Vesikulärer Transport
Vesikulärer Transport
Vesikulärer Transport
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Vorlesung Zellbiologie – KM 2 - 2011<br />
Vesikulärer <strong>Transport</strong><br />
Prof. Roland Lill<br />
Zytobiologie
Endomembranen in eukaryotischen Zellen<br />
Wie entstehen sie ???
Pulse-chase<br />
Radiomarkierung<br />
+ Elektronenmikroskopische<br />
Autoradiographie<br />
(G. Palade)<br />
• Radiomarkierung mit<br />
3<br />
H Leucin für 3 min<br />
• EM und Autoradiographie<br />
A<br />
• „Chase“ mit kaltem Leucin<br />
C<br />
A<br />
D<br />
B<br />
<br />
<br />
7 min Inkubation B<br />
37 min Inkubation C<br />
117 min Inkubation D
Die Idee des vesikulären <strong>Transport</strong>s<br />
Ein über Vesikel<br />
verbundenes<br />
Endomembransystem<br />
• Endoplasmatisches<br />
Retikulum<br />
• Golgi Apparat<br />
• Sekretorische Vesikel<br />
• Plasmamembran<br />
• Lysosomen<br />
• Endosomen<br />
• NICHT VERBUNDEN:<br />
– Mitochondrien<br />
– Peroxisomen<br />
– Zellkern
Die Idee des vesikulären <strong>Transport</strong>s<br />
Ein über Vesikel<br />
verbundenes<br />
Endomembransystem<br />
• Endoplasmatisches<br />
Retikulum<br />
• Golgi Apparat<br />
• Sekretorische Vesikel<br />
• Plasmamembran<br />
• Lysosomen<br />
• Endosomen<br />
• NICHT VERBUNDEN:<br />
– Mitochondrien<br />
– Peroxisomen<br />
– Zellkern<br />
Anterograder und retrograder <strong>Transport</strong>
Vesikulärer <strong>Transport</strong> - Wie funktioniert das?<br />
• Prinzip des Vesikeltransports<br />
– 1. Vesicle budding (Fission, Knospen)<br />
– 2. Vesicle <strong>Transport</strong> (Zytoskelett Tubulin und Aktin)<br />
– 3. Fusion mit Zielmembran<br />
– 4. Membranorientierung (Asymmetrie, z.B Zuckerketten)<br />
1.<br />
-Z<br />
-Z<br />
2. 3.<br />
-Z<br />
-Z<br />
Plasmamembran (Zucker extrazellulär)
Vesikulärer <strong>Transport</strong> - Wie kann man das verfolgen?<br />
Live cell imaging mit Fluoreszenzmikroskopie<br />
v17-04-Golgi_sorting_a.avi<br />
v17-04-Golgi_sorting_b.avi
Vesikulärer <strong>Transport</strong> – Eine einfache Zusammenfassung<br />
Mcb0502n.Secretion.mpg
Wie funktioniert der Vesikeltransport ???<br />
• Wie testen wir den Prozess überhaupt?<br />
• Welche Moleküle nehmen an dem Prozess teil?<br />
• Was ist der molekulare Mechanismus, die Triebkraft?<br />
• Wie erklärt sich die Spezifität des <strong>Transport</strong>s (Richtung,<br />
Cargo-Auswahl, Genauigkeit)?
Klassischer Test zum Studium der Vesikelfusion<br />
Jim Rothman, ab 1988<br />
Mutated in GlcNAc transferase<br />
VSV infected<br />
Wild-type in GlcNAc transferase<br />
not infected<br />
• NSF, NEM-sensitive factor (ATPase)<br />
• SNAP, soluble NSF attachment proteins ()<br />
• SNARE, SNAP receptors (membrane proteins)
Das V- und T-SNARE Konzept<br />
oder<br />
Wie wird der Vesikeltransport spezifisch?<br />
V-SNARE<br />
T-SNARE<br />
Vesikel<br />
Target
Struktur eines SNARE Komplexes<br />
• Coiled-coil Struktur<br />
• Verdrillt<br />
• Membran-verankert<br />
• Jedes Kompartiment hat eigenes T-<br />
SNARE (drei coiled-coils)<br />
• Jedes Vesikel bekommt<br />
spezifisches V-SNARE mit<br />
• Nur die korrekten V/T-Paare leiten<br />
Fusion ein (Vesikelfusionsassay)
SNAREs als Ziele der Botulinum- and Tetanustoxine<br />
• Aus Clostridien (Bakterien)<br />
• Extrem giftig (1 µg †)<br />
• Hoch spezifisch<br />
• Metalloproteasen<br />
• Neurologische Symptome<br />
(keine Acetylcholin Ausschüttung,<br />
Doppelsehen, Atemstillstand)<br />
Botox als “Faltenlöser”<br />
Ohne Botox<br />
Mit Botox
Die Rab Proteine, ein zweiter Garant<br />
für die Spezifität der Vesikelfusion<br />
• GTPase Zyklus<br />
(auch bei EF der Translation,<br />
Ras, SRP, SRP-Rez. etc.)<br />
• Lipidanker
Viele verschiedene Rab Proteine für<br />
verschiedene Kompartimente
Modell: Die drei Schritte der Vesikelfusion<br />
3) Fusion<br />
V/T-SNARES<br />
V-SNARES<br />
2) Docking (Rab)<br />
1) Priming<br />
T-
Wie erfolgt das vesicle budding ???<br />
oder<br />
Vor dem Weggehen einen Mantel anziehen<br />
• Verschiedene coats für verschiedene Membranen
Drei Arten der Vesikelbildung<br />
(Fission or budding of vesicles)<br />
• Clathrin coat (heavy chain and light chain)<br />
Endocytosis, TGN-Lysos.<br />
• COP I coat (Coatamer, ARF1) Intra-Golgi, Endosomes<br />
• COP II coat (Sec13/31, Sec23/24) ER - Golgi
Bauprinzip des Clathrin Coats<br />
Hexagonales Fass: 36 Triskelions<br />
Triskelion<br />
Kombination von Pentagons<br />
und Hexagons
Quick-freeze deep etching<br />
Methode der EM<br />
(J. Heuser)<br />
Bauprinzip der Clathrin Coats<br />
Coated pit<br />
(Stachelsaumgrübchen)<br />
Coated vesicle<br />
(Stachelsaumvesikel)<br />
Self assembly of clathrin<br />
Film: v17-04-clathrin.avi
Starke Ähnlichkeiten zwischen Clathrin und COP II Coats<br />
Verschiedene COP II<br />
Strukturen im EM<br />
Vergleich: COP II Clathrin coat
Clathrin-abhängiges Budding (Knospen)
Adapterkomplexe arbeiten an unterschiedlichen Zellorten<br />
AP-1: TGN Endosome<br />
AP-2: Endocytosis (PM Endosome)<br />
AP-3: TGN or Endosome Lysosome<br />
AP-4: Lysosome<br />
GGAs: TGN Endosome
Aufbau der Adapterkomplexe<br />
Cargo proteins<br />
NPXY<br />
YXXF (F : hydrophobic residue)<br />
Di-leucine
Rolle des Dynamins beim budding<br />
• Große Proteinfamilie<br />
• Mitglieder beteiligt an Fissionsprozessen<br />
(Vesikel, Peroxisomen,<br />
Mitochondrien, Chloroplasten,<br />
Bakterien, ...)<br />
Immun-EM<br />
• GTPase<br />
• Polymerisiert zu Aggregaten
Rolle des Dynamins beim budding<br />
• Große Proteinfamilie<br />
• Mitglieder beteiligt an Fissionsprozessen<br />
(Vesikel, Peroxisomen,<br />
Mitochondrien, Chloroplasten,<br />
Bakterien, ...)<br />
Immun-EM<br />
• GTPase<br />
• Polymerisiert zu Aggregaten<br />
Wie funktioniert das Dynamin?<br />
Pinchase
Rolle des Dynamins beim budding<br />
• Große Proteinfamilie<br />
• Mitglieder beteiligt an Fissionsprozessen<br />
(Vesikel, Peroxisomen,<br />
Mitochondrien, Chloroplasten,<br />
Bakterien, ...)<br />
Immun-EM<br />
• GTPase<br />
• Polymerisiert zu Aggregaten<br />
Wie funktioniert das Dynamin?<br />
Pinchase<br />
Poppase
Prinzipien des Vesicle buddings<br />
Durch coat-Bindung wird Membrankrümmung eingeführt<br />
z.B. Sar1<br />
oder Arf<br />
GDP<br />
GEF<br />
Coat Coat Coat<br />
SNAREs<br />
GTP<br />
Lipid anchors<br />
Myristoyl, farnesyl,<br />
palmitoyl ...<br />
Coat Coat Coat<br />
Adapter<br />
Cargo<br />
GTP<br />
SNAREs<br />
Adapter<br />
Cargo<br />
GTP<br />
SNAREs<br />
Adapter<br />
Cargo<br />
Membran<br />
Signal für Bindung: z.B. Y-X-X-Y<br />
Budding<br />
Rapid uncoating<br />
(Hsp70)
Welche Mechanismen garantieren den spezifischen<br />
<strong>Transport</strong> von Proteinen???<br />
• Sortierungssignale in Membranproteinen<br />
– spezifisch für jeweiliges Kompartiment<br />
– oft nur 1-2 Aminosäurereste<br />
– oft noch unbekannt<br />
Beispiel: Sortierungssignale<br />
für COPI Vesikel:<br />
- Di-Lys motif KKXX<br />
- Di-Phe, di Lys motif<br />
(-FFXXKKXX)
Rückführung von löslichen ER Proteinen<br />
durch KDEL-Rezeptor<br />
• KDEL =<br />
K = Lys<br />
D = Asp<br />
E = Glu<br />
L = Leu<br />
Prä<br />
Lösliches ER Protein<br />
KDEL
Zusammenfassung des vesikulären <strong>Transport</strong>s<br />
• Was haben wir hierzu<br />
gelernt ?<br />
Exzellenter Review mit guten Bildern:
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