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Material und Methoden
Probe wurde die Zentrifugation wie im ersten Schritt wiederholt. Ebenso bei der
nachfolgenden Zugabe von 350µl RWI-Puffers*.
Schließlich wurden 80 µl DNase I* auf die RNeasy-
Säule hinzugefügt und bei Raumtemperatur in
Abhängigkeit von der Zellzahl für 20-30 Minuten
inkubiert. Im Anschluss erfolgte die Zugabe von
weiteren 350 µl RWI-Puffers und eine Anzentrifugation
bei 10.000 Umdrehungen für ebenfalls 20
Sekunden.
Nun wurden 500 µl an RPE-Puffer* hinzugegeben,
bei Raumtemperatur für 5 Minuten inkubiert und
schließlich die gesamte Probe bei 10.000
Umdrehungen für 2 Minuten zentrifugiert. Die
Zugabe von 500 µl RPE-Puffer und die
nachfolgenden Schritte wurden wiederholt.
Zusätzlich wurde die Probe nun „trocken“
zentrifugiert bei maximaler Drehzahl für 3 Minuten.
Nach Zugabe von 25 µl RNAse-freiem Wasser
wurde die Säule erneut mit oben genannten
Einstellungen zentrifugiert und anschließend die
Probe aus der Säule in ein neues Sammelröhrchen
entlassen.
Der Transfer der frisch isolierten RNA-Probe
Abb. 3 zeigt die RNA-Isolierung
nach dem Eppendorf Phase Lock
Gel®-Verfahren [6].
erfolgte in ein DNA LoBind Röhrchen von Eppendorf. Zur Quantifizierung des
gewonnenen Materials wurde die spektroskopische Nanodrop®-Methode benutzt.
Abschließend konnten die RNA-Proben bis zur weiteren Bearbeitung bei -80°C
tiefgefroren werden.
4. Microarray-Analyse der Monozyten-RNA-Profile
4.1 Ort der Microarray-Experimente
Die Durchführung der Microarray-Experimente erfolgte in Zusammenarbeit mit der
Forschungsgruppe von Prof. Cambien am INSERM UMR U525/936 der Faculté de
Médecine Pierre et Marie Curie an der Université Paris. Die Proben wurden am
dortigen Institut analysiert und statistisch ausgewertet.
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