVF program.
Theriogenology, 49(5):983–995.
BOLS, P. E., YSEBAERT, M. T., VAN SOOM, A. und DE KRUIF, A. (1997):
Effects of needle tip bevel and aspiration procedure on the morphology and developmental
capacity of bovine compact cumulus oocyte complexes.
Theriogenology, 47(6):1221–36.
BONI, R., CUOMO, A. und TOSTI, E. (2002):
Developmental potential in bovine oocytes is related to cumulus-oocyte complex grade, calcium
current activity, and calcium stores.
Biol Reprod, 66(3):836–42.
122

BONI, R., ROELOFSEN, M. W., PIETERSE, M., KOGUT, J. und KRUIP, T. A. (1997):
Follicular dynamics, repeatability and predictability of follicular recruitment in cows undergoing
repeated follicular puncture.
Theriogenology, 48(2):277–89.
BORDIGNON, V., MORIN, N., DUROCHER, J., BOUSQUET, D. und SMITH, L. C. (1997):
GnRH improves the recovery rate and the in vitro developmental competence of oocytes obtained
by transvaginal follicular aspiration from superstimulated heifers.
Theriogenology, 48(2):291–8.
BRAMLEY, T. (2003):
Non-genomic progesterone receptors in the mammalian ovary: some unresolved issues.
Reproduction, 125(1):3–15.
BROADBENT, P. J., DOLMAN, D. F., WATT, R. G., SMITH, A. K. und FRANKLIN, M. F.
(1997):
Effect of frequency of follicle aspiration on oocyte yield and subsequent superovulatory response
in cattle.
Theriogenology, 47(5):1027–1040.
BUNGARTZ, L., LUCAS-HAHN, A., RATH, D. und NIEMANN, H. (1995):
Collection of oocytes from cattle via follicular aspiration aided by ultrasound with or without
gonadotropin pretreatment and in different reproductive stages.
Theriogenology, 43(3):667–75.
BURNS, P. D., SPITZER, J. C. und HENRICKS, D. M. (1997):
Effect of dietary energy restriction on follicular development and luteal function in nonlactating
beef cows.
Journal of Animal Science, 75(4):1078–86.
CAHILL, M. A. (2007):
Progesterone receptor membrane component 1: An integrative review.
The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology, 105(1-5):16–36.
CAI, Z. und STOCCO, C. (2005):
Expression and regulation of progestin membrane receptors in the rat corpus luteum.
Endocrinology, 146(12):5522–32.
CALDER, M. D., CAVENEY, A. N., SIRARD, M.-A. und WATSON, A. J. (2005):
Effect of serum and cumulus cell expansion on marker gene transcripts in bovine cumulusoocyte
complexes during maturation in vitro.
Fertility and Sterility, 83(4, Supplement 1):1077–1085.
CALDER, M. D., CAVENEY, A. N., WESTHUSIN, M. E. und WATSON, A. J. (2001):
Cyclooxygenase-2 and prostaglandin E2 (PGE2) receptor messenger RNAs are affected by
bovine oocyte maturation time and cumulus-oocyte complex quality, and pge2 induces moderate
expansion of the bovine cumulus in vitro.
Biology of Reproduction, 65(1):135–140.
CALLESEN, H., GREVE, T. und CHRISTENSEN, F. (1987):
Ultrasonically guided aspiration of bovine follicular oocytes.
123

Literaturverzeichnis
Theriogenology, 27(1):217–217.
CARLIN, S. K., GARST, A. S., TARRAF, C. G., BAILEY, T. L., MCGILLIARD, M. L., GIB-
BONS, J. R., AHMADZADEH, A. und GWAZDAUSKAS, F. C. (1999):
Effects of ultrasound-guided transvaginal follicular aspiration on oocyte recovery and hormonal
profiles before and after GnRH treatment.
Theriogenology, 51(8):1489–503.
CASSAR, C. A., DOW, M. P., PURSLEY, J. R. und SMITH, G. W. (2002):
Effect of the preovulatory LH surge on bovine follicular progesterone receptor mRNA expression.
Domest Anim Endocrinol, 22(3):179–87.
CENEDELLA, R. J., SEXTON, P. S. und ZHU, X. L. (1999):
Lens epithelia contain a high-affinity, membrane steroid hormone-binding protein.
Invest Ophthalmol Vis Sci, 40(7):1452–9.
CERRI, R.L.A., CHEBEL, R.C., RIVERA, F., NARCISO, C.D., OLIVEIRA, R.A., AM-
STALDEN, M., BAEZ-SANDOVAL, G.M., OLIVEIRA, L.J., THATCHER, W.W. und SANTOS,
J.E.P. (2011a):
Concentration of progesterone during the development of the ovulatory follicle: II. ovarian and
uterine responses.
Journal of Dairy Science, 94(7):3352 – 3365.
CERRI, R.L.A., CHEBEL, R.C., RIVERA, F., NARCISO, C.D., OLIVEIRA, R.A., THAT-
CHER, W.W. und SANTOS, J.E.P. (2011b):
Concentration of progesterone during the development of the ovulatory follicle: I. ovarian and
embryonic responses.
Journal of Dairy Science, 94(7):3342 – 3351.
CERRI, R. L. A., RUTIGLIANO, H. M., CHEBEL, R. C. und SANTOS, J. E. P. (2009):
Period of dominance of the ovulatory follicle influences embryo quality in lactating dairy
cows.
Reproduction, 137(5):813–823.
CHASTANT-MAILLARD, S., QUINTON, H., LAUFFENBURGER, J., CORDONNIER-LEFORT,
N., RICHARD, C., MARCHAL, J., MORMEDE, P. und RENARD, J. P. (2003):
Consequences of transvaginal follicular puncture on well-being in cows.
Reproduction, 125(4):555–63.
CHAUBAL, S. A., MOLINA, J. A., OHLRICHS, C. L., FERRE, L. B., FABER, D. C., BOLS,
P. E., RIESEN, J. W., TIAN, X. und YANG, X. (2006):
Comparison of different transvaginal ovum pick-up protocols to optimise oocyte retrieval and
embryo production over a 10-week period in cows.
Theriogenology, 65(8):1631–48.
CHU, T., DUFORT, I. und SIRARD, M.-A. (2012):
Effect of ovarian stimulation on oocyte gene expression in cattle.
Theriogenology, 77(9):1928 – 1938.
CLEMENTE, M., DE LA FUENTE, J., FAIR, T., AL NAIB, A., GUTIERREZ-ADAN, A., RO-
124

CHE, J. F., RIZOS, D. und LONERGAN, P. (2009):
Progesterone and conceptus elongation in cattle: a direct effect on the embryo or an indirect
effect via the endometrium?
Reproduction, 138(3):507–17.
CORDOVA, B., MORATO, R., DE FRUTOS, C., BERMEJO-ALVAREZ, P., PARAMIO, T.,
GUTIERREZ-ADAN, A. und MOGAS, T. (2011):
Effect of leptin during in vitro maturation of prepubertal calf oocytes: embryonic development
and relative mRNA abundances of genes involved in apoptosis and oocyte competence.
Theriogenology.
COTICCHIO, G., ROSSI, G., BORINI, A., GRANDAHL, C., MACCHIARELLI, G., FLAMIGNI,
C., FLEMING, S. und CECCONI, S. (2004):
Mouse oocyte meiotic resumption and polar body extrusion in vitro are differentially influenced
by FSH, epidermal growth factor and meiosis-activating sterol.
Human Reproduction, 19(12):2913–2918.
COVELLO, K. L., SIMON, M. C. und KEITH, B. (2005):
Targeted replacement of hypoxia-inducible factor-1alpha by a hypoxia-inducible factor-2alpha
knock-in allele promotes tumor growth.
Cancer Res, 65(6):2277–86.
CRUDDEN, G., CHITTI, R. E. und CRAVEN, R. J. (2006):
Hpr6 (heme-1 domain protein) regulates the susceptibility of cancer cells to chemotherapeutic
drugs.
Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 316(1):448–455.
CUNHA, A. C.VIOLINO, BURKE, T. N., FRANCA, F. J. R. und MARQUES, A. P. (2008):
Effect of global posture reeducation and of static stretching on pain, range of motion, and
quality of life in women with chronic neck pain: a randomized clinical trial.
Clinics, 63:763 – 770.
DE LOOS, F., VAN MAURIK, P., VAN BENEDEN, T. und KRUIP, T. A. (1992):
Structural aspects of bovine oocyte maturation in vitro.
Mol Reprod Dev, 31(3):208–14.
DE LOS REYES, M., VILLAGRAN, M. L., CEPEDA, R., DUCHENS, M., PARRAGUEZ, V.
und URQUIETA, B. (2006):
Histological characteristics and steroid concentration of ovarian follicles at different stages of
development in pregnant and non-pregnant dairy cows.
Vet Res Commun, 30(2):161–73.
DE ROOVER, R., FEUGANG, J. M., BOLS, P. E., GENICOT, G. und HANZEN, CH (2008):
Effects of ovum pick-up frequency and fsh stimulation: a retrospective study on seven years
of beef cattle in vitro embryo production.
Reprod Domest Anim, 43(2):239–45.
DE WIT, A. A. und KRUIP, T. A. (2001):
Bovine cumulus-oocyte-complex-quality is reflected in sensitivity for alpha-amanitin, oocytediameter
and developmental capacity.
125

Literaturverzeichnis
Anim Reprod Sci, 65(1-2):51–65.
DE WIT, A. A., WURTH, Y. A. und KRUIP, T. A. (2000):
Effect of ovarian phase and follicle quality on morphology and developmental capacity of the
bovine cumulus-oocyte complex.
J Anim Sci, 78(5):1277–83.
DENICOL, A. C., LOPES, G., JR., MENDONGA, L. G. D., RIVERA, F. A., GUAGNINI, F.,
PEREZ, R. V., LIMA, J. R., BRUNO, R. G. S., SANTOS, J. E. P. und CHEBEL, R. C. (2012):
Low progesterone concentration during the development of the first follicular wave reduces
pregnancy per insemination of lactating dairy cows.
Journal of Dairy Science, 95(4):1794–1806.
D’HAESELEER, M., SIMOENS, P. und VAN DEN BROECK, W. (2007):
Cell-specific localization of progesterone receptors in the bovine ovary at different stages of
the oestrous cycle.
Anim Reprod Sci, 98(3-4):271–81.
DIAS, F.C.F., MAPLETOFT, R.J., KASTELIC, J.P., ADAMS, G.P., COLAZO, M.G., STO-
VER, B.C., DOCHI, O. und SINGH, J. (2012):
Effect of length of progesterone exposure during ovulatory wave development on pregnancy
rate.
Theriogenology, 77(2):437 – 444.
DIAZ, F. J., ANDERSON, L. E., WU, Y. L., RABOT, A., TSAI, S. J. und WILTBANK, M. C.
(2002):
Regulation of progesterone and prostaglandin F2[α production in the CL.
Molecular and Cellular Endocrinology, 191(1):65–80.
DIAZ, T., MANZO, M., TROCONIZ, J., BENACCHIO, N. und VERDE, O. (1986):
Plasma progesterone levels during the estrous cycle of Holstein and Brahman cows, Carora
type and cross-bred heifers.
Theriogenology, 26(4):419–32.
DIELEMAN, S. J., KRUIP, T. A., FONTIJNE, P., DE JONG, W. H. und VAN DER WEYDEN,
G. C. (1983):
Changes in oestradiol, progesterone and testosterone concentrations in follicular fluid and in
the micromorphology of preovulatory bovine follicles relative to the peak of luteinizing hormone.
J Endocrinol, 97(1):31–42.
DODE, M., DUFORT, I., MASSICOTTE, L. und SIRARD, M.-A. (2006):
Quantitative expression of candidate genes for developmental competence in bovine two-cell
embryos.
Molecular Reproduction and Development, 73(3):288–297.
DODE, M. A. und GRAVES, C. (2002):
Involvement of steroid hormones on in vitro maturation of pig oocytes.
Theriogenology, 57(2):811–21.
DOMINGUEZ, M. M. (1995):
126

Effects of body condition, reproductive status and breed on follicular population and oocyte
quality in cows.
Theriogenology, 43(8):1405–1418.
DOMINKO, T. und FIRST, N. L. (1992):
Kinetics of bovine oocyte maturation allows selection for developmental competence and is
affected by gonadotropins.
Theriogenology, 37(1):203–203.
DOMINKO, T. und FIRST, N. L. (1997):
Timing of meiotic progression in bovine oocytes and its effect on early embryo development.
Molecular Reproduction and Development, 47(4):456–467.
DONG, J., ALBERTINI, D. F., NISHIMORI, K., KUMAR, T. R., LU, N. und MATZUK, M. M.
(1996):
Growth differentiation factor-9 is required during early ovarian folliculogenesis.
Nature, 383(6600):531–5.
DONNISON, M. und PFEFFER, P. L. (2004):
Isolation of genes associated with developmentally competent bovine oocytes and quantitation
of their levels during development.
Biol Reprod, 71(6):1813–21.
DRALLMEYER, S. (2008):
Vergleichende Darstellung der DNA-Methyltransferase 1 und 3a mittels Immunzytochemie in
frühen bovinen Embryonalstadien (Tag 1 - 7) aus In-vivo- und In-vitro-Produktion .
Hannover, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover, Dissertation.
DRESSING, G. E., GOLDBERG, J. E., CHARLES, N. J., SCHWERTFEGER, K. L. und LAN-
GE, C. A. (2011):
Membrane progesterone receptor expression in mammalian tissues: a review of regulation and
physiological implications.
Steroids, 76(1-2):11–7.
DRIVER, A., PENAGARICANO, F., HUANG, W., AHMAD, K., HACKBART, K., WILTBANK,
M. und KHATIB, H. (2012):
Rna-seq analysis uncovers transcriptomic variations between morphologically similar in vivoand
in vitro-derived bovine blastocysts.
BMC Genomics, 13(1):118.
DUBE, J. L., WANG, P., ELVIN, J., LYONS, K. M., CELESTE, A. J. und MATZUK, M. M.
(1998):
The bone morphogenetic protein 15 gene is X-linked and expressed in oocytes.
Mol Endocrinol, 12(12):1809–17.
DUFFY, D. M., WELLS, T. R., HALUSKA, G. J. und STOUFFER, R. L. (1997):
The ratio of progesterone receptor isoforms changes in the monkey corpus luteum during the
luteal phase of the menstrual cycle.
Biol Reprod, 57(4):693–9.
ECHTERNKAMP, S. E., CUSHMAN, R. A. und ALLAN, M. F. (2009):
127

Literaturverzeichnis
Size of ovulatory follicles in cattle expressing multiple ovulations naturally and its influence
on corpus luteum development and fertility.
Journal of Animal Science, 87(11):3556–3568.
ECKERT, J. und NIEMANN, H. (1995):
In vitro maturation, fertilization and culture to blastocysts of bovine oocytes in protein-free
media.
Theriogenology, 43(7):1211–25.
EISSA, H. M. (1996):
Concentrations of steroids and biochemical constituents in follicular fluid of buffalo cows
during different stages of the oestrous cycle.
Br Vet J, 152(5):573–81.
EL-SAYED, A., HOELKER, M., RINGS, F., SALILEW, D., JENNEN, D., THOLEN, E., SI-
RARD, M. A., SCHELLANDER, K. und TESFAYE, D. (2006):
Large-scale transcriptional analysis of bovine embryo biopsies in relation to pregnancy success
after transfer to recipients.
Physiol Genomics, 28(1):84–96.
ELLEDEROVA, Z., HALADA, P., MAN, P., KUBELKA, M., MOTLIK, J. und KOVAROVA, H.
(2004):
Protein patterns of pig oocytes during in vitro maturation.
Biology of Reproduction, 71(5):1533–1539.
ELVIN, J. A., CLARK, A. T., WANG, P., WOLFMAN, N. M. und MATZUK, M. M. (1999):
Paracrine actions of growth differentiation factor-9 in the mammalian ovary.
Mol Endocrinol, 13(6):1035–48.
EMA, M., TAYA, S., YOKOTANI, N., SOGAWA, K., MATSUDA, Y. und FUJII-KURIYAMA,
Y. (1997):
A novel bHLH-PAS factor with close sequence similarity to hypoxia-inducible factor 1alpha
regulates the VEGF expression and is potentially involved in lung and vascular development.
Proc Natl Acad Sci U S A, 94(9):4273–8.
ERICKSON, G. F. und SHIMASAKI, S. (2000):
The role of the oocyte in folliculogenesis.
Trends Endocrinol Metab, 11(5):193–8.
EYESTONE, W. H. und FIRST, N. L. (1989):
Co-culture of early cattle embryos to the blastocyst stage with oviducal tissue or in conditioned
medium.
J Reprod Fertil, 85(2):715–20.
FAIR, T. (2003):
Follicular oocyte growth and acquisition of developmental competence.
Animal Reproduction Science, 78(3-4):203 – 216. Ovarian Follicle Development.
FAIR, T. (2010):
Mammalian oocyte development: checkpoints for competence.
Reprod Fertil Dev, 22(1):13–20.
128

FAIR, T., HYTTEL, P. und GREVE, T. (1995):
Bovine oocyte diameter in relation to maturational competence and transcriptional activity.
Mol Reprod Dev, 42(4):437–42.
FAIR, T. und LONERGAN, P. (2012):
The role of progesterone in oocyte acquisition of developmental competence.
Reproduction in Domestic Animals, 47:142–147.
FALKENSTEIN, E., EISEN, CH., SCHMIEDING, K., KRAUTKRÄMER, M., STEIN, C., LÖ-
SEL, R. und WEHLING, M. (2001):
Chemical modification and structural analysis of the progesterone membrane binding protein
from porcine liver membranes.
Molecular and Cellular Biochemistry, 218(1):71–79.
FALKENSTEIN, E., MEYER, C., EISEN, C., SCRIBA, P. C. und WEHLING, M. (1996):
Full-length cdna sequence of a progesterone membrane-binding protein from porcine vascular
smooth muscle cells.
Biochemical and Biophysical Research Communications, 229(1):86–89.
FARIN, C.E., MOELLER, C.L., SAWYER, H.R., GAMBONI, F. und NISWENDER, G.D.
(1986):
Morphometric analysis of cell types in the ovine corpus luteum throughout the estrous cycle.
Biology of Reproduction, 35(5):1299–1308.
FATEHI, A. N., ZEINSTRA, E. C., KOOIJ, R. V., COLENBRANDER, B. und BEVERS, M. M.
(2002):
Effect of cumulus cell removal of in vitro matured bovine oocytes prior to in vitro fertilization
on subsequent cleavage rate.
Theriogenology, 57(4):1347–55.
FENG, W. G., SUI, H. S., HAN, Z. B., CHANG, Z. L., ZHOU, P., LIU, D. J., BAO, S. und
TAN, J. H. (2007):
Effects of follicular atresia and size on the developmental competence of bovine oocytes: A
study using the well-in-drop culture system.
Theriogenology, 67(8):1339–1350.
FERGUSON, C. E., DAVIDSON, T. R., MELLO, M. R. B., LIMA, A. S., KESLER, D. J.,
WHEELER, M. B. und GODKE, R. A. (2004):
Evidence of a direct effect of P4 on IVF-derived bovine 8-cell embryos.
Reproduction, Fertility and Development, 17(2):219–219.
FIELDS, M. J. und FIELDS, P. A. (1996):
Morphological characteristics of the bovine corpus luteum during the estrous cycle and pregnancy.
Theriogenology, 45(7):1295–1325.
FLAMME, I., FROHLICH, T., VON REUTERN, M., KAPPEL, A., DAMERT, A. und RISAU,
W. (1997):
HRF, a putative basic helix-loop-helix-PAS-domain transcription factor is closely related to
hypoxia-inducible factor-1 alpha and developmentally expressed in blood vessels.
129

Literaturverzeichnis
Mech Dev, 63(1):51–60.
FORDE, N., BELTMAN, M. E., LONERGAN, P., DISKIN, M., ROCHE, J. F. und CROWE,
M. A. (2011):
Oestrous cycles in Bos taurus cattle.
Anim Reprod Sci, 124(3-4):163–9.
FORTUNE, J. E. und HANSEL, W. (1985):
Concentrations of steroids and gonadotropins in follicular fluid from normal heifers and heifers
primed for superovulation.
Biol Reprod, 32(5):1069–79.
FORTUNE, J. E., RIVERA, G. M., EVANS, A. C. O. und TURZILLO, A. M. (2001):
Differentiation of dominant versus subordinate follicles in cattle.
Biology of Reproduction, 65(3):648–654.
FRY, R. C., SIMPSON, T. L., SQUIRES, T. J., PARR, R. A. und DAMANIK, R. M. (1994):
Factors affecting transvaginal oocyte pick up in heifers.
Theriogenology, 41(1):197–197.
FUKUI, Y. (1989):
Effects of sera and steroid hormones on development of bovine oocytes matured and fertilized
in vitro and co-cultured with bovine oviduct epithelial cells.
J Anim Sci, 67(5):1318–23.
FUKUI, Y., FUKUSHIMA, M., TERAWAKI, Y. und ONO, H. (1982):
Effect of gonadotropins, steroids and culture media on bovine oocyte maturation in vitro.
Theriogenology, 18(2):161–75.
GAD, A., HOELKER, M., BESENFELDER, U., HAVLICEK, V., CINAR, U., RINGS, F.,
HELD, E., DUFORT, I., SIRARD, M.-A., SCHELLANDER, K. und TESFAYE, D. (2012):
Molecular mechanisms and pathways involved in bovine embryonic genome activation and
their regulation by alternative in vivo and in vitro culture conditions.
Biology of Reproduction.
GÁL, Á. B., CARNWATH, J. W., DINNYES, A., HERRMANN, D., NIEMANN, H. und WREN-
ZYCKI, C. (2006):
Comparison of real-time polymerase chain reaction and end-point polymerase chain reaction
for the analysis of gene expression in preimplantation embryos.
Reproduction, Fertility and Development, 18(3):365–371.
GALLI, C., CROTTI, G., NOTARI, C., TURINI, P., DUCHI, R. und LAZZARI, G. (2001):
Embryo production by ovum pick up from live donors.
Theriogenology, 55(6):1341–57.
GALLI, C., DUCHI, R., CROTTI, G., TURINI, P., PONDERATO, N., COLLEONI, S., LAGU-
TINA, I. und LAZZARI, G. (2004):
Production and quality of bovine oocytes and embryos.
Vet Res Commun, 28 Suppl 1:121–6.
GALLOWAY, S. M., MCNATTY, K. P., CAMBRIDGE, L. M., LAITINEN, M. P., JUENGEL,
130

J. L., JOKIRANTA, T. S., MCLAREN, R. J., LUIRO, K., DODDS, K. G., MONTGOMERY,
G. W., BEATTIE, A. E., DAVIS, G. H. und RITVOS, O. (2000):
Mutations in an oocyte-derived growth factor gene (BMP15) cause increased ovulation rate
and infertility in a dosage-sensitive manner.
Nat Genet, 25(3):279–83.
GANDOLFI, F., LUCIANO, A. M., MODINA, S., PONZINI, A., POCAR, P., ARMSTRONG,
D. T. und LAURIA, A. (1997):
The in vitro developmental competence of bovine oocytes can be related to the morphology of
the ovary.
Theriogenology, 48(7):1153–1160.
GARCIA, A. und SALAHEDDINE, M. (1998):
Effects of repeated ultrasound-guided transvaginal follicular aspiration on bovine oocyte recovery
and subsequent follicular development.
Theriogenology, 50(4):575–85.
GARDNER, H. G. und KAYE, P. L. (1995):
Characterization of glucose transport in preimplantation mouse embryos.
Reprod Fertil Dev, 7(1):41–50.
GAVA, N., CLARKE, C. L., BYTH, K., ARNETT-MANSFIELD, R. L. und DEFAZIO, A.
(2004):
Expression of progesterone receptors A and B in the mouse ovary during the estrous cycle.
Endocrinology, 145(7):3487–94.
GENDELMAN, M., AROYO, A., YAVIN, S. und ROTH, Z. (2010):
Seasonal effects on gene expression, cleavage timing, and developmental competence of bovine
preimplantation embryos.
Reproduction, 140(1):73–82.
GIBBONS, J. R., BEAL, W. E., KRISHER, R. L., FABER, E. G., PEARSON, R. E. und
GWAZDAUSKAS, F. C. (1994):
Effects of once- versus twice-weekly transvaginal follicular aspiration on bovine oocyte recovery
and embryo development.
Theriogenology, 42(3):405–19.
GILCHRIST, R. B. und THOMPSON, J. G. (2007):
Oocyte maturation: Emerging concepts and technologies to improve developmental potential
in vitro.
Theriogenology, 67(1):6–15.
GINTHER, O. J., WILTBANK, M. C., FRICKE, P. M., GIBBONS, J. R. und KOT, K. (1996):
Selection of the dominant follicle in cattle.
Biol Reprod, 55(6):1187–94.
GOFF, A. K. und SMITH, L. C. (1998):
Effect of steroid treatment of endometrial cells on blastocyst development during co-culture.
Theriogenology, 49(5):1021–30.
GOODHAND, K. L., WATT, R. G., STAINES, M. E., HUTCHINSON, J. S. und BROADBENT,
131

Literaturverzeichnis
P. J. (1999):
In vivo oocyte recovery and in vitro embryo production from bovine donors aspirated at different
frequencies or following FSH treatment.
Theriogenology, 51(5):951–61.
GRISART, B., MASSIP, A. und DESSY, F. (1994):
Cinematographic analysis of bovine embryo development in serum-free oviduct-conditioned
medium.
Journal of Reproduction and Fertility, 101(2):257–264.
GU, Y. Z., MORAN, S. M., HOGENESCH, J. B., WARTMAN, L. und BRADFIELD, C. A.
(1998):
Molecular characterization and chromosomal localization of a third alpha-class hypoxia inducible
factor subunit, HIF3alpha.
Gene Expr, 7(3):205–13.
GUPTA, M. K., JANG, J. M., JUNG, J. W., UHM, S. J., KIM, K. P. und LEE, H. T. (2009):
Proteomic analysis of parthenogenetic and in vitro fertilized porcine embryos.
Proteomics, 9(10):2846–60.
GYGI, S. P., ROCHON, Y., FRANZA, B. R. und AEBERSOLD, R. (1999):
Correlation between protein and mRNA abundance in yeast.
Mol Cell Biol, 19(3):1720–30.
HAGEMANN, L. J. (1999):
Influence of the dominant follicle on oocytes from subordinate follicles.
Theriogenology, 51(2):449–459.
HAHN, J. (1978):
Non-surgical collection of cattle ova with emphasis on the preparation of the donor animal and
on the tubal and uterine development of the ovum.
Dtsch Tierarztl Wochenschr, 85(4):140–5.
HANENBERG, E. H. A. T. und VAN WAGTENDONK-DE LEEUW, A. M. (1997):
Comparison of 3, 4, or 7 day interval between oocyte collections for in vitro embryo production
results.
Theriogenology, 47(1):158–158.
HANSTEDT, A. (2009):
Beurteilung der Entwicklungskompetenz boviner Oozyten aus Follikeln mit unterschiedlicher
Durchblutung der Follikelwand.
Hannover, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover, Dissertation.
HARPER, K. M. und BRACKETT, B. G. (1993):
Bovine blastocyst development after in vitro maturation in a defined medium with epidermal
growth factor and low concentrations of gonadotropins.
Biology of Reproduction, 48(2):409–416.
HARVEY, A. J., KIND, K. L., PANTALEON, M., ARMSTRONG, D. T. und THOMPSON, J. G.
(2004):
Oxygen-regulated gene expression in bovine blastocysts.
132

Biology of Reproduction, 71(4):1108–1119.
HARVEY, A. J., SANTOS, A. NAVARRETE, KIRSTEIN, M., KIND, K. L., FISCHER, B. und
THOMPSON, J. G. (2007):
Differential expression of oxygen-regulated genes in bovine blastocysts.
Molecular Reproduction and Development, 74(3):290–299.
HASHIMOTO, S., MINAMI, N., TAKAKURA, R., YAMADA, M., IMAI, H. und KASHIMA,
N. (2000):
Low oxygen tension during in vitro maturation is beneficial for supporting the subsequent
development of bovine cumulus-oocyte complexes.
Molecular Reproduction and Development, 57(4):353–360.
HASHIMOTO, S., TAKAKURA, R., KISHI, M., SUDO, T., MINAMI, N. und YAMADA, M.
(1999):
Ultrasound-guided follicle aspiration: the collection of bovine cumulus-oocyte complexes
from ovaries of slaughtered or live cows.
Theriogenology, 51(4):757–65.
HASLER, J. F., HENDERSON, W. B., HURTGEN, P. J., JIN, Z. Q., MCCAULEY, A. D.,
MOWER, S. A., NEELY, B., SHUEY, L. S., STOKES, J. E. und TRIMMER, S. A. (1995):
Production, freezing and transfer of bovine IVF embryos and subsequent calving results.
Theriogenology, 43(1):141–152.
HAYASHI, K. G., MATSUI, M., ACOSTA, T. J., KIDA, K. und MIYAMOTO, A. (2006):
Effect of the dominant follicle aspiration before or after luteinizing hormone surge on the
corpus luteum formation in the cow.
J Reprod Dev, 52(1):129–35.
HAYASHI, K.-G., MATSUI, M., SHIMIZU, T., SUDO, N., SATO, A., SHIRASUNA, K., TET-
SUKA, M., KIDA, K., SCHAMS, D. und MIYAMOTO, A. (2008):
The absence of corpus luteum formation alters the endocrine profile and affects follicular development
during the first follicular wave in cattle.
Reproduction, 136(6):787–797.
HAZELEGER, N. L., HILL, D. J., STUBBING, R. B. und WALTON, J. S. (1995):
Relationship of morphology and follicular fluid environment of bovine oocytes to their developmental
potential in vitro.
Theriogenology, 43(2):509–22.
HENDRIKSEN, P. J., STEENWEG, W. N., HARKEMA, J. C., MERTON, J. S., BEVERS,
M. M., VOS, P. L. und DIELEMAN, S. J. (2004):
Effect of different stages of the follicular wave on in vitro developmental competence of bovine
oocytes.
Theriogenology, 61(5):909–20.
HERRICK, J. R., LANE, M., GARDNER, D. K., BEHBOODI, E., MEMILI, E., BLASH, S.,
ECHELARD, Y. und KRISHER, R. L. (2006):
Metabolism, protein content, and in vitro embryonic development of goat cumulus-oocyte
complexes matured with physiological concentrations of glucose and L-lactate.
133

Literaturverzeichnis
Molecular Reproduction and Development, 73(2):256–266.
HERZOG, K., BROCKHAN-LÜDEMANN, M., KASKE, M., BEINDORFF, N., PAUL, V., NIE-
MANN, H. und BOLLWEIN, H. (2010):
Luteal blood flow is a more appropriate indicator for luteal function during the bovine estrous
cycle than luteal size.
Theriogenology, 73(5):691 – 697.
HOGENESCH, J. B., CHAN, W. K., JACKIW, V. H., BROWN, R. C., GU, Y. Z., PRAY-
GRANT, M., PERDEW, G. H. und BRADFIELD, C. A. (1997):
Characterization of a subset of the basic-helix-loop-helix-PAS superfamily that interacts with
components of the dioxin signaling pathway.
J Biol Chem, 272(13):8581–93.
HOSOE, M., KANEYAMA, K., USHIZAWA, K., HAYASHI, K.-G. und T., TORU (2011):
Quantitative analysis of bone morphogenetic protein 15 (BMP15) and growth differentiation
factor 9 (GDF9) gene expression in calf and adult bovine ovaries.
Reproductive Biology and Endocrinology, 9(1):33.
HOU, Q. und GORSKI, J. (1993):
Estrogen receptor and progesterone receptor genes are expressed differentially in mouse embryos
during preimplantation development.
Proceedings of the National Academy of Sciences, 90(20):9460–9464.
HUMBLOT, P., HOLM, P., LONERGAN, P., WRENZYCKI, C., LEQUARRE, A. S., JOLY,
C. G., HERRMANN, D., LOPES, A., RIZOS, D., NIEMANN, H. und CALLESEN, H. (2005):
Effect of stage of follicular growth during superovulation on developmental competence of
bovine oocytes.
Theriogenology, 63(4):1149–66.
HUSSEIN, T. S., THOMPSON, J. G. und GILCHRIST, R. B. (2006):
Oocyte-secreted factors enhance oocyte developmental competence.
Dev Biol, 296(2):514–21.
HYTTEL, P., CALLESEN, H. und GREVE, T. (1986):
Ultrastructural features of preovulatory oocyte maturation in superovulated cattle.
J Reprod Fertil, 76(2):645–56.
IRELAND, J. J. und ROCHE, J. F. (1982):
Development of antral follicles in cattle after prostaglandin-induced luteolysis: Changes in
serum hormones, steroids in follicular fluid, and gonadotropin receptors.
Endocrinology, 111(6):2077–2086.
IZADYAR, F., ZEINSTRA, E. und BEVERS, M. M. (1998):
Follicle-stimulating hormone and growth hormone act differently on nuclear maturation while
both enhance developmental competence of in vitro matured bovine oocytes.
Mol Reprod Dev, 51(3):339–45.
JAVED, M. H. und WRIGHT, JR., R. W. (1991):
Determination of pentose phosphate and Embden-Meyerhof pathway activities in bovine embryos.
134

Theriogenology, 35(5):1029–37.
JEWGENOW, K., HEERDEGEN, B. und MÜLLER, K. (1999):
In vitro development of individually matured bovine oocytes in relation to follicular wall atresia.
Theriogenology, 51(4):745–756.
JIANG, H. S., WANG, W. L., LU, K. H., GORDON, I. und POLGE, C. (1992):
Examination of cell numbers of blastocysts derived from IVM, IVF and IVC of bovine follicular
oocytes.
Theriogenology, 37(1):229–229.
JIANG, L., MARJANI, S. L., BERTOLINI, M., ANDERSON, G. B., YANG, X. und TIAN,
X. C. (2011):
Indistinguishable transcriptional profiles between in vitro- and in vivo-produced bovine fetuses.
Molecular Reproduction and Development, 78(9):642–650.
JOOST, H. G., BELL, G. I., BEST, J. D., BIRNBAUM, M. J., CHARRON, M. J., CHEN, Y. T.,
DOEGE, H., JAMES, D. E., LODISH, H. F., MOLEY, K. H., MOLEY, J. F., MUECKLER, M.,
ROGERS, S., SCHURMANN, A., SEINO, S. und THORENS, B. (2002):
Nomenclature of the GLUT/SLC2A family of sugar/polyol transport facilitators.
Am J Physiol Endocrinol Metab, 282(4):E974–6.
JORRITSMA, R., CESAR, M. L., HERMANS, J. T., KRUITWAGEN, C. L., VOS, P. L. und
KRUIP, T. A. (2004):
Effects of non-esterified fatty acids on bovine granulosa cells and developmental potential of
oocytes in vitro.
Anim Reprod Sci, 81(3-4):225–35.
JUENGEL, J. L., HUDSON, N. L., BERG, M., HAMEL, K., SMITH, P., LAWRENCE, S. B.,
WHITING, L. und MCNATTY, K. P. (2009):
Effects of active immunization against growth differentiation factor 9 and/or bone morphogenetic
protein 15 on ovarian function in cattle.
Reproduction, 138(1):107–14.
JUENGEL, J. L., HUDSON, N. L., WHITING, L. und MCNATTY, K. P. (2004):
Effects of immunization against bone morphogenetic protein 15 and growth differentiation
factor 9 on ovulation rate, fertilization, and pregnancy in ewes.
Biol Reprod, 70(3):557–61.
KARIAGINA, A., AUPPERLEE, M. D. und HASLAM, S. Z. (2007):
Progesterone receptor isoforms and proliferation in the rat mammary gland during development.
Endocrinology, 148(6):2723–36.
KARLACH, V. (1987):
The effect of FSH, LH, oestradiol-17 beta, and progesterone on cytoplasmic maturation of
bovine follicular oocytes in vitro.
Folia Biol (Praha), 33(4):258–65.
135

Literaturverzeichnis
KASTELIC, J.P., PIERSON, R.A. und GINTHER, O.J. (1990):
Ultrasonic morphology of corpora lutea and central luteal cavities during the estrous cycle and
early pregnancy in heifers.
Theriogenology, 34(3):487 – 498.
KATZ-JAFFE, M. G., MCCALLIE, B. R., PREIS, K. A., FILIPOVITS, J. und GARDNER,
D. K. (2009):
Transcriptome analysis of in vivo and in vitro matured bovine MII oocytes.
Theriogenology, 71(6):939–946.
KENDRICK, K. W., BAILEY, T. L., GARST, A. S., PRYOR, A. W., AHMADZADEH, A.,
AKERS, R. M., EYESTONE, W. E., PEARSON, R. E. und GWAZDAUSKAS, F. C. (1999):
Effects of energy balance on hormones, ovarian activity, and recovered oocytes in lactating
holstein cows using transvaginal follicular aspiration.
Journal of dairy science, 82(8):1731–1741.
KEPKOVA, K. V., VODICKA, P., TORALOVA, T., LOPATAROVA, M., CECH, S., DOLEZEL,
R., HAVLICEK, V., BESENFELDER, U., KUZMANY, A., SIRARD, M. A., LAURINCIK, J.
und KANKA, J. (2011):
Transcriptomic analysis of in vivo and in vitro produced bovine embryos revealed a developmental
change in cullin 1 expression during maternal-to-embryonic transition.
Theriogenology, 75(9):1582–95.
KESKINTEPE, L. und BRACKETT, B. G. (1996):
In vitro developmental competence of in vitro-matured bovine oocytes fertilized and cultured
in completely defined media.
Biol Reprod, 55(2):333–9.
KHURANA, N. K. und NIEMANN, H. (2000a):
Effects of oocyte quality, oxygen tension, embryo density, cumulus cells and energy substrates
on cleavage and morula/blastocyst formation of bovine embryos.
Theriogenology, 54(5):741–56.
KHURANA, N. K. und NIEMANN, H. (2000b):
Energy metabolism in preimplantation bovine embryos derived in vitro or in vivo.
Biol Reprod, 62(4):847–56.
KIDDER, G. M. (1992):
The genetic program for preimplantation development.
Developmental Genetics, 13(5):319–325.
KIM, J., BAGCHI, I. C. und BAGCHI, M. K. (2009):
Control of ovulation in mice by progesterone receptor-regulated gene networks.
Mol Hum Reprod, 15(12):821–8.
KLOSSOK, G., HADELER, K. G., LEMME, E., RATH, D., SCHINDLER, L. und NIEMANN,
H. (1997):
Estrus cyclicity and pregnancy establishment during ultrasound-guided follicular aspiration in
dairy cows.
Theriogenology, 47(1):160–160.
136

KNIJN, H. M., WRENZYCKI, C., HENDRIKSEN, P. J., VOS, P. L., ZEINSTRA, E. C.,
VAN DER WEIJDEN, G. C., NIEMANN, H. und DIELEMAN, S. J. (2005):
In vitro and in vivo culture effects on mRNA expression of genes involved in metabolism and
apoptosis in bovine embryos.
Reprod Fertil Dev, 17(8):775–84.
KONISHI, M., AOYAGI, Y., TAKEDOMI, T., ITAKURA, H., ITOH, T. und YAZAWA, S.
(1996):
Presence of granulosa cells during oocyte maturation improved in vitro development of IVM-
IVF bovine oocytes that were collected by ultrasound-guided transvaginal aspiration.
Theriogenology, 45(3):573–581.
KORHONEN, K., KANANEN, K., KETOJA, E., MATOMÄKI, J., HALMEKYTÖ, M. und PEIP-
PO, J. (2010):
Effects of serum-free in vitro maturation of bovine oocytes on subsequent embryo development
and cell allocation in two developmental stages of day 7 blastocysts.
Reproduction in Domestic Animals, 45(1):42–49.
KOTWICA, J., REKAWIECKI, R. und DURAS, M. (2004):
Stimulatory influence of progesterone on its own synthesis in bovine corpus luteum.
Bulletin of the Veterinary Institute in Pulawy, 48:139–145.
KOWALIK, M. K. und KOTWICA, J. (2008):
Progesterone receptor membrane component 1 (PGRMC1) gene expression in corpus luteum
during the estrous cycle in cows.
Reprod Biol, 8(3):291–7.
KREBS, C. J., JARVIS, E. D., CHAN, J., LYDON, J. P., OGAWA, S. und PFAFF, D. W.
(2000):
A membrane-associated progesterone-binding protein, 25-Dx, is regulated by progesterone in
brain regions involved in female reproductive behaviors.
Proceedings of the National Academy of Sciences, 97(23):12816–12821.
KRISHER, R. L., LANE, M. und BAVISTER, B. D. (1999):
Developmental competence and metabolism of bovine embryos cultured in semi-defined and
defined culture media.
Biology of Reproduction, 60(6):1345–1352.
KRUIP, T. A. und DIELEMAN, S. J. (1985):
Steroid hormone concentrations in the fluid of bovine follicles relative to size, quality and
stage of the oestrus cycle.
Theriogenology, 24(4):395–408.
KRUIP, T. A. und DEN DAAS, J. H. (1997):
In vitro produced and cloned embryos: Effects on pregnancy, parturition and offspring.
Theriogenology, 47(1):43–52.
KUES, W. A., SUDHEER, S., HERRMANN, D., CARNWATH, J. W., HAVLICEK, V., BESEN-
FELDER, U., LEHRACH, H., ADJAYE, J. und NIEMANN, H. (2008):
Genome-wide expression profiling reveals distinct clusters of transcriptional regulation during
137

Literaturverzeichnis
bovine preimplantation development in vivo.
Proceedings of the National Academy of Sciences, 105(50):19768–19773.
KUZMANY, A., HAVLICEK, V., WRENZYCKI, C., WILKENING, S., BREM, G. und BESEN-
FELDER, U. (2011):
Expression of mrna, before and after freezing, in bovine blastocysts cultured under different
conditions.
Theriogenology, 75(3):482 – 494.
LANSBERGEN, L. M. T. E., VAN WAGTENDONK-DE LEEUW, A. M., DEN DAAS, J. H. G.,
DE RUIGH, L., VAN DER STREEK, G., REINDERS, J. M. C., AARTS, M. und RODEWIJK, J.
(1995):
Factors affecting ovum pick up in cattle.
Theriogenology, 43(1):259–259.
LAZZARI, G., WRENZYCKI, C., HERRMANN, D., DUCHI, R., KRUIP, T., NIEMANN, H.
und GALLI, C. (2002):
Cellular and molecular deviations in bovine in vitro-produced embryos are related to the large
offspring syndrome.
Biol Reprod, 67(3):767–75.
LECHNIAK, D. (2002):
Quantitative aspect of gene expression analysis in mammalian oocytes and embryos.
Reprod Biol, 2(3):229–41.
LEE, C.N., COOK, D.L., PARFET, J.R., SMITH, C.A., YOUNGQUIST, R.S. und GARVER-
ICK, H.A. (1988):
Induction of persistent ovarian follicular structures following administration of progesterone
near the onset of estrus in dairy cattle.
Journal of Dairy Science, 71(12):3505 – 3508.
LEQUARRE, A. S., GRISART, B., MOREAU, B., SCHUURBIERS, N., MASSIP, A. und DES-
SY, F. (1997):
Glucose metabolism during bovine preimplantation development: Analysis of gene expression
in single oocytes and embryos.
Molecular Reproduction and Development, 48(2):216–226.
LEROY, J. L., VAN SOOM, A., OPSOMER, G., GOOVAERTS, I. G. und BOLS, P. E. (2008):
Reduced fertility in high-yielding dairy cows: are the oocyte and embryo in danger? part II.
mechanisms linking nutrition and reduced oocyte and embryo quality in high-yielding dairy
cows.
Reprod Domest Anim, 43(5):623–32.
LISZEWSKA, E., REKAWIECKI, R. und KOTWICA, J. (2005):
Effect of progesterone on the expression of bax and bcl-2 and on caspase activity in bovine
luteal cells.
Prostaglandins and Other Lipid Mediators, 78(1-4):67–81.
LONERGAN, P. (2011):
Influence of progesterone on oocyte quality and embryo development in cows.
138

Theriogenology, 76(9):1594 – 1601.
LONERGAN, P., CAROLAN, C. und MERMILLOD, P. (1994):
Development of bovine embryos in vitro following oocyte maturation under defined conditions.
Reprod Nutr Dev, 34(4):329–39.
LONERGAN, P., CAROLAN, C., VAN LANGENDONCKT, A., DONNAY, I., KHATIR, H. und
MERMILLOD, P. (1996):
Role of epidermal growth factor in bovine oocyte maturation and preimplantation embryo
development in vitro.
Biology of Reproduction, 54(6):1420–1429.
LONERGAN, P., RIZOS, D., GUTIERREZ-ADAN, A., FAIR, T. und BOLAND, M. P. (2003a):
Oocyte and embryo quality: effect of origin, culture conditions and gene expression patterns.
Reprod Domest Anim, 38(4):259–67.
LONERGAN, P., RIZOS, D., GUTIERREZ-ADAN, A., MOREIRA, P. M., PINTADO, B., DE LA
FUENTE, J. und BOLAND, M. P. (2003b):
Temporal divergence in the pattern of messenger RNA expression in bovine embryos cultured
from the zygote to blastocyst stage in vitro or in vivo.
Biology of Reproduction, 69(4):1424–1431.
LONERGAN, P., RIZOS, D., WARD, F. und BOLAND, M. P. (2001):
Factors influencing oocyte and embryo quality in cattle.
Reprod Nutr Dev, 41(5):427–37.
LOPES, A. S., MARTINUSSEN, T., GREVE, T. und CALLESEN, H. (2006):
Effect of days post-partum, breed and ovum pick-up scheme on bovine oocyte recovery and
embryo development.
Reprod Domest Anim, 41(3):196–203.
LOPES, A. S., WRENZYCKI, C., RAMSING, N. B., HERRMANN, D., NIEMANN, H.,
LOVENDAHL, P., GREVE, T. und CALLESEN, H. (2007):
Respiration rates correlate with mRNA expression of G6PD and GLUT1 genes in individual
bovine in vitro-produced blastocysts.
Theriogenology, 68(2):223–36.
LÖSEL, R., BREITER, S., SEYFERT, M., WEHLING, M. und FALKENSTEIN, E. (2005):
Classic and non-classic progesterone receptors are both expressed in human spermatozoa.
Horm Metab Res, 37(01):10,14.
LU, K.H., GORDON, I., GALLAGHER, M. und MCGOVERN, H. (1987):
Pregnancy established in cattle by transfer of embryos derived from in vitro fertilisation of
oocytes matured in vitro.
Veterinary Record, 121(11):259–260.
LUCIANO, A. M., LODDE, V., FRANCIOSI, F., CECILIANI, F. und PELUSO, J. J. (2010):
Progesterone receptor membrane component 1 expression and putative function in bovine oocyte
maturation, fertilization, and early embryonic development.
Reproduction, 140(5):663–72.
139

Literaturverzeichnis
LUCIANO, A. M. und PELUSO, J. J. (1995):
Effect of in vivo gonadotropin treatment on the ability of progesterone, estrogen, and cyclic
adenosine 5’-monophosphate to inhibit insulin-dependent granulosa cell mitosis in vitro.
Biology of Reproduction, 53(3):664–669.
LÜTTGENAU, J., ULBRICH, S.E., BEINDORFF, N., HONNENS, A., HERZOG, K. und BOLL-
WEIN, H. (2011):
Plasma progesterone concentrations in the mid-luteal phase are dependent on luteal size, but
independent of luteal blood flow and gene expression in lactating dairy cows.
Animal Reproduction Science, 125(1-4):20–29.
MACHATKOVA, M., KRAUSOVA, K., JOKESOVA, E. und TOMANEK, M. (2004):
Developmental competence of bovine oocytes: effects of follicle size and the phase of follicular
wave on in vitro embryo production.
Theriogenology, 61(2-3):329–335.
MADISON, V., AVERY, B. und GREVE, T. (1992):
Selection of immature bovine oocytes for developmental potential in vitro.
Animal Reproduction Science, 27(1):1–11.
MAILLARD, V., UZBEKOVA, S., GUIGNOT, F., PERREAU, C., RAME, C., COYRAL-
CASTEL, S. und DUPONT, J. (2010):
Effect of adiponectin on bovine granulosa cell steroidogenesis, oocyte maturation and embryo
development.
Reprod Biol Endocrinol, 8:23.
MALHI, P. S., ADAMS, G. P., MAPLETOFT, R. J. und SINGH, J. (2007):
Oocyte developmental competence in a bovine model of reproductive aging.
Reproduction, 134(2):233–239.
MAMO, S., CARTER, F., LONERGAN, P., LEAL, C., AL NAIB, A., MCGETTIGAN, P., MEH-
TA, J., EVANS, A. und FAIR, T. (2011):
Sequential analysis of global gene expression profiles in immature and in vitro matured bovine
oocytes: potential molecular markers of oocyte maturation.
BMC Genomics, 12(1):151.
MARQUANT-LE GUIENNE, B., GERARD, M., SOLARI, A. und THIBAULT, C. (1989):
In vitro culture of bovine egg fertilized either in vivo or in vitro.
Reprod Nutr Dev, 29(5):559–68.
MARTIN, T. L., FOGWELL, R. L. und IRELAND, J. J. (1991):
Concentrations of inhibins and steroids in follicular fluid during development of dominant
follicules in heifers.
Biol Reprod, 44(4):693–700.
MCEVOY, T. G., ALINK, F. M., MOREIRA, V. C., WATT, R. G. und POWELL, K. A. (2006):
Embryo technologies and animal health - consequences for the animal following ovum pickup,
in vitro embryo production and somatic cell nuclear transfer.
Theriogenology, 65(5):926–942.
MCEVOY, T. G., THOMPSON, H., DOLMAN, D. F., WATT, R. G., REIS, A. und STAINES,
140

M. E. (2002):
Effects of epidural injections and transvaginal aspiration of ovarian follicles in heifers used
repeatedly for ultrasound-guided retrieval of ova and embryo production.
Veterinary Record, 151(22):653–658.
MCNATTY, K. P., HEATH, D. A., HENDERSON, K. M., LUN, S., HURST, P. R., ELLIS,
L. M., MONTGOMERY, G. W., MORRISON, L. und THURLEY, D. C. (1984):
Some aspects of thecal and granulosa cell function during follicular development in the bovine
ovary.
J Reprod Fertil, 72(1):39–53.
MCPHERRON, A. C. und LEE, S. J. (1993):
GDF-3 and GDF-9: two new members of the transforming growth factor-beta superfamily
containing a novel pattern of cysteines.
J Biol Chem, 268(5):3444–9.
MEINTJES, M., BELLOW, M. S., BROUSSARD, J. R., PAUL, J. B. und GODKE, R. A.
(1993):
Transvaginal aspiration of bovine oocytes from hormone-treated pregnant beef cattle for IVF.
Theriogenology, 39(1):266–266.
MERLO, B., IACONO, E. und MARI, G. (2006):
Effect of progesterone and epidermal growth factor on in vitro-produced eight-cell bovine
embryos in a serum-free culture medium.
Reproduction, Fertility and Development, 19(1):211–211.
MERMILLOD, P., OUSSAID, B. und COGNIE, Y. (1999):
Aspects of follicular and oocyte maturation that affect the developmental potential of embryos.
J Reprod Fertil Suppl, 54:449–60.
MERTON, J. S., DE ROOS, A. P., MULLAART, E., DE RUIGH, L., KAAL, L., VOS, P. L. und
DIELEMAN, S. J. (2003):
Factors affecting oocyte quality and quantity in commercial application of embryo technologies
in the cattle breeding industry.
Theriogenology, 59(2):651–74.
MEYER, C., SCHMID, R., SCRIBA, P. C. und WEHLING, M. (1996):
Purification and partial sequencing of high-affinity progesterone-binding site(s) from porcine
liver membranes.
European Journal of Biochemistry, 239(3):726–731.
MILVAE, R.A., ALILA, H.W., BUSHMICH, S.L. und HANSEL, W. (1991):
Bovine corpus luteum function after removal of granulosa cells from the preovulatory follicle.
Domestic Animal Endocrinology, 8(3):439 – 443.
MINGOTI, G. Z., GARCIA, J. M. und ROSA-E SILVA, A. A. (2002):
Steroidogenesis in cumulus cells of bovine cumulus-oocyte-complexes matured in vitro with
BSA and different concentrations of steroids.
Anim Reprod Sci, 69(3-4):175–86.
MISIRLIOGLU, M., PAGE, G. P., SAGIRKAYA, H., KAYA, A., PARRISH, J. J., FIRST, N. L.
141

NIEMANN, H. und MEINECKE, B. (1993):
Embryotransfer und assoziierte Biotechniken bei landwirtschaftlichen Nutztieren.
Enke Verlag, Stuttgart.
NIEMANN, H. und WRENZYCKI, C. (2000):
Alterations of expression of developmentally important genes in preimplantation bovine embryos
by in vitro culture conditions: Implications for subsequent development.
Theriogenology, 53(1):21–34.
NIEMANN, H., WRENZYCKI, C., LUCAS-HAHN, A., BRAMBRINK, T., KUES, W. A. und
CARNWATH, J. W. (2002):
Gene expression patterns in bovine in vitro-produced and nuclear transfer-derived embryos
and their implications for early development.
Cloning Stem Cells, 4(1):29–38.
NILSSON, E. E. und SKINNER, M. K. (2009):
Progesterone regulation of primordial follicle assembly in bovine fetal ovaries.
Mol Cell Endocrinol, 313(1-2):9–16.
NISWENDER, G. D., JUENGEL, J. L., SILVA, P. J., ROLLYSON, M. K. und MCINTUSH,
E. W. (2000):
Mechanisms controlling the function and life span of the corpus luteum.
Physiological Reviews, 80(1):1–29.
NOLTE, I., JECKEL, D., WIELAND, F. T. und SOHN, K. (2000):
Localization and topology of ratp28, a member of a novel family of putative steroid-binding
proteins.
Biochim Biophys Acta, 1543(1):123–30.
NUTTINCK, F., MARQUANT-LE GUIENNE, B., CLEMENT, L., REINAUD, P., CHARPIGNY,
G. und GRIMARD, B. (2008):
Expression of genes involved in prostaglandin E2 and progesterone production in bovine
cumulus-oocyte complexes during in vitro maturation and fertilization.
Reproduction, 135(5):593–603.
NUTU, M., WEIJDEGARD, B., THOMAS, P., BERGH, C., THURIN-KJELLBERG, A., PANG,
Y., BILLIG, H. und LARSSON, D. G. J. (2007):
Membrane progesterone receptor gamma: Tissue distribution and expression in ciliated cells
in the fallopian tube.
Molecular Reproduction and Development, 74(7):843–850. 1098-2795.
OLSON, A. L. und PESSIN, J. E. (1996):
Structure, function, and regulation of the mammalian facilitative glucose transporter gene family.
Annu Rev Nutr, 16:235–56.
O’SHEA, L. C., MEHTA, J., LONERGAN, P., HENSEY, C. und FAIR, T. (2012):
Developmental competence in oocytes and cumulus cells: candidate genes and networks.
Systems Biology in Reproductive Medicine, 0(0):1–14.
OTOI, T., YAMAMOTO, K., KOYAMA, N., TACHIKAWA, S. und SUZUKI, T. (1997):
143

Literaturverzeichnis
Bovine oocyte diameter in relation to developmental competence.
Theriogenology, 48(5):769–774.
OUSSAID, B., LONERGAN, P., KHATIR, H., GULER, A., MONNIAUX, D., TOUZE, J.L.,
BECKERS, J.F., COGNIE, Y. und MERMILLOD, P. (2000):
Effect of GnRH antagonist-induced prolonged follicular phase on follicular atresia and oocyte
developmental competence in vitro in superovulated heifers.
Journal of Reproduction and Fertility, 118(1):137–144.
OYAMADA, T. und FUKUI, Y. (2004):
Oxygen tension and medium supplements for in vitro maturation of bovine oocytes cultured
individually in a chemically defined medium.
The Journal of Reproduction and Development, 50(1):107–117.
PALMA, G. A., CLEMENT-SENGEWALD, A. und KREFFT, H. (1993):
In vitro production of cattle embryos from calf oocytes.
Theriogenology, 39(1):278–278.
PARK, O.-K. und MAYO, K. E. (1991):
Transient expression of progesterone receptor messengerRNA in ovarian granuiosa cells after
the preovulatory luteinizing hormone surge.
Molecular Endocrinology, 5(7):967–978.
PARK, Y. S., KIM, S. S., KIM, J. M., PARK, H. D. und BYUN, M. D. (2005):
The effects of duration of in vitro maturation of bovine oocytes on subsequent development,
quality and transfer of embryos.
Theriogenology, 64(1):123–34.
PATE, J. L. (1988):
Regulation of prostaglandin synthesis by progesterone in the bovine corpus luteum.
Prostaglandins, 36(3):303 – 315.
PATE, J. L. (1996):
Intercellular communication in the bovine corpus luteum.
Theriogenology, 45(7):1381–1397.
PAULA-LOPES, F. F., BOELHAUVE, M., HABERMANN, F. A., SINOWATZ, F. und WOLF, E.
(2007):
Leptin promotes meiotic progression and developmental capacity of bovine oocytes via cumulus
cell-independent and -dependent mechanisms.
Biol Reprod, 76(3):532–41.
PAVLOK, A., LUCAS-HAHN, A. und NIEMANN, H. (1992):
Fertilization and developmental competence of bovine oocytes derived from different categories
of antral follicles.
Mol Reprod Dev, 31(1):63–7.
PELUSO, J. J., FERNANDEZ, G., PAPPALARDO, A. und WHITE, B. A. (2001):
Characterization of a putative membrane receptor for progesterone in rat granulosa cells.
Biology of Reproduction, 65(1):94–101.
144

PENNETIER, S., UZBEKOVA, S., PERREAU, C., PAPILLIER, P., MERMILLOD, P. und
DALBIS-TRAN, R. (2004):
Spatio-temporal expression of the germ cell marker genes MATER, ZAR1, GDF9, BMP15,and
VASA in adult bovine tissues, oocytes, and preimplantation embryos.
Biology of Reproduction, 71(4):1359–1366.
PERRY, G., SMITH, M., LUCY, M., GREEN, J., PARKS, T., MACNEIL, M., ROBERTS, A.
und GEARY, T. (2005):
Relationship between follicle size at insemination and pregnancy success.
Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 102(14):
5268–5273.
PETYIM, S., BAGE, R., FORSBERG, M., RODRIGUEZ-MARTINEZ, H. und LARSSON, B.
(2000):
The effect of repeated follicular puncture on ovarian function in dairy heifers.
J Vet Med A Physiol Pathol Clin Med, 47(10):627–40.
PETYIM, S., BAGE, R., FORSBERG, M., RODRIGUEZ-MARTINEZ, H. und LARSSON, B.
(2001):
Effects of repeated follicular punctures on ovarian morphology and endocrine parameters in
dairy heifers.
J Vet Med A Physiol Pathol Clin Med, 48(8):449–63.
PETYIM, S., BAGE, R., HALLAP, T., BERGQVIST, A. S., RODRIGUEZ-MARTINEZ, H. und
LARSSON, B. (2003):
Two different schemes of twice-weekly ovum pick-up in dairy heifers: effect on oocyte recovery
and ovarian function.
Theriogenology, 60(1):175–88.
PETYIM, S., BAGE, R., MADEJ, A. und LARSSON, B. (2007):
Ovum pick-up in dairy heifers: does it affect animal well-being?
Reprod Domest Anim, 42(6):623–32.
PIETERSE, M. C., KAPPEN, K. A., KRUIP, T. A. und TAVERNE, M. A. (1988):
Aspiration of bovine oocytes during transvaginal ultrasound scanning of the ovaries.
Theriogenology, 30(4):751–62.
PIETERSE, M. C., VOS, P. L., KRUIP, T. A., WILLEMSE, A. H. und TAVERNE, M. A.
(1991a):
Characteristics of bovine estrous cycles during repeated transvaginal, ultrasound-guided puncturing
of follicles for ovum pick-up.
Theriogenology, 35(2):401–13.
PIETERSE, M. C., VOS, P. L. A. M., KRUIP, TH A. M., WURTH, Y. A., VAN BENEDEN,
TH H., WILLEMSE, A. H. und TAVERNE, M. A. M. (1991b):
Transvaginal ultrasound guided follicular aspiration of bovine oocytes.
Theriogenology, 35(4):857–862.
PINYOPUMMINTR, T. und BAVISTER, B. D. (1995):
Optimum gas atmosphere for in vitro maturation and in vitro fertilization of bovine oocytes.
145

Literaturverzeichnis
Theriogenology, 44(4):471–477.
PLOURDE, D., VIGNEAULT, C., LEMAY, A., BRETON, L., GAGNE, D., LAFLAMME, I.,
BLONDIN, P. und ROBERT, C. (2012):
Contribution of oocyte source and culture conditions to phenotypic and transcriptomic variation
in commercially produced bovine blastocysts.
Theriogenology, 78(1):116 – 131.
PÖSCHKE, A. und KÖLLE, S. (2009):
Expression of progesterone receptor before and after in vitro maturation (IVM) and fertilization
(IVF) of bovine cumulus-oocyte-complexes (COCs).
Reproduction in Domestic Animals, 44, Suppl. 1:26–27.
PRICE, C. A., CARRIARE, P. D., BHATIA, B. und GROOME, N. P. (1995):
Comparison of hormonal and histological changes during follicular growth, as measured by
ultrasonography, in cattle.
Journal of Reproduction and Fertility, 103(1):63–68.
PURPERA, M. N., GIRALDO, A. M., BALLARD, C. B., HYLAN, D., GODKE, R. A. und
BONDIOLI, K. R. (2009):
Effects of culture medium and protein supplementation on mRNA expression of in vitro produced
bovine embryos.
Molecular Reproduction and Development, 76(8):783–793.
PURSLEY, J. R. und MARTINS, J. P. N. (2011):
Impact of circulating concentrations of progesterone and antral age of the ovulatory follicle on
fertility of high-producing lactating dairy cows.
Reproduction, Fertility and Development, 24:267–271.
QIU, H. B., LU, S. S., JI, K. L., SONG, X. M., LU, Y. Q., ZHANG, M. und LU, K. H.
(2008):
Membrane progestin receptor beta (mPR-beta): a protein related to cumulus expansion that is
involved in in vitro maturation of pig cumulus-oocyte complexes.
Steroids, 73(14):1416–23.
RAMBAGS, B. P. B., VAN ROSSEM, A. W., BLOK, E. E., DE GRAAF-ROELFSEMA, E.,
KINDAHL, H., VAN DER KOLK, J. H. und STOUT, T. A. E. (2008):
Effects of exogenous insulin on luteolysis and reproductive cyclicity in the mare.
Reproduction in Domestic Animals, 43(4):422–428.
RAMOS, A. F., RUMPF, R., CAMARA, J. U., MOLLO, M. R., PIVATO, I., MARQUES, JR.,
A. P. und SARTORI, R. (2010):
Effect of follicular wave synchronization on in vitro embryo production in heifers.
Anim Reprod Sci, 117(3-4):201–7.
REGGIO, B. C., LYNN, J. W. und GODKE, R. A. (1997):
The effect of progesterone on the development of IVF-derived bovine embryos cultured in a
semi-defined culture medium.
Theriogenology, 47(1):284.
REICHENBACH, H. D., WIEBKE, N. H., MODL, J., ZHU, J. und BREM, G. (1994):
146

Laparoscopy through the vaginal fornix of cows for the repeated aspiration of follicular oocytes.
Veterinary Record, 135(15):353–356.
RENARD, J.-P., CHASTANT, S., CHESNA, P., RICHARD, C., MARCHAL, J., CORDONNIER,
N., CHAVATTE, P. und VIGNON, X. (1999):
Lymphoid hypoplasia and somatic cloning.
The Lancet, 353(9163):1489–1491.
REVAH, I. und BUTLER, W. R. (1996):
Prolonged dominance of follicles and reduced viability of bovine oocytes.
Journal of Reproduction and Fertility, 106(1):39–47.
RHO, G. J., S, B., KIM, D. S., SON, W. J., CHO, S. R., KIM, J. G., B, M. K. und CHOE,
S. Y. (2007):
Influence of in vitro oxygen concentrations on preimplantation embryo development, gene
expression and production of hanwoo calves following embryo transfer.
Mol Reprod Dev, 74(4):486–96.
RIBADU, A.Y., WARD, W.R. und DOBSON, H. (1994):
Comparative evaluation of ovarian structures in cattle by palpation per rectum, ultrasonography
and plasma progesterone concentration.
Veterinary Record, 135(19):452–457.
RIEGER, D., LOSKUTOFF, N. M. und BETTERIDGE, K. J. (1992):
Developmentally related changes in the uptake and metabolism of glucose, glutamine and
pyruvate by cattle embryos produced in vitro.
Reprod Fertil Dev, 4(5):547–57.
RIEGER, D., ROBERGE, S., COY, D. H. und RAWLINGS, N. C. (1989):
Effects of an LHRH antagonist on gonadotrophin and oestradiol secretion, follicular development,
oestrus and ovulation in holstein heifers.
Journal of Reproduction and Fertility, 86(1):157–164.
RIVERA, F. A., MENDONIA, L. G. D., LOPES, G., SANTOS, J. E. P., PEREZ, R. V., AM-
STALDEN, M., CORREA-CALDERIAN, A. und CHEBEL, R. C. (2011):
Reduced progesterone concentration during growth of the first follicular wave affects embryo
quality but has no effect on embryo survival post transfer in lactating dairy cows.
Reproduction, 141(3):333–342.
RIZOS, D., BURKE, L., DUFFY, P., WADE, M., MEE, J. F., O’FARRELL, K. J., MACSIUR-
TAIN, M., BOLAND, M. P. und LONERGAN, P. (2005):
Comparisons between nulliparous heifers and cows as oocyte donors for embryo production
in vitro.
Theriogenology, 63(3):939–949.
RIZOS, D., GUTIERREZ-ADAN, A., PEREZ-GARNELO, S., DE LA FUENTE, J., BOLAND,
M. P. und LONERGAN, P. (2003):
Bovine embryo culture in the presence or absence of serum: implications for blastocyst development,
cryotolerance, and messengerRNA expression.
147

Literaturverzeichnis
Biol Reprod, 68(1):236–43.
RIZOS, D., SCULLY, S., KELLY, A. K., EALY, A. D., MOROS, R., DUFFY, P., AL NAIB,
A., FORDE, N. und LONERGAN, P. (2012):
Effects of human chorionic gonadotrophin administration on day 5 after oestrus on corpus
luteum characteristics, circulating progesterone and conceptus elongation in cattle.
Reproduction, Fertility and Development, 24(3):472–481.
RIZOS, D., WARD, F., DUFFY, P., BOLAND, M. P. und LONERGAN, P. (2002):
Consequences of bovine oocyte maturation, fertilization or early embryo development in vitro
versus in vivo: implications for blastocyst yield and blastocyst quality.
Mol Reprod Dev, 61(2):234–48.
ROBERSON, M. S., WOLFE, M. W., STUMPF, T. T., KITTOK, R. J. und KINDER, J. E.
(1989):
Luteinizing hormone secretion and corpus luteum function in cows receiving two levels of
progesterone.
Biology of Reproduction, 41:997–1003.
RORIE, R. W., XU, K. P. und BETTERIDGE, K. J. (1990):
Effects of culture on the post-thaw viability of cryopreserved, in vitro fertilized bovine embryos.
Theriogenology, 33(1):311–311.
ROTCHILD, I. (1981):
The regulation of the mammalian corpus luteum.
Recent Progress in Hormone Research, 37:183–298.
RUEDA, B. R., HENDRY, I. R., HENDRY, III WJ, STORMSHAK, F., SLAYDEN, O. D. und
DAVIS, J. S. (2000):
Decreased progesterone levels and progesterone receptor antagonists promote apoptotic cell
death in bovine luteal cells.
Biol Reprod, 62(2):269–76.
RÜSSE, I. und SINOWATZ, F. (1994):
Lehrbuch der Embryologie der Haustiere.
2. Aufl. Parey Verlag, Berlin, S.153-207.
RUSSELL, D. F., BAQIR, S., BORDIGNON, J. und BETTS, D. H. (2006):
The impact of oocyte maturation media on early bovine embryonic development.
Molecular Reproduction and Development, 73(10):1255–1270.
RYAN, D. P., BLAKEWOOD, E. G., SWANSON, W. F., RODRIGUES, H. und GODKE, R. A.
(1990):
The use of follicle stimulating hormone (FSH) to stimulate follicle development for in vitro
fertilization during the first trimester of pregnancy in cattle.
Theriogenology, 33(1):315–315.
RYAN, G. J., WADDINGTON, D. und CAMPBELL, K. H. S. (1999):
Addition of progesterone during bovine oocyte maturation in the presence of gonadotrophins
improves developmental competence.
148

Theriogenology, 51(1):392–392.
SAGIRKAYA, H., MISIRLIOGLU, M., KAYA, A., FIRST, N. L., PARRISH, J. J. und MEMILI,
E. (2006):
Developmental and molecular correlates of bovine preimplantation embryos.
Reproduction, 131(5):895–904.
SAGIRKAYA, H., MISIRLIOGLU, M., KAYA, A., FIRST, N. L., PARRISH, J. J. und MEMILI,
E. (2007):
Developmental potential of bovine oocytes cultured in different maturation and culture conditions.
Anim Reprod Sci, 101(3-4):225–40.
SALHAB, M., TOSCA, L., CABAU, C., PAPILLIER, P., PERREAU, C., DUPONT, J., MER-
MILLOD, P. und UZBEKOVA, S. (2011):
Kinetics of gene expression and signaling in bovine cumulus cells throughout ivm in different
mediums in relation to oocyte developmental competence, cumulus apoptosis and progesterone
secretion.
Theriogenology, 75(1):90–104.
SANGSRITAVONG, S., COMBS, D.K., SARTORI, R., ARMENTANO, L.E. und WILTBANK,
M.C. (2002):
High feed intake increases liver blood flow and metabolism of progesterone and estradiol-17β
in dairy cattle.
Journal of Dairy Science, 85(11):2831 – 2842.
SANTL, B., WENIGERKIND, H., SCHERNTHANER, W., MÖDL, J., STOJKOVIC, M., PREL-
LE, K., HOLTZ, W., BREM, G. und WOLF, E. (1998):
Comparison of ultrasound-guided vs laparoscopic transvaginal ovum pick-up (OPU) in simmental
heifers.
Theriogenology, 50(1):89–100.
SANTOS, P., CHAVEIRO, A., SIMONES, N. und MOREIRA DA SILVA, F. (2008):
Bovine oocyte quality in relation to ultrastructural characteristics of zona pellucida, polyspermic
penetration and developmental competence.
Reproduction in Domestic Animals, 43(6):685–689.
SASAMOTO, Y., SAKAGUCHI, M., KATAGIRI, S., YAMADA, Y. und TAKAHASHI, Y. (2003):
The effects of twisting and type of aspiration needle on the efficiency of transvaginal
ultrasound-guided ovum pick-up in cattle.
J Vet Med Sci, 65(10):1083–6.
SCARAMUZZI, R. J., TURNBULL, K. E. und NANCARROW, C. D. (1980):
Growth of Graafian follicles in cows following luteolysis induced by the prostaglandin F2
alpha analogue, cloprostenol.
Aust J Biol Sci, 33(1):63–9.
SCHAMS, D. und BERISHA, B. (2002):
Steroids as local regulators of ovarian activity in domestic animals.
Domest Anim Endocrinol, 23(1-2):53–65.
149

Literaturverzeichnis
SCHAMS, D., SCHALLENBERGER, E., HOFFMANN, B. und KARG, H. (1977):
The oestrous cycle of the cow: hormonal parameters and time relationships concerning oestrus,
ovulation, and electrical resistance of the vaginal mucus.
Acta Endocrinol (Copenh), 86(1):180–92.
SCHNORR, B. und KRESSIN, M. (2001):
Embryologie der Haustiere.
4. Aufl. Verlag Enke, Stuttgart, S. 255-266.
SCHOENFELDER, M., SCHAMS, D. und EINSPANIER, R. (2003):
Steroidogenesis during in vitro maturation of bovine cumulus oocyte complexes and possible
effects of tri-butyltin on granulosa cells.
J Steroid Biochem Mol Biol, 84(2-3):291–300.
SCHRICK, F.N., SPITZER, J.C., GIMENEZ, T., HENRICKS, D.M., JENKINS, T.C. und PLY-
LER, B.B. (1992):
Is nutritional anestrus precipitated by subfunctional corpora lutea in beef cows?
Domestic Animal Endocrinology, 9(3):187 – 197.
SELMIN, O., LUCIER, G. W., CLARK, G. C., TRITSCHER, A. M., VANDEN HEUVEL, J. P.,
GASTEL, J. A., WALKER, N. J., SUTTER, T. R. und BELL, D. A. (1996):
Isolation and characterization of a novel gene induced by 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin
in rat liver.
Carcinogenesis, 17(12):2609–15.
SEMENZA, G. L. (1998):
Hypoxia-inducible factor 1: master regulator of O2 homeostasis.
Curr Opin Genet Dev, 8(5):588–94.
SEMENZA, G. L. (2001):
HIF-1 and mechanisms of hypoxia sensing.
Curr Opin Cell Biol, 13(2):167–71.
SENDAG, S., CETIN, Y., ALAN, M., HADELER, K. G. und NIEMANN, H. (2008):
Effects of eCG and FSH on ovarian response, recovery rate and number and quality of oocytes
obtained by ovum pick-up in Holstein cows.
Anim Reprod Sci, 106(1-2):208–14.
SENDAI, Y., ITOH, T., YAMASHITA, S. und HOSHI, H. (2001):
Molecular cloning of a cDNA encoding a bovine growth differentiation factor-9 (GDF-9) and
expression of GDF-9 in bovine ovarian oocytes and in vitro-produced embryos.
Cloning, 3(1):3–10.
SHAHAM-ALBALANCY, A., FOLMAN, Y., KAIM, M., ROSENBERG, M. und WOLFENSON,
D. (2001):
Delayed effect of low progesterone concentrations on bovine uterine PGF(2α) secretion in the
subsequent oestrous cycle.
Reproduction, 122(4):643–648.
SHAO, R., MARKSTROM, E., FRIBERG, P. A., JOHANSSON, M. und BILLIG, H. (2003):
Expression of progesterone receptor (PR) A and B isoforms in mouse granulosa cells: Stage-
150

dependent PR-mediated regulation of apoptosis and cell proliferation.
Biology of Reproduction, 68(3):914–921.
SHAO, R., RUNG, E., WEIJDEGARD, B. und BILLIG, H. (2006):
Induction of apoptosis increases SUMO-1 protein expression and conjugation in mouse periovulatory
granulosa cells in vitro.
Molecular Reproduction and Development, 73(1):50–60.
SHIMADA, M. und TERADA, T. (2002):
FSH and LH induce progesterone production and progesterone receptor synthesis in cumulus
cells: a requirement for meiotic resumption in porcine oocytes.
Molecular Human Reproduction, 8(7):612–618.
SHIMADA, M., YAMASHITA, Y., ITO, J., OKAZAKI, T., KAWAHATA, K. und NISHIBORI,
M. (2004):
Expression of two progesterone receptor isoforms in cumulus cells and their roles during meiotic
resumption of porcine oocytes.
Journal of Molecular Endocrinology, 33(1):209–225.
SIANANGAMA, P. C. und RAJAMAHENDRAN, R. (1996):
Characteristics of corpus luteum formed from the first wave dominant follicle following hCG
in cattle.
Theriogenology, 45(5):977–990.
SILVA, C. C. und KNIGHT, P. G. (2000):
Effects of androgens, progesterone and their antagonists on the developmental competence of
in vitro matured bovine oocytes.
J Reprod Fertil, 119(2):261–9.
SINCLAIR, K. D., LUNN, L. A., KWONG, W. Y., WONNACOTT, K., LINFORTH, R. S. und
CRAIGON, J. (2008):
Amino acid and fatty acid composition of follicular fluid as predictors of in-vitro embryo
development.
Reprod Biomed Online, 16(6):859–68.
SINCLAIR, K. D., YOUNG, L. E., WILMUT, I. und MCEVOY, T. G. (2000):
In-utero overgrowth in ruminants following embryo culture: lessons from mice and a warning
to men.
Hum Reprod, 15 Suppl 5:68–86.
SINGH, R. und SINCLAIR, K. D. (2007):
Metabolomics: Approaches to assessing oocyte and embryo quality.
Theriogenology, 68(Supplement 1):S56–S62.
SIRARD, M. A. und COENEN, K. (2006):
In vitro maturation and embryo production in cattle.
Methods Mol Biol, 348:35–42.
SIRARD, M. A., RICHARD, F., BLONDIN, P. und ROBERT, C. (2006):
Contribution of the oocyte to embryo quality.
Theriogenology, 65(1):126–36.
151

Literaturverzeichnis
SIROIS, J. und FORTUNE, J. E. (1988):
Ovarian follicular dynamics during the estrous cycle in heifers monitored by real-time ultrasonography.
Biology of Reproduction, 39(2):308–317.
SIROIS, J. und FORTUNE, J. E. (1990):
Lengthening the bovine estrous cycle with low levels of exogenous progesterone: a model for
studying ovarian follicular dominance.
Endocrinology, 127:916–925.
SIROTKIN, A. V. (1992):
Involvement of steroid hormones in bovine oocytes maturation in vitro.
J Steroid Biochem Mol Biol, 41(3-8):855–8.
SKARZYNSKI, D. J. und OKUDA, K. (1999):
Sensitivity of bovine corpora lutea to prostaglandin F2α is dependent on progesterone, oxytocin,
and prostaglandins.
Biology of Reproduction, 60(6):1292–1298.
SKARZYNSKI, D. J., KOBAYASHI, S. und OKUDA, K. (2000):
Influence of nitric oxide and noradrenaline on prostaglandin F2α-induced oxytocin secretion
and intracellular calcium mobilization in cultured bovine luteal cells.
Biology of Reproduction, 63(4):1000–1005.
SMITH, D. M., TYLER, J. P. und ERICKSON, G. F. (1978):
Effects of medium composition and progesterone on maturation in vitro of rabbit oocytes from
Graafian follicles of different sizes.
J Reprod Fertil, 54(2):393–400.
SMITH, M. F., MCINTUSH, E. W. und SMITH, G. W. (1994):
Mechanisms associated with corpus luteum development.
Journal of Animal Science, 72(7):1857–72.
SOMFAI, T., IMAI, K., KANEDA, M., AKAGI, S., WATANABE, S., HARAGUCHI, S., MIZU-
TANI, E., DANG-NGUYEN, T. Q., INABA, Y., GESHI, M. und NAGAI, T. (2011):
The effect of ovary storage and in vitro maturation on mRNA levels in bovine oocytes; a possible
impact of maternal ATP1A1 on blastocyst development in slaughterhouse-derived oocytes.
J Reprod Dev.
SPICER, L. J., AAD, P. Y., ALLEN, D., MAZERBOURG, S. und HSUEH, A. J. (2006):
Growth differentiation factor-9 has divergent effects on proliferation and steroidogenesis of
bovine granulosa cells.
J Endocrinol, 189(2):329–39.
SRIKANDAKUMAR, A., INGRAHAM, R. H., ELLSWORTH, M., ARCHBALD, L. F., LIAO,
A. und GODKE, R. A. (1986):
Comparison of a solid-phase, no-extraction radioimmunoassay for progesterone with an extraction
assay for monitoring luteal function in the mare, bitch, and cow.
Theriogenology, 26(6):779–793.
STEEVES, T. E. und GARDNER, D. K. (1999):
152

Metabolism of glucose, pyruvate, and glutamine during the maturation of oocytes derived from
pre-pubertal and adult cows.
Molecular Reproduction and Development, 54(1):92–101.
STINSHOFF, H., KRIENKE, M., EKHLASI-HUNDRIESER, M., WILKENING, S., HANSTEDT,
A., FRESE, D., RATH, D., BOLLWEIN, H. und WRENZYCKI, C. (2012):
Seminal plasma and seminal plasma proteins added to bulk sorted sperm do not alter the mrna
expression of in vitro produced bovine embryos.
Theriogenology, 78(1):132 – 139.
STUBBINGS, R. B. und WALTON, J. S. (1995):
Effect of ultrasonically-guided follicle aspiration on estrous cycle and follicular dynamics in
Holstein cows.
Theriogenology, 43(4):705–712.
SU, L., YANG, S., HE, X., LI, X., MA, J., WANG, Y., PRESICCE, G. und JI, W. (2009):
Effect of donor age on the developmental competence of bovine oocytes retrieved by ovum
pick up.
Reprod Domest Anim.
SU, L., YANG, S., HE, X., LI, X., MA, J., WANG, Y., PRESICCE, G.A. und JI, W. (2012):
Effect of donor age on the developmental competence of bovine oocytes retrieved by ovum
pick up.
Reproduction in Domestic Animals, 47(2):184–189.
SUMNER, L. W., MENDES, P. und DIXON, R. A. (2003):
Plant metabolomics: large-scale phytochemistry in the functional genomics era.
Phytochemistry, 62(6):817–36.
TAKAGI, M., CHOI, Y. H., KAMISHITA, H., OHTANI, M., ACOSTA, T. J., WIJAYAGUNA-
WARDANE, M. P., MIYAMOTO, A., MIYAZAWA, K., SATO, K. und SATO, E. (1998):
Evaluation of fluids from cystic follicles for in vitro maturation and fertilization of bovine oocytes.
Theriogenology, 50(2):307–20.
TAKAGI, M., TSUKIHARA, T., NISHIKATA, Y. und SUZUKI, T. (1993):
Relationship between progesterone and estradiol contents of follicular fluid and the morphological
appearance of granulosa cells of follicles coexisting with corpora lutea in bovine ovaries.
Theriogenology, 40(1):135–47.
TAKUMA, T., OTSUBO, T., KUROKAWA, Y., ICHIMARU, H. und OTOI, T. (2008):
Effects of twice-weekly follicular punctures of ovaries with or without the corpus luteum on
follicular and luteal dynamics.
Reprod Domest Anim, 45(1):50–4.
TAKUMA, T., SAKAI, S., EZOE, D., ICHIMARU, H., JINNOUCHI, T., KAEDEI, Y., NAGAI,
T. und OTOI, T. (2010):
Effects of season and reproductive phase on the quality, quantity and developmental competence
of oocytes aspirated from Japanese black cows.
J Reprod Dev, 56(1):55–9.
153

Literaturverzeichnis
TAMASSIA, M., HEYMAN, Y., LAVERGNE, Y., RICHARD, C., GELIN, V., RENARD, J. P.
und CHASTANT-MAILLARD, S. (2003):
Evidence of oocyte donor cow effect over oocyte production and embryo development in vitro.
Reproduction, 126(5):629–637.
TAN, S. J. und LU, K. H. (1990):
Effects of different oestrous stages of ovaries and sizes of follicles on generation of bovine
embryos in vitro.
Theriogenology, 33(1):335–335.
TANG, Y., HU, T., ARTERBURN, M., BOYLE, B., BRIGHT, J., EMTAGE, P. und FUNK, W.
(2005):
PAQR proteins: A novel membrane receptor family defined by an ancient 7-transmembrane
pass motif.
Journal of Molecular Evolution, 61(3):372–380.
TANGHE, S., VAN SOOM, A., MEHRZAD, J., MAES, D., DUCHATEAU, L. und DE KRUIF,
A. (2003):
Cumulus contributions during bovine fertilization in vitro.
Theriogenology, 60(1):135–49.
TEMELES, G. L., RAM, P. T., ROTHSTEIN, J. L. und SCHULTZ, R. M. (1994):
Expression patterns of novel genes during mouse preimplantation embryogenesis.
Molecular Reproduction and Development, 37(2):121–129.
TERVIT, H. R., WHITTINGHAM, D. G. und ROWSON, L. E. A. (1972):
Successful culture in vitro of sheep and cattle ova.
Journal of Reproduction and Fertility, 30(3):493–497.
THOMAS, P., ZHU, Y. und PACE, M. (2002):
Progestin membrane receptors involved in the meiotic maturation of teleost oocytes: a review
with some new findings.
Steroids, 67(6):511–7.
TIAN, H., MCKNIGHT, S. L. und RUSSELL, D. W. (1997):
Endothelial PAS domain protein 1 (EPAS1), a transcription factor selectively expressed in
endothelial cells.
Genes Dev, 11(1):72–82.
TOM, J.W., PIERSON, R.A. und ADAMS, G.P. (1998):
Quantitative echotexture analysis of bovine corpora lutea.
Theriogenology, 49(7):1345 – 1352.
VAN DER SCHANS, A., VAN DER WESTERLAKEN, L. A. J., DE WIT, A. A. C., EYESTONE,
W. H. und DE BOER, H. A. (1991):
Ultrasound-guided transvaginal collection of oocytes in the cow.
Theriogenology, 35(1):288–288.
VAN HOECK, V., STURMEY, R. G., BERMEJO-ALVAREZ, P., RIZOS, D., GUTIERREZ-
ADAN, A., LEESE, H. J., BOLS, P. E. und LEROY, J. L. (2011):
Elevated non-esterified fatty acid concentrations during bovine oocyte maturation compromise
154

early embryo physiology.
PLoS One, 6(8):e23183.
VAN WAGTENDONK-DE LEEUW, A. M. (2006):
Ovum pick up and in vitro production in the bovine after use in several generations: a 2005
status.
Theriogenology, 65(5):914–25.
VASCONCELOS, J. L. M., SARTORI, R., OLIVEIRA, H. N., GUENTHER, J. G. und WILT-
BANK, M. C. (2001):
Reduction in size of the ovulatory follicle reduces subsequent luteal size and pregnancy rate.
Theriogenology, 56:307–314.
VASSENA, R., MAPLETOFT, R. J., ALLODI, S., SINGH, J. und ADAMS, G. P. (2003):
Morphology and developmental competence of bovine oocytes relative to follicular status.
Theriogenology, 60(5):923–932.
VOELKEL, S. A., HU, Y. X., MOORE, K. und BONDIOLI, K. R. (1992):
Freeze survival of bovine embryos produced by maturation, fertilization and culture of oocytes.
Theriogenology, 37(1):317–317.
WALKER, S. K., HARTWICH, K. M. und SEAMARK, R. F. (1996):
The production of unusually large offspring following embryo manipulation: Concepts and
challenges.
Theriogenology, 45(1):111–120.
WANG, G. L., JIANG, B. H., RUE, E. A. und SEMENZA, G. L. (1995):
Hypoxia-inducible factor 1 is a basic-helix-loop-helix-PAS heterodimer regulated by cellular
O2 tension.
Proc Natl Acad Sci U S A, 92(12):5510–4.
WANG, H., WU, M., PATT, D., MURPHY, B. D. und MAPLETOFT, R. J. (1988):
Superovulation in beef heifers with PMSG: Effect of dose and monoclonal antibodies to
PMSG.
Theriogenology, 29(1):323–323.
WANG, H. F., ISOBE, N., KUMAMOTO, K., YAMASHIRO, H., YAMASHITA, Y. und TERA-
DA, T. (2006):
Studies of the role of steroid hormone in the regulation of oocyte maturation in cattle.
Reprod Biol Endocrinol, 4:4.
WARD, F., ENRIGHT, B., RIZOS, D., BOLAND, M. und LONERGAN, P. (2002):
Optimization of in vitro bovine embryo production: effect of duration of maturation, length of
gamete co-incubation, sperm concentration and sire.
Theriogenology, 57(8):2105–17.
WARD, F. A., LONERGAN, P., ENRIGHT, B. P. und BOLAND, M. P. (2000):
Factors affecting recovery and quality of oocytes for bovine embryo production in vitro using
ovum pick-up technology.
Theriogenology, 54(3):433–446.
155

Literaturverzeichnis
WARD, F., RIZOS, D., CORRIDAN, K., D.AND QUINN, BOLAND, M. und LONERGAN, P.
(2001):
Paternal influence on the time of first embryonic cleavage post insemination and the implications
for subsequent bovine embryo development in vitro and fertility in vivo.
Molecular Reproduction and Development, 60(1):47–55.
WARE, C. B., BARNES, F. L., MAIKI-LAURILA, M. und FIRST, N. L. (1989):
Age dependence of bovine oocyte activation.
Gamete Research, 22(3):265–275.
WARZYCH, E., WRENZYCKI, C., PEIPPO, J. und LECHNIAK, D. (2007):
Maturation medium supplements affect transcript level of apoptosis and cell survival related
genes in bovine blastocysts produced in vitro.
Mol Reprod Dev, 74(3):280–9.
WATSON, A. J., DE SOUSA, P., CAVENEY, A., BARCROFT, L. C., NATALE, D., UR-
QUHART, J. und WESTHUSIN, M. E. (2000):
Impact of bovine oocyte maturation media on oocyte transcript levels, blastocyst development,
cell number, and apoptosis.
Biology of Reproduction, 62(2):355–364.
WILTBANK, M., LOPEZ, H., SARTORI, R., SANGSRITAVONG, S. und GÜMEN, A. (2006):
Changes in reproductive physiology of lactating dairy cows due to elevated steroid metabolism.
Theriogenology, 65(1):17 – 29.
WILTBANK, M. C., SOUZA, A. H., CARVALHO, P. D., BENDER, R. W. und NASCIMENTO,
A.L B. (2011):
Improving fertility to timed artificial insemination by manipulation of circulating progesterone
concentrations in lactating dairy cattle.
Reproduction, Fertility and Development, 24(1):238–243.
WISE, T. (1987):
Biochemical analysis of bovine follicular fluid: albumin, total protein, lysosomal enzymes,
ions, steroids and ascorbic acid content in relation to follicular size, rank, atresia classification
and day of estrous cycle.
J Anim Sci, 64(4):1153–69.
WISE, T., SUSS, U., STRANZINGER, G., WUTHRICH, K. und MAURER, R. R. (1994):
Cumulus and oocyte maturation and in vitro and in vivo fertilization of oocytes in relation to
follicular steroids, prolactin, and glycosaminoglycans throughout the estrous period in superovulated
heifers with a normal LH surge, no detectable LH surge, and progestin inhibition of
LH surge.
Domest Anim Endocrinol, 11(1):59–86.
WRENZYCKI, C. (2007):
Analyse der Genexpressionsmuster zur Beurteilung der Embryonenqualität.
Journal für Reproduktionsmedizin und Endokrinologie, 5(4):234–239.
WRENZYCKI, C., HERRMANN, D., CARNWATH, J. W. und NIEMANN, H. (1998):
156

Expression of RNA from developmentally important genes in preimplantation bovine embryos
produced in TCM supplemented with BSA.
J Reprod Fertil, 112(2):387–98.
WRENZYCKI, C., HERRMANN, D., CARNWATH, J. W. und NIEMANN, H. (1999):
Alterations in the relative abundance of gene transcripts in preimplantation bovine embryos
cultured in medium supplemented with either serum or PVA.
Mol Reprod Dev, 53(1):8–18.
WRENZYCKI, C., HERRMANN, D., KESKINTEPE, L., MARTINS, JR., A., SIRISATHIEN, S.,
BRACKETT, B. und NIEMANN, H. (2001):
Effects of culture system and protein supplementation on mrna expression in pre-implantation
bovine embryos.
Hum Reprod, 16(5):893–901.
WRENZYCKI, C., HERRMANN, D., LUCAS-HAHN, A., GEBERT, C., KORSAWE, K., LEM-
ME, E., CARNWATH, J. W. und NIEMANN, H. (2005a):
Epigenetic reprogramming throughout preimplantation development and consequences for assisted
reproductive technologies.
Birth Defects Res C Embryo Today, 75(1):1–9.
WRENZYCKI, C., HERRMANN, D., LUCAS-HAHN, A., KORSAWE, K., LEMME, E. und
NIEMANN, H. (2005b):
Messenger RNA expression patterns in bovine embryos derived from in vitro procedures and
their implications for development.
Reprod Fertil Dev, 17(1-2):23–35.
WRENZYCKI, C., HERRMANN, D., LUCAS-HAHN, A., LEMME, E., KORSAWE, K. und
NIEMANN, H. (2004):
Gene expression patterns in in vitro-produced and somatic nuclear transfer-derived preimplantation
bovine embryos: relationship to the large offspring syndrome?
Anim Reprod Sci, 82-83:593–603.
WRENZYCKI, C., HERRMANN, D. und NIEMANN, H. (2007):
Messenger RNA in oocytes and embryos in relation to embryo viability.
Theriogenology, 68 Suppl 1:S77–83.
WRIGHT, JR., R. W. und BONDIOLI, K. R. (1981):
Aspects of in vitro fertilization and embryo culture in domestic animals.
J Anim Sci, 53(3):702–29.
XU, K. P., HILL, B. und BETTERIDGE, K. J. (1992):
Application of in vitro fertilisation techniques to obtain calves from valuable cows after
slaughter.
Veterinary Record, 130(10):204–206.
XU, K. P., HOIER, R. und GREVE, T. (1988):
Dynamic changes of estradiol and progesterone concentrations during in vitro oocyte maturation
in cattle.
Theriogenology, 30(2):245–55.
157

Literaturverzeichnis
YAN, C., WANG, P., DEMAYO, J., DEMAYO, F. J., ELVIN, J. A., CARINO, C., PRASAD,
S. V., SKINNER, S. S., DUNBAR, B. S., DUBE, J. L., CELESTE, A. J. und MATZUK, M. M.
(2001):
Synergistic roles of bone morphogenetic protein 15 and growth differentiation factor 9 in ovarian
function.
Mol Endocrinol, 15(6):854–66.
YING, C., YANG, Y. C., HONG, W. F., CHENG, W. T. und HSU, W. L. (2000):
Progesterone receptor gene expression in preimplantation pig embryos.
European Journal of Endocrinology, 143(5):697–703.
YOUNG, L. E., SINCLAIR, K.D. und WILMUT, I. (1998):
Large offspring syndrome in cattle and sheep.
Reviews of Reproduction, 3(3):155–63.
ZHU, X. L., SEXTON, P. S. und CENEDELLA, R. J. (2001):
Characterization of membrane steroid binding protein mRNA and protein in lens epithelial
cells.
Exp Eye Res, 73(2):213–9.
ZHU, Y., BOND, J. und THOMAS, P. (2003a):
Identification, classification, and partial characterization of genes in humans and other vertebrates
homologous to a fish membrane progestin receptor.
Proceedings of the National Academy of Sciences, 100(5):2237–2242.
ZHU, Y., RICE, C. D., PANG, Y., PACE, M. und THOMAS, P. (2003b):
Cloning, expression, and characterization of a membrane progestin receptor and evidence it is
an intermediary in meiotic maturation of fish oocytes.
Proceedings of the National Academy of Sciences, 100(5):2231–2236.
158

Abkürzungsverzeichnis
α . . . . . . . . . . . . . .
¯n . . . . . . . . . . . . . . .
β . . . . . . . . . . . . . . .
Alpha
Mittelwert, arithmetisches Mittel
Beta
µl . . . . . . . . . . . . . . Mikroliter
µM . . . . . . . . . . . . . Mikromolar
µmol . . . . . . . . . . .
ANOVA . . . . . . . .
BDNF . . . . . . . . . .
Mikromol
Analysis of Variance, Varianzanalyse
Brain Derived Neurotrophic Factor
BMP15 . . . . . . . . . Bone Morphogenetic Protein 15
BSA . . . . . . . . . . .
bzw. . . . . . . . . . . . .
C.l. . . . . . . . . . . . . .
ca. . . . . . . . . . . . . .
CO 2 . . . . . . . . . . . .
cpm . . . . . . . . . . . .
DF . . . . . . . . . . . . .
DNA . . . . . . . . . . .
DTT . . . . . . . . . . .
E 2 . . . . . . . . . . . . . .
eCG . . . . . . . . . . . .
ECS . . . . . . . . . . . .
EDTA . . . . . . . . . .
EGF . . . . . . . . . . . .
ER . . . . . . . . . . . . .
et al. . . . . . . . . . . .
Bovines serum Albumin
beziehungsweise
Corpus luteum
circa
Kohlenstoffdioxid
Counts pro Minute
Dominanter Follikel
Desoxyribonukleinsäure
Dithiothreitol
17-β-Estradiol
Equines Choriogonadotropin
Estrus Cow Serum
Ethylendiamintetraessigsäure
Epidermal Growth Factor
Entwicklungsrate
et alii, und andere
159

Abkürzungsverzeichnis
EtOH . . . . . . . . . . .
EÄ . . . . . . . . . . . . .
Fa. . . . . . . . . . . . . .
FAF . . . . . . . . . . . .
FCS . . . . . . . . . . . .
FF . . . . . . . . . . . . .
FS . . . . . . . . . . . . .
FSH . . . . . . . . . . . .
G . . . . . . . . . . . . . .
g . . . . . . . . . . . . . . .
Ethanol
Embryonenäquivalent
Firma
Fatty Acid Free, Fettsäurefrei
Fetal Calf Serum, fetales Kälberserum
Follikelflüssigkeit
Fettsäuren
Follikel stimulierendes Hormon
Gauge
Erdschwerebeschleunigung
GDF9 . . . . . . . . . . Growth and Differentiation factor 9
GnRH . . . . . . . . . .
h . . . . . . . . . . . . . . .
H 2 O . . . . . . . . . . . .
HCl . . . . . . . . . . . .
HECM . . . . . . . . .
HHE . . . . . . . . . . .
HIF2α . . . . . . . . . .
ICM . . . . . . . . . . . .
IE . . . . . . . . . . . . . .
IVC . . . . . . . . . . . .
IVF . . . . . . . . . . . .
IVM . . . . . . . . . . .
IVP . . . . . . . . . . . .
KOK . . . . . . . . . . .
l . . . . . . . . . . . . . . .
Gonadotropin-Releasing-Hormon
Stunde
Wasser
Salzsäure
Hamster Embryo Culture Medium
Heparin-Hypotaurin-Epinephrin
Hypoxia Inducible Factor 2α
Inner Cell Mass, innere Zellmasse
Internationale Einheiten
In-vitro-Kultur
In-vitro-Fertilisation
In-vitro-Maturation
In-vitro-Produktion
Kumulus-Oozyten-Komplex
Liter
160

LH . . . . . . . . . . . . .
LOS . . . . . . . . . . . .
LSF . . . . . . . . . . . .
Max . . . . . . . . . . . .
MgCl 2 . . . . . . . . . .
MI . . . . . . . . . . . . .
MII . . . . . . . . . . . .
Min . . . . . . . . . . . .
ml . . . . . . . . . . . . . .
MM . . . . . . . . . . . .
mm . . . . . . . . . . . .
mmHG . . . . . . . . .
MOET . . . . . . . . .
MPC . . . . . . . . . . .
mPGR . . . . . . . . . .
mRNA . . . . . . . . .
Luteinisierendes Hormon
Large Offspring Syndrome
Least Sqaure Fit
Maximum
Magnesiumchlorid
Meiosestadium I
Meiosestadium II
Minimum
Milliliter
Master Mix
Millimeter
Millimeter Quecksilber, Druckeinheit
Multiple Ovulation and Embryo Transfer
Magnetic Particle Concentrator
membranständiger Progesteronrezeptor
Messenger Ribonukleinsäure
N 2 . . . . . . . . . . . . . Stickstoff
Na . . . . . . . . . . . . .
NaCl . . . . . . . . . . .
ng . . . . . . . . . . . . . .
nPGR . . . . . . . . . .
Natrium
Natriumchlorid
Nanogramm
nuklearer Progesteronrezeptor
O 2 . . . . . . . . . . . . . Sauerstoff
OPU . . . . . . . . . . .
PAQR . . . . . . . . . .
PBS . . . . . . . . . . . .
PCR . . . . . . . . . . . .
Ovum-Pick-Up
Progestin und AdipoQ Rezeptor
Phosphate Buffered Saline, Phosohat-gepufferte Salzlösung
Polymerase Chain Reaction, Polymerase-Kettenreaktion
161

Abkürzungsverzeichnis
pg . . . . . . . . . . . . . .
PGR . . . . . . . . . . .
Pikogramm
Progesteronrezeptor
PGRMC1 . . . . . . . membranständiger Progesteronrezeptor 1
PGRMC2 . . . . . . . membranständiger Progesteronrezeptor 2
PVA . . . . . . . . . . . .
PVC . . . . . . . . . . .
PVP . . . . . . . . . . . .
qPCR . . . . . . . . . .
RIA . . . . . . . . . . . .
RNA . . . . . . . . . . .
SD . . . . . . . . . . . . .
SEM . . . . . . . . . . .
Polyvinylalkohol
Polyvinylchlorid
Polyvinylpyrrolidon
quantitative Polymerase-Kettenreaktion
Radioimmunoassay
Ribonukleinsäure
Standardabweichung
Standardfehler
SLC2A1 . . . . . . . . Glukose Transporter 1
SOF . . . . . . . . . . . .
SSS . . . . . . . . . . . .
T . . . . . . . . . . . . . . .
TALP . . . . . . . . . .
Synthetic Oviduct Fluid
Synthetic Serum Substitute, synthetischer Serumersatz
Testosteron
Tyrode´s Albumin Laktat Pyrovat
TCM199 . . . . . . . . Tissue Culture Medium 199
TE . . . . . . . . . . . . .
TGF . . . . . . . . . . . .
TR . . . . . . . . . . . . .
vs. . . . . . . . . . . . . .
◦ C . . . . . . . . . . . . .
Trophektoderm
Transforming Growth Factor
Teilungsrate
versus, gegenüber
Grad Celsius
162

Veröffentlichungen
Auszüge dieser Arbeit wurden bereits veröffentlicht:
N. Schlüter, A. Hanstedt, C. Wrenzycki: „Einfluss der Progesteronkonzentration während
wiederholter OPU-Sitzungen auf die Eizellqualität“ (Vortrag, 38. Jahrestagung der AET-d 2011)
N. Schlüter, A. Hanstedt, K. Knauer, H. Stinshoff, C. Wrenzycki: „Influence of peripheral
progesterone concentration on oocyte quality in repeated OPU sessions“ (Poster, 37th Annual
Conference of the IETS 2012)
N. Schlüter, A. Hanstedt, K. Knauer, H. Stinshoff, C. Wrenzycki: „Influence of peripheral
progesterone concentration on morphological oocyte quality in repeated OPU sessions“ (Poster,
45. Jahrestagung Physiologie und Pathologie der Fortpflanzung 2012)
163

164

Danksagung
Bei einem Projekt wie diesem gibt es immer eine Reihe von Personen und Einrichtungen, ohne
die die Durchführung nicht möglich gewesen wäre. An dieser Stelle sei all jenen ein herzlicher
Dank ausgesprochen.
Erwähnen möchte ich hier besonders
• Prof. Dr. Christine Wrenzycki, die dieses Projekt ins Leben gerufen und in seiner Gesamtheit
geleitet und begleitet hat
• die AG Biotechnologie der Klinik für Rinder Hannover
• die Firma Masterrind, die die Versuchstiere zur Verfügung gestellt hat
• Vion Bad Bramstedt, aus deren Schlachthof die Ovarien für die IVP stammten
• den Förderverein Biotechnologie Forschung e.V. für die finanzielle Unterstützung
• Sandra Wilkening für die PCR
• Dr. Marion Piechotta und ihrem Team für die Hilfe bei den P4-Analysen
• die Tierpfleger der Rinderklinik
• Doris für die Medien und die Unterstützung im IVF-Labor
• meine Kollegen aus der Tierarztpraxis Schomacker, die für meine Dissertation den einen
und anderen Dienst für mich übernommen haben
• Alexander Meyer für die Auswertungen mittels Gnuplot
• Björn Guth für die Berechnungen aus den P4-Kurven
• Dr. Ana Hanstedt für Korrekturen, produktive Diskussionen, unendliche Geduld bei den
Reifungskontrollen und ihr offenes Ohr
• Katharina Knauer, zweite Hälfte des Chaos-Kommandos, für die tatkräftige Unterstützung
beim OPU und unvergessliche Tage in OPU-Stall und Labor
• Johanna Bennemann, Leidensgenossin, für gemeinsames Jammern und Dampf ablassen,
gegenseitiges Mut machen und Daumen drücken... und für´s Durchhalten -wir haben´s
geschafft!
• Philipp Gringel für die Hilfe bei L A TEX und 4 Jahre langes Mitzittern, Freuen, Trösten,
Motivieren und für seine Ruhe bis zum Schluss!
• meine Eltern, ohne deren finanzielle und mentale Unterstützung diese Doktorarbeit nicht
realisierbar gewesen wäre
Danke!
165