Gelelektrophorese - TCI @ Uni-Hannover.de
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Instrumentelle Metho<strong>de</strong>n<br />
Teil I: <strong>Gelelektrophorese</strong><br />
PD Dr. Cornelia Kasper<br />
<strong>TCI</strong><br />
Institut für<br />
Technische Chemie
Glie<strong>de</strong>rung<br />
Theoretische Grundlagen<br />
Gelmedien<br />
Nachweis/Färbemetho<strong>de</strong>n<br />
Instrumentierung<br />
Elektrophoretische Grundlagen und Durchführung<br />
Präparative Metho<strong>de</strong>n<br />
Hochauflösen<strong>de</strong> zweidimensionale Elektrophorese<br />
PD Dr. Cornelia Kasper<br />
<strong>TCI</strong><br />
Institut für<br />
Technische Chemie
Definition<br />
Unter Elektrophorese versteht man die Wan<strong>de</strong>rung von<br />
Teilchen im elektrischen Feld.<br />
Eigenschaften <strong>de</strong>r Teilchen (Ladung, Größe) bewirken<br />
eine unterschiedliche elektrophoretische Beweglichkeit.<br />
Die verschie<strong>de</strong>nen Teilchen wer<strong>de</strong>n getrennt und<br />
sammeln sich dabei in einzelnen Zonen.<br />
PD Dr. Cornelia Kasper<br />
<strong>TCI</strong><br />
Institut für<br />
Technische Chemie
Theoretische Grundlagen<br />
In einem elektrischen Feld wirken unterschiedliche Kräfte auf ein<br />
gela<strong>de</strong>nes Teilchen:<br />
Beschleunigen<strong>de</strong> Kraft:<br />
Fe<br />
= q ⋅ E mit q = z ⋅ e<br />
Reibungskraft:<br />
F<br />
tr<br />
=<br />
f<br />
c<br />
⋅v<br />
q: Ladung E: elektrische Feldstärke<br />
fc: Reibungskoeffizient<br />
v: Wan<strong>de</strong>rungsgeschwindigkeit<br />
Stehen die Kräfte im Gleichgewicht, bewegen sich Teilchen mit<br />
einer konstanten Geschwindigkeit im elektrischen Feld.<br />
PD Dr. Cornelia Kasper<br />
<strong>TCI</strong><br />
Institut für<br />
Technische Chemie
Theoretische Grundlagen<br />
F<br />
e<br />
=<br />
F<br />
fr<br />
→<br />
q<br />
⋅<br />
E<br />
=<br />
f<br />
c<br />
⋅<br />
v<br />
q<br />
⋅<br />
E<br />
v<br />
=<br />
=<br />
u<br />
⋅<br />
E<br />
f<br />
c<br />
Der Faktor u ist ein Proportionalitätsfaktor zwischen<br />
Wan<strong>de</strong>rungsgeschwindigkeit und Feldstärke.<br />
Er wird als Mobilität bezeichnet und ist<br />
substanzspezifisch.<br />
PD Dr. Cornelia Kasper<br />
<strong>TCI</strong><br />
Institut für<br />
Technische Chemie
Theoretische Grundlagen<br />
Effekte auf das Teilchen im elektrischen Feld<br />
F e : Beschleunigungskraft<br />
F RET : Retardationskraft<br />
F REL : Relaxationskraft<br />
F r : Reibungskraft<br />
Auf Grund bei<strong>de</strong>r Effekte nimmt die Mobilität bei zunehmen<strong>de</strong>r<br />
Ionenstärke ab.<br />
PD Dr. Cornelia Kasper<br />
<strong>TCI</strong><br />
Institut für<br />
Technische Chemie
Theoretische Grundlagen<br />
Retardationseffekt<br />
Nach <strong>de</strong>r Debye-Hückel Theorie ist um das Zentralion<br />
eine Ionenatmosphäre entgegengesetzter Ladung<br />
aufgebaut. Sie bewirkt, das das Teilchen durch eine<br />
Lösung wan<strong>de</strong>rt, die entgegengesetzt fließt. →<br />
Retardationseffekt<br />
Relaxationseffekt<br />
Durch Anlegen eines elektrischen Fel<strong>de</strong>s wird die<br />
Ionenwolke hinter <strong>de</strong>m Zentralion her gezogen, das Ion<br />
wird abgebremst. → Relaxation<br />
PD Dr. Cornelia Kasper<br />
<strong>TCI</strong><br />
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Technische Chemie
Theoretische Grundlagen<br />
Bei schwachen Basen und Säuren ist nicht die<br />
Mobilität <strong>de</strong>s vollständig dissozierten Teilchens wichtig,<br />
son<strong>de</strong>rn die effektive Mobilität ueff.<br />
Sie wird über <strong>de</strong>n Dissoziationsgrad α mit <strong>de</strong>r<br />
Ionenmobilität verknüpft:<br />
α: Dissoziationsgrad<br />
ueff<br />
= ∑ α ⋅<br />
Die Wan<strong>de</strong>rungsgeschwindigkeit kann bei schwachen<br />
Säuren und Basen über pH-Werteinstellungen<br />
optimiert wer<strong>de</strong>n.<br />
ui<br />
PD Dr. Cornelia Kasper<br />
<strong>TCI</strong><br />
Institut für<br />
Technische Chemie
Theoretische Grundlagen<br />
Puffersysteme<br />
Bei Durchführung einer Elektrophorese wan<strong>de</strong>rn nicht<br />
nur die Probenionen, son<strong>de</strong>rn auch die dissozierten<br />
Pufferionen.<br />
An bei<strong>de</strong>n Elektro<strong>de</strong>n müssen daher Pufferreservoirs mit<br />
ausreichend Puffer vorhan<strong>de</strong>n sein.<br />
Verwen<strong>de</strong>t wer<strong>de</strong>n Säure/ Base- Systeme (z.B. Tris-<br />
Chlorid, Tris-Borid)<br />
PD Dr. Cornelia Kasper<br />
<strong>TCI</strong><br />
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Technische Chemie
Theoretische Grundlagen<br />
Wärmeabfuhr<br />
Durch <strong>de</strong>n Einsatz von Strom wird bei<br />
einer Elektrophorese Joul´sche<br />
Wärme entwickelt. Pro Volumeneinheit<br />
entwickelte Wärme W gilt:<br />
W<br />
= E²<br />
⋅λ<br />
⋅<br />
c<br />
c = molare Konzentration <strong>de</strong>s Elektrolyten<br />
λ = Äquivalenzleitfähigkeit<br />
F = Faraday- Konstante<br />
E = elektrische Feldstärke<br />
ui = Mobilität<br />
zi = Anzahl<br />
Für λ gilt:<br />
λ =<br />
u<br />
i<br />
⋅<br />
z<br />
i<br />
⋅<br />
F<br />
PD Dr. Cornelia Kasper<br />
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Technische Chemie
Theoretische Grundlagen<br />
Die Wärmeabfuhr erfolgt über die Wän<strong>de</strong> o<strong>de</strong>r eine Seite<br />
<strong>de</strong>s Systems<br />
Ein Temperaturgradient entsteht<br />
Bei trägerfreier Elektrophorese kommt es zur<br />
Durchmischung<br />
Bei einer Kapillar- o<strong>de</strong>r <strong>Gelelektrophorese</strong> sollten<br />
geringe Innendurchmesser bzw. dünne Schichten<br />
verwen<strong>de</strong>t wer<strong>de</strong>n, damit die Temperaturdifferenz gering<br />
gehalten wer<strong>de</strong>n kann.<br />
Die Materialien sollten eine gute Wärmeleitfähigkeit<br />
haben.<br />
PD Dr. Cornelia Kasper<br />
<strong>TCI</strong><br />
Institut für<br />
Technische Chemie
Elektrochemische Doppelschicht<br />
Auf <strong>de</strong>r Oberfläche vieler Materialien ( Glas, Teflon,<br />
Papier, Agarose) bil<strong>de</strong>t sich bei Kontakt mit<br />
Elektrolytlösungen eine elektrochemische Doppelschicht.<br />
Grund : Oberflächenladungen<br />
Erläuterungen am Beispiel einer fused Silica–Kapillare<br />
PD Dr. Cornelia Kasper<br />
<strong>TCI</strong><br />
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Technische Chemie
Theoretische Grundlagen<br />
Aufbau und Potentialverlauf <strong>de</strong>r<br />
elektrochemischen Doppelschicht<br />
•Bei <strong>de</strong>r Dissoziation von<br />
Silanolgruppen wer<strong>de</strong>n negative<br />
Ladungen an <strong>de</strong>r Wand ausgebil<strong>de</strong>t.<br />
• Diese wer<strong>de</strong>n durch positive<br />
Gegenladungen aus <strong>de</strong>r Lösung<br />
kompensiert.<br />
•Die Abbildung zeigt einen<br />
Potentialabfall.<br />
•In <strong>de</strong>r starren Schicht an <strong>de</strong>r<br />
Wandung ist <strong>de</strong>r Abfall linear.<br />
X=Abstand von <strong>de</strong>r Kapillarwand<br />
PD Dr. Cornelia Kasper<br />
•In diffusen Schicht in <strong>de</strong>r Lösung liegt<br />
ein exponentieller Abfall vor<br />
<strong>TCI</strong><br />
Institut für<br />
Technische Chemie
Elektroosmotischer Fluß (EOF)<br />
Durch die Doppelschicht bedingt wird bei Anlegen einer<br />
elektrischen Spannung das Lösungsmittel in einen Fluß (EOF) in<br />
Richtung <strong>de</strong>r Katho<strong>de</strong> gebracht. Eine Strömung in <strong>de</strong>r flüssigen<br />
Phase tritt auf.<br />
Grund: positive Gegenladungen <strong>de</strong>r Doppelschicht.<br />
Geschwindigkeit <strong>de</strong>s EOF: abhängig vom ζ-Potential<br />
vEOF<br />
Theoretische Grundlagen<br />
ε ⋅ζ<br />
⋅ E<br />
= 4 ⋅∏⋅η<br />
ε: Dielektrizitätskonstante<br />
ζ: Zeta-Potential<br />
E: elektrische Feldstärke<br />
η: Viskosität<br />
In <strong>de</strong>r <strong>Gelelektrophorese</strong> tritt die Elektroendosmose auf.<br />
Folgen: da <strong>de</strong>r EOF <strong>de</strong>r Richtung <strong>de</strong>r Probenionen<br />
entgegengesetzt ist, sind Verzerrungen und Verdünnungen <strong>de</strong>r<br />
Zonen die Folge.<br />
PD Dr. Cornelia Kasper<br />
<strong>TCI</strong><br />
Institut für<br />
Technische Chemie
Theoretische Grundlagen<br />
Elektroendosmose: Aufgrund fixierter Ladungen an <strong>de</strong>r Matrixoberfläche<br />
entsteht im elektrischen Feld ein <strong>de</strong>r Elektrophoreserichtung entgegengesetzter<br />
osmotischer Fluß.<br />
PD Dr. Cornelia Kasper<br />
<strong>TCI</strong><br />
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Technische Chemie
Gelmedien<br />
Agarose<br />
•Einfache Handhabung<br />
•Ungiftig<br />
•Wer<strong>de</strong>n eingesetzt zur<br />
Trennung hochmolekularer<br />
Proteine über 500 kDa<br />
•Niedrige Siebwirkung für<br />
kleine Proteine<br />
•Gele sind nicht klar<br />
•Sind nicht Elektroendosmose<br />
frei<br />
PD Dr. Cornelia Kasper<br />
<strong>TCI</strong><br />
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Technische Chemie
Gelmedien<br />
Polyacrylamid<br />
Vernetzungsmuster <strong>de</strong>s Polyacrylamids (PA)<br />
PD Dr. Cornelia Kasper<br />
<strong>TCI</strong><br />
Institut für<br />
Technische Chemie
Gelmedien<br />
PA ist chemisch inert und stabil (Gele reißen nicht so leicht)<br />
Geringe Elektroendosmose<br />
Klare Gele auf Grund Vernetzer N,N´-Methylenbisacrylamid<br />
Porengröße <strong>de</strong>r Gele ist von <strong>de</strong>r Konzentration und <strong>de</strong>m<br />
Vernetzungsgrad abhängig<br />
Eignen sich für viele Färbemetho<strong>de</strong>n<br />
PD Dr. Cornelia Kasper<br />
<strong>TCI</strong><br />
Institut für<br />
Technische Chemie
Gelmedien<br />
Nachteile:<br />
Monomer ist toxisch<br />
Proteine über 800 kDa können nicht<br />
getrennt wer<strong>de</strong>n<br />
PD Dr. Cornelia Kasper<br />
<strong>TCI</strong><br />
Institut für<br />
Technische Chemie
Nachweis/Färbemetho<strong>de</strong>n<br />
Qualitativer Nachweis: Färbung o<strong>de</strong>r radioaktive<br />
Markierung<br />
Quantitativer Nachweis: Densitometrie (Lichtabsorption)<br />
PD Dr. Cornelia Kasper<br />
<strong>TCI</strong><br />
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Technische Chemie
Nachweis/Färbemetho<strong>de</strong>n<br />
Coomassie-Brilliant Blue<br />
Einfachste Metho<strong>de</strong>, kurze Färbemetho<strong>de</strong><br />
Proteine wer<strong>de</strong>n blau angefärbt<br />
Empfindlichkeit: 100 ng – 1 µg pro Ban<strong>de</strong><br />
Silberfärbung<br />
Silberionen wer<strong>de</strong>n von Proteinen gebun<strong>de</strong>n und durch<br />
Reduktion in Silber umgewan<strong>de</strong>lt. Mechanismus ähnlich<br />
<strong>de</strong>m <strong>de</strong>r Fotografie<br />
Empfindliche Metho<strong>de</strong>, längere Färbezeiten<br />
Empfindlichkeit: ng-Bereich pro Ban<strong>de</strong><br />
PD Dr. Cornelia Kasper<br />
<strong>TCI</strong><br />
Institut für<br />
Technische Chemie
Nachweis/Färbemetho<strong>de</strong>n<br />
Coomassie<br />
1 2 3<br />
Die Ban<strong>de</strong>n in <strong>de</strong>n Taschen/Spuren 1-3 sind<br />
Markerproteine.<br />
PD Dr. Cornelia Kasper<br />
<strong>TCI</strong><br />
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Technische Chemie
Nachweis/Färbemetho<strong>de</strong>n<br />
Agarosegel<br />
Dargestellt sind PCR-Produkte. Links befin<strong>de</strong>t sich ein<br />
Standard.<br />
Die Färbung erfolgte mit Ethidiumbromid und wird unter<br />
UV-Licht (254 nm) fotographiert.<br />
PD Dr. Cornelia Kasper<br />
<strong>TCI</strong><br />
Institut für<br />
Technische Chemie
Instrumentierung<br />
Grundsätzlich fin<strong>de</strong>n horizontale und vertikale Systeme<br />
Verwendung.<br />
Vertikale Systeme: Die Gele sind in Kassetten o<strong>de</strong>r auf<br />
Trägermaterial (Glasplatten, Polycarbonatplatten)<br />
befestigt und von flüssigem Puffer umgeben. Die Proben<br />
wer<strong>de</strong>n in Taschen am oberen En<strong>de</strong> <strong>de</strong>r Gele<br />
aufgegeben. Die Proben laufen von oben nach unten.<br />
Die schweren und großen Proteine befin<strong>de</strong>n sich im<br />
oberen Teil <strong>de</strong>s Gels.<br />
Die Wärmeabfuhr wird durch Kühlung mittels <strong>de</strong>r Puffer<br />
geregelt.<br />
PD Dr. Cornelia Kasper<br />
<strong>TCI</strong><br />
Institut für<br />
Technische Chemie
Instrumentierung<br />
Vertikale Elektrophoreseapparatur<br />
PD Dr. Cornelia Kasper<br />
<strong>TCI</strong><br />
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Technische Chemie
Instrumentierung<br />
Horizontale Systeme: Die Gele können auf einem Trägermaterial<br />
aufgetragen sein. Die Versorgung mit Pufferionen erfolgt entwe<strong>de</strong>r<br />
durch Filterpapierstreifen, die in Flüssigpuffertanks hängen o<strong>de</strong>r<br />
durch getränkte Filterpapierstreifen.<br />
Mo<strong>de</strong>rne Systeme verwen<strong>de</strong>n Gelstreifen die mit <strong>de</strong>n Pufferionen<br />
versetzt sind. Das Verfahren ist als semidry anzusehen.<br />
Die Probe kann über einen aufliegen<strong>de</strong>n Filterstreifen aufgebracht<br />
wer<strong>de</strong>n o<strong>de</strong>r sie wer<strong>de</strong>n in eingegossene Taschen pipettiert.<br />
Die entstehen<strong>de</strong> Wärme muss abgeführt wer<strong>de</strong>n, daher haben<br />
solche Systeme eine Wasserkühlung.<br />
Die Elektrophorese wird mit Spannungen von 200V durchgeführt<br />
wer<strong>de</strong>n.<br />
PD Dr. Cornelia Kasper<br />
<strong>TCI</strong><br />
Institut für<br />
Technische Chemie
Instrumentierung<br />
Horizontales Elektrophorese Systeme<br />
B: statt Filterpapierstreifen wer<strong>de</strong>n<br />
auch Gelstreifen mit Puffer verwen<strong>de</strong>t<br />
PD Dr. Cornelia Kasper<br />
<strong>TCI</strong><br />
Institut für<br />
Technische Chemie
Grundprinzipien und Durchführung<br />
Zonenelektrophorese: Trennprinzip beruht auf<br />
unterschiedlichen Wan<strong>de</strong>rungsgeschwindigkeiten <strong>de</strong>r<br />
gela<strong>de</strong>nen Teilchen im Feld. Grundlage je<strong>de</strong>r<br />
Elektrophorese<br />
Isotachophorese: Die gela<strong>de</strong>nen Teilchen wan<strong>de</strong>rn alle<br />
mit <strong>de</strong>r gleichen Geschwindigkeit im diskontinuierlichen<br />
System.<br />
Isoelektrische Focussierung: Trennung <strong>de</strong>r Teilchen<br />
nach <strong>de</strong>m isoelektrischen Punkt innerhalb eines pH-<br />
Gradienten<br />
PD Dr. Cornelia Kasper<br />
<strong>TCI</strong><br />
Institut für<br />
Technische Chemie
Grundprinzipien und Durchführung<br />
PD Dr. Cornelia Kasper<br />
<strong>TCI</strong><br />
Institut für<br />
Technische Chemie
Grundprinzipien und Durchführung<br />
Zonenelektrophorese<br />
Grundprinzip <strong>de</strong>r Elektrophorese<br />
Trennung eines Proteingemisches in Zonen<br />
Das Trennprinzip beruht auf <strong>de</strong>n unterschiedlichen<br />
Wan<strong>de</strong>rungsgeschwindigkeiten (→Mobilität)<br />
Beeinflussung <strong>de</strong>r Ladung durch Temperatur und pH-<br />
Wert <strong>de</strong>s Puffers<br />
Unverän<strong>de</strong>rlicher pH-Wert <strong>de</strong>s Gels<br />
Bestimmung nach Molekulargewicht, Molekülgröße o<strong>de</strong>r<br />
isoelektrischer Punkt<br />
PD Dr. Cornelia Kasper<br />
<strong>TCI</strong><br />
Institut für<br />
Technische Chemie
Grundprinzipien und Durchführung<br />
• Probenauftrag <strong>de</strong>r gemischten<br />
Proteine<br />
•Auftrennung in Zonen<br />
PD Dr. Cornelia Kasper<br />
<strong>TCI</strong><br />
Institut für<br />
Technische Chemie
Grundprinzipien und Durchführung<br />
Porengradientengele<br />
Dienen zur Ermittlung von Molekülgrößen eines Proteins.<br />
Durch eine kontinuierliche Verän<strong>de</strong>rung <strong>de</strong>r Vernetzung<br />
eines Gels erhält man einen Gradienten.<br />
Die Proteine bleiben in <strong>de</strong>r enger wer<strong>de</strong>n<strong>de</strong>n Poren <strong>de</strong>s<br />
Gels je nach Größe stecken.<br />
PD Dr. Cornelia Kasper<br />
<strong>TCI</strong><br />
Institut für<br />
Technische Chemie
Grundprinzipien und Durchführung<br />
Herstellung eines linearen<br />
Porengradientengels<br />
Zwei Polymerisationslösungen mit<br />
unterschiedlicher<br />
Monomerkonzentration wer<strong>de</strong>n mit<br />
Hilfe eines Gradientenmischers<br />
vermischt. Dabei wird <strong>de</strong>r<br />
höherkonzentrierten Lösung die<br />
nie<strong>de</strong>rkonzentrierte Lösung<br />
zugemischt.<br />
Um ein Vermischen in <strong>de</strong>r<br />
Gelkassette zu verhin<strong>de</strong>rn wird die<br />
konzentrierte Lösung Glycerin<br />
überschichtet.<br />
PD Dr. Cornelia Kasper<br />
<strong>TCI</strong><br />
Institut für<br />
Technische Chemie
Grundprinzipien und Durchführung<br />
Disk-Elektrophorese<br />
Disk steht für diskontinuierlich<br />
Gelmatrix ist in zwei Bereiche geteilt:<br />
weitporiges Sammelgel und engporiges<br />
Trenngel<br />
Vorteil : die Aggregation <strong>de</strong>r Proteine wird<br />
verhin<strong>de</strong>rt, man erhält schärfere Ban<strong>de</strong>n<br />
Kombination zweier Puffersysteme: Tris-Chlorid/<br />
Tris-Glycin-System<br />
PD Dr. Cornelia Kasper<br />
<strong>TCI</strong><br />
Institut für<br />
Technische Chemie
Grundprinzipien und Durchführung<br />
Sammelgel pH 6,8 und Trenngel pH 8,8<br />
Glycin hat auf Grund <strong>de</strong>s pH-Wertes eine<br />
niedrige elektrophoretische Mobilität und fungiert<br />
als Folge-Ion, Chlorid hat eine hohe Mobilität<br />
und dient als Leit-Ion.<br />
Die Mobilitäten <strong>de</strong>r aufzutrennen<strong>de</strong>n Proteine<br />
liegen zwischen <strong>de</strong>nen <strong>de</strong>r Leit- und Folge-<br />
Ionen.<br />
PD Dr. Cornelia Kasper<br />
<strong>TCI</strong><br />
Institut für<br />
Technische Chemie
Grundprinzipien und Durchführung<br />
Prinzip <strong>de</strong>r diskontinuierlichen Elektrophorese<br />
Nach Anlegen <strong>de</strong>s elektrischen Fel<strong>de</strong>s setzt die Isotachophorese ein: alle Ionen<br />
wan<strong>de</strong>rn mit <strong>de</strong>r gleichen Geschwindigkeit und bil<strong>de</strong>n einen Proteinstapel in<br />
Reihenfolge ihrer Mobilitäten.<br />
PD Dr. Cornelia Kasper<br />
<strong>TCI</strong><br />
Institut für<br />
Technische Chemie
Grundprinzipien und Durchführung<br />
Proteinstapel wan<strong>de</strong>rt langsam in Richtung<br />
Ano<strong>de</strong>.<br />
Bei <strong>de</strong>m Übergang in das engporige Trenngel<br />
bil<strong>de</strong>t sich eine Art „Stau“.<br />
Proteine erfahren einen Reibungswi<strong>de</strong>rstand.<br />
Der Stapel löst sich im homogenen Puffer auf.<br />
Die einzelnen Komponenten trennen sich nun<br />
nach <strong>de</strong>m Zonenprinzip auf.<br />
Die Proteinenfolge än<strong>de</strong>rt sich, da im Trenngel<br />
die Molekülgröße einen großen Einfluß auf die<br />
Mobilität hat.<br />
PD Dr. Cornelia Kasper<br />
<strong>TCI</strong><br />
Institut für<br />
Technische Chemie
Grundprinzipien und Durchführung<br />
Saure Nativelektrophorese<br />
Metho<strong>de</strong> zur Trennung von basischen Proteinen<br />
(z.B. Getrei<strong>de</strong>proteine)<br />
Saures Puffersystem (z.B. HEPES –Puffer pH 5,5)<br />
Proteine sind positiv gela<strong>de</strong>n und wan<strong>de</strong>rn zur<br />
Katho<strong>de</strong><br />
PD Dr. Cornelia Kasper<br />
<strong>TCI</strong><br />
Institut für<br />
Technische Chemie
Grundprinzipien und Durchführung<br />
SDS-PAGE<br />
SDS steht für Sodium do<strong>de</strong>cyl sulfate<br />
Anionisches Detergenz<br />
Über<strong>de</strong>ckt die Eigenladungen <strong>de</strong>r Proteine →<br />
Entstehung von Micellen mit konstanter negativer<br />
Ladung pro Masseneinheit<br />
1,4 g SDS pro g Aminosäure<br />
PAGE steht für Polyacrylamidgel-Elektrophorese<br />
Standardmäßig wird eine diskontnuierliche<br />
Elektrophorese mit SDS-haltigen Tris-HCL/ Tris-Glycin<br />
Puffern nach Laemmli durchgeführt.<br />
PD Dr. Cornelia Kasper<br />
<strong>TCI</strong><br />
Institut für<br />
Technische Chemie
Grundprinzipien und Durchführung<br />
Probenvorbereitung<br />
Proben wer<strong>de</strong>n mit einem Puffer versetzt, <strong>de</strong>r die nötige<br />
Menge SDS im Überschuß enthält<br />
Zusätzlich wird Mercaptoethanol frisch dazu gegeben<br />
→ Aufspaltung von Schwefelbrücken zwischen Cysteinen<br />
Die Proben wer<strong>de</strong>n für 5 min auf 95 C erhitzt<br />
→ es erfolgt eine Streckung <strong>de</strong>s Moleküls, Sekundär- und<br />
Tertiärstrukturen wer<strong>de</strong>n aufgebrochen<br />
Proben wer<strong>de</strong>n nach Erhitzen abzentrifugiert und<br />
können auf das Gel pipettiert wer<strong>de</strong>n.<br />
PD Dr. Cornelia Kasper<br />
<strong>TCI</strong><br />
Institut für<br />
Technische Chemie
Grundprinzipien und Durchführung<br />
Vorteile <strong>de</strong>r SDS-PAGE<br />
Proteinaggregation wird verhin<strong>de</strong>rt<br />
Schnelle Trennungen, da die Micellen hohe Ladungen<br />
tragen<br />
Trennung erfolgt nur nach einem Parameter<br />
(Molekulargewicht)<br />
Es gehen auch sehr hydrophobe und <strong>de</strong>naturierte Proteine<br />
in Lösung<br />
Nachteile <strong>de</strong>r SDS-PAGE<br />
Denaturierung ist irreversibel<br />
SDS ist nicht kompatibel mit nicht-ionischen Detergenzien<br />
PD Dr. Cornelia Kasper<br />
<strong>TCI</strong><br />
Institut für<br />
Technische Chemie
Grundprinzipien und Durchführung<br />
SDS-PAGE<br />
Spur 3 enthält ein<br />
Markergemisch<br />
Rechts Angabe <strong>de</strong>r<br />
Molmassen <strong>de</strong>r<br />
Markerproteine in kDa<br />
PD Dr. Cornelia Kasper<br />
<strong>TCI</strong><br />
Institut für<br />
Technische Chemie
Grundprinzipien und Durchführung<br />
silbergefärbtes SDS-Gel<br />
1 2<br />
In <strong>de</strong>n Spuren 1 und 2 sind Markerproteine<br />
PD Dr. Cornelia Kasper<br />
<strong>TCI</strong><br />
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Technische Chemie
Grundprinzipien und Durchführung<br />
Isoelektrische Fokussierung (IEF)<br />
Protein wan<strong>de</strong>rt im elektrischen Feld durch einen pH-<br />
Gradienten<br />
An <strong>de</strong>m Punkt, an <strong>de</strong>m die Nettoladung gleich Null ist<br />
befin<strong>de</strong>t sich sein isoelektrischer Punkt<br />
Nettoladung eines Protein = Summe aller negativen und<br />
positiven Ladungen an <strong>de</strong>n Aminosäuregruppen<br />
IEF ist im Gegensatz zu <strong>de</strong>n an<strong>de</strong>ren<br />
elektrophoretischen Metho<strong>de</strong>n eine Endpunktmetho<strong>de</strong><br />
→ die Proteine können nicht mehr weiter wan<strong>de</strong>rn<br />
PD Dr. Cornelia Kasper<br />
<strong>TCI</strong><br />
Institut für<br />
Technische Chemie
Grundprinzipien und Durchführung<br />
A: Nettoladungskurven zweier Proteine A und B<br />
B: Fokussierung <strong>de</strong>r Probenproteine A und B im Feld<br />
PD Dr. Cornelia Kasper<br />
<strong>TCI</strong><br />
Institut für<br />
Technische Chemie
Grundprinzipien und Durchführung<br />
Bestimmt man die Nettoladungen <strong>de</strong>r Proteine bei<br />
unterschiedlichen pH-Werten erhält man eine<br />
charakteristische Kurve.<br />
Der Schnittpunkt <strong>de</strong>r Kurve mit <strong>de</strong>r x-Achse gibt <strong>de</strong>n<br />
isoelektrischen Punkt <strong>de</strong>s Proteins an.<br />
Als Trennmedien dienen auch hier Agarosegele und PA-<br />
Gele.<br />
In <strong>de</strong>n Gelen muß <strong>de</strong>r Gradient stabil sein und eine<br />
gleichmäßige Leitfähigkeit vorweisen<br />
Zwei Konzepte fin<strong>de</strong>n Verwendung:<br />
pH-Gradienten aus freien Trägerampholyten und<br />
immobilisierte pH-Gradienten<br />
PD Dr. Cornelia Kasper<br />
<strong>TCI</strong><br />
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Technische Chemie
Grundprinzipien und Durchführung<br />
Trägerampholyte<br />
I<strong>de</strong>ale Trägerampholyte weisen folgen<strong>de</strong> Eigenschaften<br />
aus:<br />
Hohe Pufferkapazität und Löslichkeit am pI<br />
Gleichmäßige Leitfähigkeit<br />
Frei von biologischen Effekten<br />
Niedriges Molekulargewicht<br />
Trägerampholyte bestehen aus mehreren hun<strong>de</strong>rt<br />
unterschiedlichen aliphatischen Oligoamino-<br />
Oligocarbonsäuren mit unterschiedlichen pI-Werten.<br />
PD Dr. Cornelia Kasper<br />
<strong>TCI</strong><br />
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Technische Chemie
Grundprinzipien und Durchführung<br />
Konzentrationen <strong>de</strong>r Ampholyte muß gleich im Gel sein,<br />
sonst treten Lücken im pH Spektrum auf.<br />
2% Ampholyte im Gel<br />
Nach anlegen <strong>de</strong>s elektrischen Fel<strong>de</strong>s richten sich die<br />
gela<strong>de</strong>nen Teilchen aus und bil<strong>de</strong>n <strong>de</strong>n Gradienten<br />
Die Trägerampholyte mit <strong>de</strong>m niedrigsten pI wan<strong>de</strong>rn bis<br />
an das anodische En<strong>de</strong> <strong>de</strong>s Gels, die Ampholyte mit<br />
<strong>de</strong>m höchsten pI wan<strong>de</strong>rn an das kathodische En<strong>de</strong>.<br />
Der Gradient kann nach langer Focussionszeit anfangen<br />
zu driften (Katho<strong>de</strong>ndrift). Ban<strong>de</strong>n wer<strong>de</strong>n unscharf,<br />
basische Proteine gehen verloren.<br />
Vorteil: Trägerampholyte wirken als Zwitterionen und<br />
halten Proteine in Lösung<br />
PD Dr. Cornelia Kasper<br />
<strong>TCI</strong><br />
Institut für<br />
Technische Chemie
Grundprinzipien und Durchführung<br />
Immobilisierte pH-Gradienten (IPG)<br />
IPG sind in die Gelmatrix einpolymerisiert<br />
Eingesetzt wer<strong>de</strong>n dazu bifunktionelle Immobiline<br />
H2C=CH-C=O (–NHR)<br />
Immobiline sind Acrylamid<strong>de</strong>rivate und somit schwache<br />
Säuren o<strong>de</strong>r schwache Basen.<br />
Definition <strong>de</strong>r Immobiline erfolgt über ihre pK-Werte<br />
Man benötigt zwei unterschiedliche Immobiline.<br />
Der zu puffern<strong>de</strong> pH-Wert ergibt sich aus <strong>de</strong>m<br />
Mischungsverhältnis.<br />
PD Dr. Cornelia Kasper<br />
<strong>TCI</strong><br />
Institut für<br />
Technische Chemie
Grundprinzipien und Durchführung<br />
Immobilisierte puffern<strong>de</strong> Gruppen in<br />
einem Polyacrylamidnetzwerk.<br />
PD Dr. Cornelia Kasper<br />
<strong>TCI</strong><br />
Institut für<br />
Technische Chemie
Grundprinzipien und Durchführung<br />
Herstellung immobilisierter pH-Gradienten<br />
Mischen von unterschiedlichen Polymerisationslösungen<br />
mit Gradientenmischer<br />
Lösungen enthalten Acrylamidmonomere zur<br />
Polymerisation einer Matrix auf einer Trägerfolie.<br />
Die Immobiline wer<strong>de</strong>n kovalent an das<br />
Polyacrylnetzwerk gebun<strong>de</strong>n.<br />
Nach <strong>de</strong>r Polymerisation müssen die Katalysatoren mit<br />
Wasser aus <strong>de</strong>r Matrix entfernt wer<strong>de</strong>n.<br />
Gel wird getrocknet und kann bei -20 o C gelagert wer<strong>de</strong>n.<br />
Vor Gebrauch wird das Gel in Additiva (Harnstoff,<br />
Dithiothreitol, Detergenzien) wie<strong>de</strong>r gequollen.<br />
PD Dr. Cornelia Kasper<br />
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Grundprinzipien und Durchführung<br />
Vorteile:<br />
Endpunktmetho<strong>de</strong> mit hoher Auflösung<br />
IP läßt sich dirket ablesen<br />
Kombination mit SDS-Elektrophorese→ 2D-Elektrophorese<br />
Nachteile:<br />
Aufwendigere Färbtechniken als bei <strong>de</strong>r<br />
Zonenelektrophorese<br />
Aufwendiges Herstellungsverfahren<br />
Aggregieren<strong>de</strong> Proteine (Membranproteine) können nicht in<br />
das Gel einwan<strong>de</strong>rn<br />
Lange Trennzeiten<br />
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Grundprinzipien und Durchführung<br />
A: IEF im Bereich pH 4,35-4,55 B: IEF im Bereich pH 4-10<br />
Isoelektrische Fokussierung:<br />
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Titrationkurvenanalyse<br />
Bestimmung von Nettoladungskurven von Proteinen<br />
Durchführung:<br />
IEF ohne Probe wird auf einem Trägerampholytgel<br />
durchgeführt→ Bildung <strong>de</strong>s pH-Gradienten<br />
Gel wird um 90° gedreht<br />
Probe wird in eine Gelrinne pipettiert<br />
Nach Anlegen eines elektrischen Fel<strong>de</strong>s wan<strong>de</strong>rn die<br />
Proteine in Abhängigkeit ihres pH-Wertes mit<br />
unterschiedlichen Mobilitäten.<br />
Bildung von Titrationskurven mit Schnittpunkt <strong>de</strong>s pI <strong>de</strong>s<br />
Proteins an <strong>de</strong>r Gelrinne<br />
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Grundprinzipien und Durchführung<br />
A: Probenaufgabe auf ein vorfokussiertes Gel<br />
B: Nettoladungskurven nach Anlegen <strong>de</strong>s elektrischen<br />
Fel<strong>de</strong>s<br />
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Präparative elektrophoretische Verfahren<br />
Elektroelution aus Gelen<br />
Präparative Zonenelektrophorese<br />
Präparative isoelektrische Focussierung<br />
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Präparative elektrophoretische Verfahren<br />
Elektroelution aus Gelen<br />
Dient zur Gewinnung von Proteinen aus PA-Gelen zur<br />
weiteren Analyse<br />
Metho<strong>de</strong> A: Protein aus einem ausgeschnittenen<br />
Gelstückchen wird in einer Vertikalelektrophorsekammer<br />
in eine Dialysemembran transportiert.<br />
Metho<strong>de</strong> B: Das Protein wird mittels Puffer ohne<br />
Dialysemembran in einer Miniapparatur in ein<br />
Reaktiongefäß hineineluiert.<br />
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Präparative elektrophoretische Verfahren<br />
Elektroelution aus Gelen<br />
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Präparative Zonenelektrophorese<br />
Reinigungsmetho<strong>de</strong> für<br />
mg-Mengen Protein<br />
Elektrophorese und<br />
Trennung in einzelne<br />
Zonen wird mit<br />
Polyacrylamidgelen in<br />
einem Glasrohr<br />
durchgeführt.<br />
Ankommen<strong>de</strong> Zonen<br />
wer<strong>de</strong>n durch<br />
kontnuierlichen<br />
Pufferstrom abgeführt.<br />
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Präparative IEF<br />
Aufreinigungsmetho<strong>de</strong> für größere Mengen Protein<br />
Kein Gel mit immobilisierten pH-Gradienten<br />
Mehrkammer-Focussierungsapparatur mit gepufferten<br />
isoelektrischen Polyacrylamidmembranen<br />
Zur Probenauftrennung gibt man ein Proteingemisch in<br />
eine Kammer<br />
Die Proteine wan<strong>de</strong>rn nach Anlegen eines Fel<strong>de</strong>s in die<br />
benachbarten Kammern gemäß ihren isoelektrischen<br />
Werten<br />
Das aufgereinigte Protein kann <strong>de</strong>r Kammer entnommen<br />
wer<strong>de</strong>n<br />
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Präparative IEF<br />
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2D <strong>Gelelektrophorese</strong><br />
Sehr großes Auflösungsvermögen<br />
Auftrennung <strong>de</strong>r Proteine erfolgt nach zwei Kriterien:<br />
isoelektrischer Punkt und Molmasse<br />
Proteine mit gleicher Molmasse o<strong>de</strong>r gleichem pI-Wert<br />
können durch die zweite Dimension aufgetrennt wer<strong>de</strong>n.<br />
Trenntechnik zur qualitativen und quantitativen<br />
Untersuchung <strong>de</strong>r Proteinexpression von Zellen,<br />
Geweben und Organismen (Proteomics)<br />
mikropräparative Reinigung von Proteinen aus<br />
komplexen Proteingemischen für <strong>de</strong>ren nachfolgen<strong>de</strong><br />
Charakterisierung und I<strong>de</strong>ntifizierung<br />
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Prinzip<br />
2D <strong>Gelelektrophorese</strong><br />
1.Dimension<br />
Durchführen einer isoelektrischen Fokussierung: die<br />
Proteine ordnen sich gemäß ihrem pI-Wert auf <strong>de</strong>m<br />
Trägerampholyten o<strong>de</strong>r IPG Streifen an<br />
2. Dimension<br />
<strong>de</strong>r Trägerampholyt/Gelstreifen wird um 90% gedreht auf<br />
das SDS-Gel gelegt:<br />
die Proteine wer<strong>de</strong>n gemäß ihrer Masse getrennt<br />
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2D <strong>Gelelektrophorese</strong><br />
1.Dimension:<br />
•Rehydrieren <strong>de</strong>r IPG-Streifen<br />
mit Probe<br />
•Durchführen <strong>de</strong>r IEF, Trennung<br />
nach IP<br />
•Umpuffern mit DTT und<br />
anschließend mit IAA<br />
2.Dimension:<br />
•Auflegen <strong>de</strong>s IPG-Streifens,<br />
quer zur Laufrichtung <strong>de</strong>r<br />
Proteine<br />
•Auftrennen nach Molmasse<br />
•Fixierung und Färbung<br />
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2D <strong>Gelelektrophorese</strong><br />
Abbildung eines 2-D-SDS-PAGE einer Mäuseleberprobe ( Görg A., Biochem.Soc. Trans., 21 (1993)<br />
PD Dr. Cornelia Kasper<br />
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2D-Gel einer Probe mit Standardproteinen<br />
PD Dr. Cornelia Kasper<br />
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