Stoffanreicherung in der Vakuole nach dem Ionenfallenprinzip

Praktikum
Biologie für Mediziner/innen
WiSe 2013/2014
Praktikumsteil
Lichtmikroskopie
Erreger der Malaria
Leitung
Dr. Kathrin Bolte
Email: kathrin.bolte@biologie.uni-marburg.de

Teil I: Lichtmikroskopie
Das Lichtmikroskop ist immer noch ein wichtiges Hilfsmittel zur Erschließung des
Mikrokosmos und hat, durch die Entwicklung neuer Techniken und den Einzug des
Computers in die mikroskopische Analyse, eine Renaissance erlebt.
Wer moderne Lichtmikroskope optimal nutzen will, muss über die Grundlagen des
Aufbaus, die Funktion und den richtigen Gebrauch informiert sein. Aus diesem Grund soll
der Aufbau eines einfachen Kursmikroskops und sein Strahlengang besprochen werden.
Optische Grundlagen:
Wenn man einen Gegenstand genau betrachten will, muss man ihn so nah wie möglich an
das Auge heranbringen, da ein großer Sehwinkel zu einer guten Auflösung führt. Zwei dicht
nebeneinander liegende getrennte Punkte können dann noch vom Auge aufgelöst werden,
wenn der Sehwinkel mindestens eine Bogenminute beträgt. Die Grenze ist allerdings durch
die Akkomodationsfähigkeit des Auges gegeben, die minimal bei einem Objektabstand
(Betrachtungsabstand) von ca. 10 cm, in Normalfall bei ca. 25 cm liegt.
Die Größe des Sehwinkels a nimmt mit Annäherung an das Auge zu; der normale
Betrachtungsabstand liegt bei ca. 25 cm.
Da die Auflösung des Auges begrenzt ist, müssen wir Hilfsmittel anwenden, um diese
Barriere zu überwinden. Gängige Vergrößerungsgeräte sind einfache Lupen oder auch
Projektoren (Beamer, Diaprojektoren), deren Optik, vereinfacht dargestellt, aus einem
Sammellinsensystem besteht.
Lupe und Projektor
Befindet sich der abzubildende Gegenstand zwischen der Hauptebene und dem Brennpunkt
einer Sammellinse, so wirkt sie als Lupe. Der Gegenstand wird seitenrichtig vergrößert
abgebildet; er lässt sich jedoch nicht auf einem Bildschirm abbilden, sodass man von einem
virtuellen (scheinbaren) Bild, im Gegensatz zu einem reellen (wirklichen), spricht.
Da bei einer Lupe nicht ohne weiteres zur Messung des Abbildungsmaßstabes Abstände
bestimmt werden können, rechnet man mit Winkeln (Sehwinkel). Wenn der Gegenstand
immer näher an den Brennpunkt herangeführt wird, entfernt sich das Bild immer weiter von
der Linse, die Vergrößerung nimmt zu, wobei der Sehwinkel gleich bleibt. Dies bedeutet,
dass Abbildungsmaßstab und Vergrößerung völlig verschiedene Begriffe sind. Die
Vergrößerung hängt von der Sehweite ab, die man mit 25 cm definiert; d.h. dass das Objekt
25 cm vom Auge entfernt ist. Demnach beträgt die Vergrößerung einer Lupe:
V = 25 (cm) / f (cm)
f = Brennweite
Bei Projektoren befindet sich der Gegenstand (z. B. ein Dia) zwischen der einfachen und
doppelten Brennweite der Sammellinse. Es entsteht ein seitenverkehrtes reelles vergrößertes
Bild. Dieses ist auf einem Bildschirm abbilden.

Das Lichtmikroskop – Optisches System
Lichtmikroskope sind Kombinationsgeräte aus einem Projektorteil und einem Lupenteil.
Betrachten wir den Strahlengang eines typischen Lichtmikroskops: Im Unterteil des Stativs,
befindet sich die meist in der Helligkeit elektronisch regelbare Lichtquelle, deren Licht
durch den sogenannten Kondensor unter dem Objekttisch, auf das Präparat zentriert wird.
Das Präparat (Gegenstand) wird durch das Objektiv, ein Projektorlinsensystem, vergrößert
abgebildet; es entsteht im Tubus ein reelles Zwischenbild. Der Abbildungsmaßstab (=
Vergrößerungsmaßstab) ist jeweils auf den Objektiven angegeben (z. B. 25:1). Das
Zwischenbild wird durch das wie eine Lupe wirkende Okular nachvergrößert, wobei die
Nachvergrößerung von der Okularvergrößerung (z.B. 10x) abhängt. Die
Gesamtvergrößerung (VM) entspricht dem Produkt aus Maßstabszahl des Objektives (MZ)
und der Vergrößerung des Okulars(VO):
VM=MZ X VO
a)
b)
1: Okulare
2: Binokularer Tubus
3: Mikroskopstativ
4: Rändelschraube für Tubusarretierung
5: Beleuchtungsstärkeregler
6: Ein-/Ausschalter mit integrierter Kontrollampe
7: Fokussiertrieb Feinverstellung (beidseitig)
8: Fokussiertrieb Grobverstellung (beidseitig)
9: Triebknopf für Verstellung des Kreuztisches in x-Richtung
10: Triebknopf für Verstellung des Kreuztisches in y-Richtung
11: Leuchtfeldblende
12: Kondensorträger
13: Hebel für Aperturblendeneinstellung
14: Kondensor
15: Zentrierschraube für Kondensor (beidseitig)
16: Kreuztisch für Objekthalter
17: Objektiv
18: Objektivrevolver 4fach oder 5fach
Abbildung 1: a) Vergrößerung eines Objekts durch Sammellinsen, b) Aufbau des
Lichtmikroskops

Stoffanreicherung in den Vakuolen von Zwiebelzellen nach dem
Ionenfallenprinzip
Theorie
Die Neutralrotmoleküle sind lipophil und können deshalb Membranen durchdringen. Im
sauren Milieu der Vakuole bindet das lipophile Neutralrot Wasserstoff-Ionen (H + ) und
verliert somit als Neutralrot-Kation seinen lipophilen Charakter. Da die Vakuolenmembran
für hydrophile Substanzen nicht durchlässig ist, wird das Neutralrot-Kation in der Ionenfalle
der Vakuole gefangen. Es wandern bis zur Einstellung des Konzentrationsgleichgewichtes
Moleküle in die Vakuole ein.
Mit diesem Versuch lässt sich die Vakuole und ihre Größe recht anschaulich darstellen. Es ist
zu erkennen, dass, im Gegensatz zu tierischen Zellen, die Vakuole einen großen Teil der
pflanzlichen Zelle einnimmt.
Der Versuch verdeutlicht auch den Stofftransport über Membransysteme. Es muss jedoch
betont werden, dass normalerweise die meisten Substanzen aktiv durch spezifische
Carriersysteme über Membranschranken transportiert werden.
Praktischer Teil
Handwerkszeug
Pinzette, Zeichenmaterialien
I. Einstellung der Köhlerschen Beleuchtung
1. Objektiv 10x einschwenken
2. Kondensor auf Hellfeldposition (kein Kontrastelement im Strahlengang), evtl.
Kondensorfrontlinse einschwenken
3. bekanntes Präparat fokussieren
4. Leuchtfeldblende schließen – bei guter Zentrierung des Kondensors wird das
Präparat nur noch aus der Mitte des Sehfelds heraus beleuchtet
5. Kondensor auf- bzw. abwärts drehen, bis scharfe Kanten der Leuchtfeldblende
abgebildet werden.
6. Leuchtfeldblende durch Zentrierschrauben am Kondensor in das Bildzentrum
bringen
7. Leuchtfeldblende bis knapp über den Sehfeldrand öffnen
8. Anpassung der Aperturblende des Kondensors bis sich hinsichtlich Auflösung und
Kontrasteindruck der optimale Bildcharakter einstellt

II. Präparation und mikroskopische Betrachtung der Epidermis von
Zwiebeln
Eine Zwiebel wird geviertelt, der untere Teil, der sogenannte Zwiebelkuchen, und der obere
trockene Teil abgeschnitten und die Schuppen getrennt. Die innere Seite einer Schuppe
(konkave Oberseite) wird mit der Rasierklinge oder einem scharfen Skalpell in kleine
Rechtecke angeschnitten. Mit der Pinzette wird vorsichtig von einer Ecke her die matt
aussehende Epidermis abgezogen und in einen Tropfen Wasser auf einen Objektträger
gebracht. Man kippt ein Deckglas darauf, damit keine Luftblasen entstehen. Überschüssiges
Wasser wird mit dem Filtrierpapier von der Seite abgesaugt.
Stellen Sie das Präparat bei schwacher Vergrößerung ein und zeichnen und beschriften Sie:
a) das charakteristische Zellmuster der Epidermis.
b) bei hoher Vergrößerung eine Zelle im Detail. Der Zellkern ist deutlich zu erkennen,
das Cytoplasma vor allem an den Zellenden; bei hoher Vergrößerung und
zugezogener Kondensorblende ist auch die Plasmaströmung zu beobachten.
Die Vakuole als Ionenfalle
Es wird ein neues Epidermispräparat hergestellt, das Epidermishäutchen in einen Tropfen
Neutralrot-Lösung auf den Objektträger gebracht und mit einem Deckglas abgedeckt.
Alternativ kann in das schon vorhandene Präparat von der Seite Neutralrot-Lösung
eingesaugt werden, indem man einen Tropfen Neutralrot-Lösung unmittelbar neben das
Deckglas pipettiert und von der anderen Seite mit einem Filtrierpapierstreifen einsaugt.
Die Zwiebelepidermis wird unter dem Mikroskop untersucht. Nach 10 – 20 Minuten färben
sich allmählich die Vakuolen rot und die begrenzenden Vakuolenmembranen sind deutlich
zu erkennen. Dabei ist zu beachten, dass die Neutralrotlösung vielfach eine gewisse
Vakuolenkontraktion verursacht. Man entfernt überschüssigen Farbstoff durch Spülen mit
Wasser (seitl. Einsaugen). Der Versuch zeigt, dass der Farbstoff durch Zellwand,
Zellmembran und Vakuolenmembran in die Vakuole eingedrungen und dort angereichert
ist.
Plasmolyse
Durch Plasmolyse kann bewiesen werden, dass die Zellen noch leben. Aus diesem Grund
wird ein Tropfen 1M Kaliumnitratlösung (KNO3) unmittelbar neben das Deckglas gesetzt
und die Lösung mit einem Filterpapierstreifen durch das Präparat gesaugt. Durch
Wasserentzug wird die Plasmolyse der Zellen (Konvexplasmolyse) induziert, die Vakuolen
färben sich dadurch noch stärker an. Durch die Plasmolyse und die hervorgerufene
Ablösung der Cytoplasmamembran von den festen Zellwänden, sind Plasmamembranen
und das Cytoplasma als heller Saum und die Vakuolenmembran als Begrenzungen gut zu
erkennen.

Materialien
Herstellung der Neutralrot-Lösung:
0,1 g Neutralrot
ad 1000 ml Leitungswasser
Nach Lösen des Farbstoffes ev. filtrieren. Diese Stammlösung wird unmittelbar vor
Gebrauch 1:10 mit Leitungswasser verdünnt.
1M KNO3 Lösung
Teil II: Erreger der Malaria
Theorie
Bedeutung: Malaria ist die bei weitem wichtigste tropische parasitische Krankheit. Wenn
man einmal von der Tuberkulose absieht, tötet sie mehr Menschen als alle anderen
übertragbaren Krankheiten. Erreger der Malaria beim Menschen sind: Plasmodium falciparum,
Plasmodium vivax, Plasmodium malariae und Plasmodium ovale. Der wichtigste und letalste
Erreger ist Plasmodium falciparum.
Heute leben ca. 3,3 Milliarden Menschen in Malariagebieten in Afrika, Asien und
Süd/Mittelamerika, dies sind 40 % der Weltbevölkerung. Laut WHO gab es 2012 ca. 219 Mio
klinische Fälle; die Todesrate liegt bei mehr als 660 000 Menschen pro Jahr, wobei der
Krankheit vor allem Kinder und Jugendliche in Staaten und Gegenden zum Opfer fallen, in
denen keine oder nur eine geringe medizinische und staatliche Infrastruktur besteht (Afrika,
südlich der Sahara).
Alle 45 Sekunden stirbt ein Kind an Malaria. Risikogruppen sind auch schwangere Frauen,
Touristen, Fernreisende aus Europa, Amerika, die nicht immun sind (sog. Airport Malaria),
und Arbeiter, die in verseuchte Gebiete geschickt werden.
Symptome: Die Symptome beinhalten Fieberanfälle, die oft in bestimmten Rhythmen
auftreten und vom Entwicklungszyklus der Erreger abhängen (Tabelle 1).
Tabelle 1: Charakteristika der humanpathogenen Plasmodien-Spezies
Species Malaria-Art Inkubationszeit Fieberanfälle andere Symptome Mortalität
P. vivax M. tertiana 8-16 Tage alle 48
Schüttelfrost,
-
P. ovale M. tertiana ca. 15 Tage
Stunden
alle 48
Mattigkeit, Leber-und
Milzschwellungen, +/-
Stunden
Schlafsucht
P. malariae M. quartana 20-35 Tage alle 72 Nierenschädigungen +/-
Stunden
P. falciparum M. tropica 7-12 Tage unregelmäßig Kapillarverstopfung,
insbesondere im
Gehirn
+

Behandlung: Bewährt haben sich als Anti-Malaria-Mittel Chinoline, z.B. Chloroquin. Es
treten inzwischen Resistenzen auf, die neue Mittel erforderten, z.B. Amodiaquin,
Artemisininderivate oder die Gabe von Kombinationspräparaten; an einer Malaria-
Schutzimpfung wird intensiv gearbeitet.
Die Plasmodien
Plasmodien gehören zum Stamm der Apicomplexa (Ordnung Haemosporidia), die nach ihrem
wichtigsten Merkmal, dem Apikalkomplex am vorderen Zellpol, benannt sind. Wesentliche
Bestandteile des Apikalkomplexes sind ein Conoid, von einem Polring ausgehende
Mikrotubuli, flaschenförmige Rhoptrien und Mikronemen. Rhoptrien sind wohl
enzymgefüllte Organellen, die die Penetration der Wirtszelle (Erythrocyten) ermöglichen.
Plasmodien enthalten eine komplexe reduzierte Plastide, die den Rest einer „degenerierten“
Rotalge darstellt. E muss sich zeigen, ob diese Eigenschaft einen Ansatzpunkt zur Therapie
bietet.
Lebenszyklus
Der Lebenszyklus von Plasmodium ist komplex (Abbildung 1). Die Protisten führen einen
Wirtswechsel zwischen einem Wirbellosen (Anopheles ssp.)- und dem Menschen durch,
wobei sexuelle Vermehrung in der Mücke und asexuelle Vermehrung im Menschen
stattfindet.
Entwicklung im Menschen:
Saugt eine infizierte Anopheles-Mücke (nur Weibchen) Blut, so gelangen mit dem Speichel
sog. Sporozoiten in die Blutbahn. Sie befallen dann das Leberparenchym, indem sie durch
rezeptorvermittelte Endocytose in die Zellen eindringen. Der Apikalkomplex verschwindet,
die Sporozoiten werden zu Trophozoiten. Sie ernähren sich vom Cytoplasma der Wirtszelle
und vermehren sich durch multiple Teilungen, Schizogenie genannt.
Es entstehen Merozoiten, die nach Lyse der Leberzellen ins Blut gelangen und dort die
Erythrocyten durch eine Art „erzwungene Endocytose“ befallen (Erythrocyten besitzen
alleine keine Fähigkeit zur Endocytose). Der Parasit lebt in den Erythrocyten in einer
„parasitophoren Vakuole“ und kommt so mit dem Cytoplasma des Erythrocyten nicht in
Kontakt. Die Merozoiten verwandeln sich in Trophozoite und vermehren sich wiederum
durch Schizogonie. Wenn die Erythrocyten platzen, werden die Merozoiten freigesetzt und
können neue Erythrocyten infizieren. Einige Merozoiten können sich in Erythrocyten zu
Makrogamonten und Mikrogamonten entwickeln.
Plasmodium ernährt sich von Hämoglobin, wobei Häm in der Nahrungsvakuole zu
Hämozoin polymerisiert wird. Die Anhäufung von Hämozoin ist an braunen Bereichen zu
erkennen. Chinoline, die in der Nahrungsvakuole angereichert werden, verhindern die
Polymerisation von Häm, das in monomerer Form auf den Parasiten toxisch wirkt.

Entwicklung in Anopheles ssp.:
Wenn Mikro- und Makrogamonten nach einem Stich aus dem Blut des Menschen in den
Verdauungstrakt von Anopheles ssp. gelangen, werden sie freigesetzt. Nach Verschmelzung
und Oocytenbildung infizieren sie das ganze Insekt und auch die Speicheldrüsen. Von hier
werden sie bei einem Stich wieder auf den Menschen übertragen.
Abbildung 2: Entwicklungskreislauf von Plasmodien
Praktischer Teil
Es werden Blutausstrichpräparate verteilt, die Erythrocyten enthalten, die mit Plasmodium
falciparum infiziert sind.
Gewaschene Erythrocyten der Blutgruppe A wurden in RPMI-Medium/10 % Human-Plasma
im Verhältnis 50:1 mit Plasmodium falciparum infiziert.
Die Suspension wurde auf Deckgläser ausgestrichen und ca. 10-12 Minuten mit Giemsa
gefärbt, Giemsa enthält Eosin, das saure Substanzen anfärbt und Methylenblau, das auf
basische Substanzen anspricht. Die Präparate wurden luftgetrocknet, wobei das Human-
Plasma der Suspension die Erythrocyten auf dem Objektträger festklebt. Es folgte ein kurzes
Methanolbad zur Fixierung.

Aufgabe: die Präparate werden im Mikroskop untersucht
a) Schätzen Sie durch Zählen grob die Parasitämie in % infizierter Erythrocyten.
b) Versuchen Sie folgende Stadien zu unterscheiden und zeichnen Sie die Stadien:
- junge ringförmige Trophozoite; Einzelinfektion, Mehrfachinfektion
- Trophozoite in Siegelringform, marginaler Form, mit 1 oder 2 Chromatin-
Flecken
- fast reife Trophozoite mit Pigment im Cytoplasma
- reife Trophozoite mit geklumptem Hämozoin-Pigment
- Schizontenbildung, reife Schizonten