Funktionen des RER

Vorlesung Biologie für Mediziner WS 2010/11
Teil 1 Zellbiologie (Prof. R. Lill)
Themengebiet: Organellen und Proteintransport

Die Zelle, wie wir sie bisher kennen

Komplexität der eukaryotischen Zelle
• Humangenom enthält ca. 23.000 Protein-kodierende Gene
(Hefe: 6.200, E. coli 4.600)
• Pro Zelle 5.000 - 10.000 verschiedene Proteine
• Gewebe- und entwicklungsspezifische Proteine
(Zelltypspezifität)
• Proteine sind kompartimentiert, d.h. in definierten
Reaktionsräumen lokalisiert Organellen

Organellen in der eukaryotischen Zelle

Endomembranen in eukaryotischen Zellen
Wie entstehen sie ???

Rauhes endoplasmatisches Retikulum (RER)
• Netzwerk, flache platte Schläuche
• RER Membran geht in Außenmembran des Kerns über
• Besonders häufig in sekretorischen Zellen
(Drüsen, Plasmazellen des Immunsystems)
Fluor.-mikroskopie
• Besetzt mit zahlreichen Ribosomen
Proteineinschleusung ins RER
Elektronenmikroskopie

Glattes endoplasmatisches Retikulum (SER)
• Nur in einigen Zellen eindeutig zu erkennen
– tubuläres verzweigtes Netzwerk
• Kontinuum mit RER
• Induktion des SER durch viele Stimuli
– z.B. Phenobarbitale, Alkohol, Hormone,
Zigarettenrauch, Medikamente ...

Funktionen des glatten ER
• Leber
– Phospholipidsynthese
– Synthese von anderen Lipiden
– (Prostaglandine etc. (auch in Prostata, Uterus))
– Lipoproteinpartikelsynthese (LDL)
– Glykogensynthese
– Detoxifizierungen (Cytochrome P 450 )
• Muskel
– Speicherung von Ca 2+
– (Sarkoplasmatisches Retikulum)
• Nebennierenrinde
– Steroidhormonsynthese (Cytochrome P 450 )
⇒ verschiedene Sexualhormone

Funktionen des RER
• Einschleusung von Proteinen für
– RER und SER
– Golgi-Apparat
– Lysosomen
– Endosomen
– Plasmamembran
– Sekretproteinen
Secretory proteins
– NICHT:
– Mitochondrien
– Peroxisomen
– Zellkern

Funktionen des RER
• Einschleusung von Proteinen
Signalhypothese (Blobel, 1975) „Unterschied“ freie /
ER-gebundene Ribosomen
Signalsequenz

Mechanismus der Einschleusung von Proteinen ins RER
• Wie kommt ein hydrophiles Protein
über eine hydrophobe Lipiddoppelschicht ?
Signalsequenz
„signal recognition
particle“ (SRP)
Synthese und Translokation eines
Sekretproteins (z.B. Insulin, Immunglobulin)

Funktionen des RER
• „Signal recognition particle“
(SRP)
SRP9
SRP14
Elongationsarrest
– 1 RNA
– 6 Proteine
SRP72
– SRP54 als zentrale
Komponente
• Signalsequenz
+ + hydrophob
5-20 As. 7-12 As. 10-20 As.
SRP54
Signalsequenzerkennung
GTP-Hydrolyse
SRP68
SRP19
Fertiges Protein
Signalpeptidase

Strukturelle Grundlage der SRP Bindung ans Ribosom
• Wie kann man Translationsarrest verstehen ?
Gekrümmte Konformation
wird stabilisiert

Funktionen des RER
• Einschleusung von Membranproteinen ins RER
Synthese und Translokation
eines Plasmamembranproteins
z.B. Cadherin, Glykophorin

Einschleusung von Proteinen ins RER
Topogene Informationen bestimmen Lokalisation
Signalsequenz
→ Lumen
Signals. + Stop-transfer Anker Sequenz → Membran Typ I (N in
)
Signal-Anker Sequenz → Membran Typ II (N out
)
3D Rekonstruktion des
RER-gebundenen Ribosoms
(Größenverhältnisse!)
Film
ER-translocation

Molekulare Funktionsweise eines Translokons
• Wie sieht der Translokationskomplex aus? Cryo-EM Daten
Sichtbarmachung der translozierenden
Polypeptidkette
Konserviert von Hefe bis Mensch

Struktur der Translokationspore
• Wie sieht das Translokon (Sec61) aus?
Bakterielles SecY als Modell:
• 10 α-Helices
Wie bleibt Membran Ionen-dicht?? Stopfen (Plug)
Pdb.Sec61 translocon (+SecY.pse)
© T. Rapoport

Funktionen des RER
• Einschleusung von Proteinen ins RER
• N-Glykosylierung (Dolichol)
• Trimmen der Oligosaccharidreste
Oligosaccharyltransferase

Funktionen des RER
• Proteinfaltung und Bildung von Komplexen
(Chaperone, z.B. Hsp70 = BiP)
• Proteine haben Faltungsanleitung in Primärstruktur (Aminosäuresequenz)
• Viele Proteine falten sich spontan korrekt (trotz Mrd. Möglichkeiten der
Strukturbildung), Anfinsen Nobelpreis
• Was passiert häufig ohne Chaperone?
Faltung
(kein aggregiertes Protein)
Aggregation
plus
Chaperon
minus
Chaperon
Huntington disease, Alzheimer,
Parkinson, Creutzfeld-Jacob

Funktionen des RER
• Proteinfaltung und Bildung von Komplexen
Mechanismus:
=Hsp70
Ungefaltet Nativ gefaltet
– Bindung von Chaperonen an ungefaltete (hydrophobe)
Proteinregionen
– Dadurch niedrige Konzentration an freien, ungefalteten Proteinen
– Geringere Aggregation entfalteter (klebriger) Proteine und mehr
Zeit zur Faltung
• Disulfidbrückenbildung (-S-S-)
(Proteindisulfidisomerase, Ero1)
Stabilisierung der Proteine
WICHTIG für Sekretproteine (z.B. Antikörper), Insulin

Funktionen des RER
• "Quality control“
(Kein Verlassen des ER ohne korrekte Faltung/Assemblierung)
– WICHTIG bei Mucoviscidose = Cystische Fibrose
Faltung und Assemblierung von Haemagglutinin (Influenza-Virus)
1. Faltung
BiP
Calnexin
Calreticulin
2. S-S
Brücken
3. Assemblierung
Prozesse wichtig bei biotechnologischer Produktion von
– Erythropoietin (Proliferation von Blutzellen; Doping)
– Plasminogen-Aktivator (Antigerinnungsfaktor bei Herzinfarkt)
– Insulin (Diabetes)

Die Idee des vesikulären Transports
Ein über Vesikel
verbundenes
Endomembransystem
• Endoplasmatisches
Retikulum
• Golgi Apparat
• Sekretorische Vesikel
• Plasmamembran
• Lysosomen
• Endosomen
Konstitutive Sekretion (alle Zellen)
Regulierte Sekretion (Drüsen)
Anterograder und retrograder Transport
NICHT verbunden: Mitochondrien
Peroxisomen
Zellkern
Membrantransport von Proteinen

Pulse-chase
Radiomarkierung
+
Elektronenmikroskopische
Autoradiographie
(G. Palade)
• Radiomarkierung mit
3
H Leucin für 3 min ⇒ A
• „Chase“ mit kaltem Leucin
C
A
D
B
♦
♦
7 min Inkubation⇒ B
37 min Inkubation⇒ C
♦ 117 min Inkubation⇒ D
• EM und Autoradiographie

Vesikulärer Transport - Wie funktioniert das?
• Prinzip des Vesikeltransports
– 1. Vesicle budding (Fission, Knospen)
– 2. Vesicle Transport (Zytoskelett Tubulin und Aktin)
– 3. Fusion mit Zielmembran
– 4. Membranorientierung (Asymmetrie, z.B Zuckerketten)
1.
-Z
-Z
2. 3.
-Z
-Z

Vesikulärer Transport - Wie funktioniert das?
• Prinzip des Vesikeltransports
– 1. Vesicle budding (Fission, Knospen)
– 2. Vesicle Transport (Zytoskelett Tubulin und Aktin)
– 3. Fusion mit Zielmembran
– 4. Membranorientierung (Asymmetrie, z.B Zuckerketten)
1.
-Z
-Z
2. 3.
-Z
-Z
Plasmamembran (Zucker extrazellulär)

Vesikulärer Transport - Wie kann man das verfolgen?
Live cell imaging mit Fluoreszenzmikroskopie
v17-04-Golgi_sorting_a.avi
v17-04-Golgi_sorting_b.avi

Film als Übersicht
Secretion

Wie erfolgt das vesicle budding ???
oder
Vor dem Weggehen einen Mantel anziehen
• Verschiedene coats für verschiedene Membranen

Vesikulärer Transport - Das Clathrin coat
• „Coat“-abhängiges budding, z.B. mit Clathrin Bindung
dadurch Krümmung der Membran
Clathrin
Coated pit
(Stachelsaumgrübchen)
Coated vesicle
(Stachelsaumvesikel)
Dann rasches Uncoating (Coat-ablösung)

Starke Ähnlichkeiten zwischen
Clathrin Coats und COP II Coats
Verschiedene COP II
Strukturen im EM
Vergleich: COP II Clathrin coat

Vesikulärer Transport - Wie wird Sortierung erreicht?
• Proteine enthalten spezifische Signale für Wirkort
• Jedes Vesikel wird spezifisch mit Proteinen bestückt
• Unterschiedlich für anterograden und retrograden Transport
• Komplizierte „Sorting machinery“
Bsp: KDEL-Rezeptor, Rückholmechanismen, SNAREs
Prä
Lösliches ER Protein
KDEL
• KDEL:
K = Lys
D = Asp
E = Glu
L = Leu

Das V- und T-SNARE Konzept
oder
Wie wird der Vesikeltransport spezifisch?
V-SNARE
T-SNARE
Vesikel
Target

SNAREs als Ziele der Botulinum- and Tetanustoxine
• Toxine sind
– aus verschiedenen Bakterien (Clostridien)
– extrem giftig (

• 1898 Camillo Golgi (Padua)
– Apparato reticolare interno
(Metallfärbung - OsO 4 )
Der Golgi-Apparat
– Nobelpreis 1906 mit Ramon y Cajal
• Bis in 50 er Jahre Kontroverse:
Golgi App.: Organell oder Artefakt??
• ≈ 1950 EM Daten:
Golgi Strukturen in allen Zellen
vor allem in sekretorischen Zellen
(Schleimbildende Zellen)
– Ausgeprägt in Pflanzen Zellen
– Dictyosomen

Der Golgi-Apparat – zentral im sekretorischen Weg
Golgi-Subkompartimente: CGN - cis - medial - trans - TGN

Der Golgi-Apparat - Morphologie
EM-Techniken

Der Golgi-Apparat
• Golgi Kompartimente: CGN - cis - medial - trans - TGN
– Versch. Färbemethoden (z.B. Immuno-Gold EM,
Histochemische Färbungen
Trans
(Nukleosid-
Diphosphatase)
Cis (OsO 4 )
Golgi!
TGN
(Saure
Phosphatase)

Funktionen des Golgi-Apparates
• O-Glykosylierung
(Ser, Thr, Hydroxylysin)
• Komplexe Modifikation
der N-Glykosyl-
Oligosaccharidreste

Funktionen des Golgi-Apparates
• O-Glykosylierung (Ser, Thr, Hyl)
• Komplexe Modifikation der N-Glykosyl-Oligosaccharidreste
• Sulfatierung der Zuckerreste
(Aufbau Extrazelluläre Matrix, Schleimbildung)
Glucosaminoglykane, Hyaluronsäure

Funktionen des Golgi-Apparates
• Synthese von Glykolipiden (Sphingolipide, Ganglioside)
– Bedeutung der Zucker für Blutgruppe (wirken als Antigene)

Funktionen des Golgi-Apparates
• Proteinspaltungen (im TGN und später
in sekretorischen Vesikeln):
Spezifische Proteasen spalten ...
– Proinsulin Insulin (Hyperproinsulinämie)
– Neuropeptide
– virale Proteine
– Hormone
Condensing
vacuole
Secretory
granula
α-Proinsulin
α-Insulin
In kondensierenden Vakuolen In sekretorischen Granula

Rolle des TGN bei der Sortierung von Proteinen
• Regulierte Sekretion (Pankreas, andere Drüsen, Neuronen)
(Kondensierende Vakuolen, Zymogengranula, Sekretorische Granula)
Aktivierung von Proteasen, Hormonen, Neuropeptiden
SG
CV =
kondensierende SG =
Vakuolen sekretorische
Granula

Rolle des TGN bei der Proteinsortierung - 4 Wege
• Regulierte Sekretion
(Exozytose)
• Konstitutive Sekretion
(Exozytose, sekretorische Vesikel)
Exozytose
• Lysosomen - Endosomen
• Retrograder Transport