Funktionen des RER
Funktionen des RER
Funktionen des RER
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Vorlesung Biologie für Mediziner WS 2010/11<br />
Teil 1 Zellbiologie (Prof. R. Lill)<br />
Themengebiet: Organellen und Proteintransport
Die Zelle, wie wir sie bisher kennen
Komplexität der eukaryotischen Zelle<br />
• Humangenom enthält ca. 23.000 Protein-kodierende Gene<br />
(Hefe: 6.200, E. coli 4.600)<br />
• Pro Zelle 5.000 - 10.000 verschiedene Proteine<br />
• Gewebe- und entwicklungsspezifische Proteine<br />
(Zelltypspezifität)<br />
• Proteine sind kompartimentiert, d.h. in definierten<br />
Reaktionsräumen lokalisiert Organellen
Organellen in der eukaryotischen Zelle
Endomembranen in eukaryotischen Zellen<br />
Wie entstehen sie ???
Rauhes endoplasmatisches Retikulum (<strong>RER</strong>)<br />
• Netzwerk, flache platte Schläuche<br />
• <strong>RER</strong> Membran geht in Außenmembran <strong>des</strong> Kerns über<br />
• Besonders häufig in sekretorischen Zellen<br />
(Drüsen, Plasmazellen <strong>des</strong> Immunsystems)<br />
Fluor.-mikroskopie<br />
• Besetzt mit zahlreichen Ribosomen<br />
<br />
Proteineinschleusung ins <strong>RER</strong><br />
Elektronenmikroskopie
Glattes endoplasmatisches Retikulum (SER)<br />
• Nur in einigen Zellen eindeutig zu erkennen<br />
– tubuläres verzweigtes Netzwerk<br />
• Kontinuum mit <strong>RER</strong><br />
• Induktion <strong>des</strong> SER durch viele Stimuli<br />
– z.B. Phenobarbitale, Alkohol, Hormone,<br />
Zigarettenrauch, Medikamente ...
<strong>Funktionen</strong> <strong>des</strong> glatten ER<br />
• Leber<br />
– Phospholipidsynthese<br />
– Synthese von anderen Lipiden<br />
– (Prostaglandine etc. (auch in Prostata, Uterus))<br />
– Lipoproteinpartikelsynthese (LDL)<br />
– Glykogensynthese<br />
– Detoxifizierungen (Cytochrome P 450 )<br />
• Muskel<br />
– Speicherung von Ca 2+<br />
– (Sarkoplasmatisches Retikulum)<br />
• Nebennierenrinde<br />
– Steroidhormonsynthese (Cytochrome P 450 )<br />
⇒ verschiedene Sexualhormone
<strong>Funktionen</strong> <strong>des</strong> <strong>RER</strong><br />
• Einschleusung von Proteinen für<br />
– <strong>RER</strong> und SER<br />
– Golgi-Apparat<br />
– Lysosomen<br />
– Endosomen<br />
– Plasmamembran<br />
– Sekretproteinen<br />
Secretory proteins<br />
– NICHT:<br />
– Mitochondrien<br />
– Peroxisomen<br />
– Zellkern
<strong>Funktionen</strong> <strong>des</strong> <strong>RER</strong><br />
• Einschleusung von Proteinen<br />
Signalhypothese (Blobel, 1975) „Unterschied“ freie /<br />
ER-gebundene Ribosomen<br />
Signalsequenz
Mechanismus der Einschleusung von Proteinen ins <strong>RER</strong><br />
• Wie kommt ein hydrophiles Protein<br />
über eine hydrophobe Lipiddoppelschicht ?<br />
Signalsequenz<br />
„signal recognition<br />
particle“ (SRP)<br />
Synthese und Translokation eines<br />
Sekretproteins (z.B. Insulin, Immunglobulin)
<strong>Funktionen</strong> <strong>des</strong> <strong>RER</strong><br />
• „Signal recognition particle“<br />
(SRP)<br />
SRP9<br />
SRP14<br />
Elongationsarrest<br />
– 1 RNA<br />
– 6 Proteine<br />
SRP72<br />
– SRP54 als zentrale<br />
Komponente<br />
• Signalsequenz<br />
+ + hydrophob<br />
5-20 As. 7-12 As. 10-20 As.<br />
SRP54<br />
Signalsequenzerkennung<br />
GTP-Hydrolyse<br />
SRP68<br />
SRP19<br />
Fertiges Protein<br />
Signalpeptidase
Strukturelle Grundlage der SRP Bindung ans Ribosom<br />
• Wie kann man Translationsarrest verstehen ?<br />
Gekrümmte Konformation<br />
wird stabilisiert
<strong>Funktionen</strong> <strong>des</strong> <strong>RER</strong><br />
• Einschleusung von Membranproteinen ins <strong>RER</strong><br />
Synthese und Translokation<br />
eines Plasmamembranproteins<br />
z.B. Cadherin, Glykophorin
Einschleusung von Proteinen ins <strong>RER</strong><br />
Topogene Informationen bestimmen Lokalisation<br />
Signalsequenz<br />
→ Lumen<br />
Signals. + Stop-transfer Anker Sequenz → Membran Typ I (N in<br />
)<br />
Signal-Anker Sequenz → Membran Typ II (N out<br />
)<br />
3D Rekonstruktion <strong>des</strong><br />
<strong>RER</strong>-gebundenen Ribosoms<br />
(Größenverhältnisse!)<br />
Film<br />
ER-translocation
Molekulare Funktionsweise eines Translokons<br />
• Wie sieht der Translokationskomplex aus? Cryo-EM Daten<br />
Sichtbarmachung der translozierenden<br />
Polypeptidkette<br />
Konserviert von Hefe bis Mensch
Struktur der Translokationspore<br />
• Wie sieht das Translokon (Sec61) aus?<br />
Bakterielles SecY als Modell:<br />
• 10 α-Helices<br />
Wie bleibt Membran Ionen-dicht?? Stopfen (Plug)<br />
Pdb.Sec61 translocon (+SecY.pse)<br />
© T. Rapoport
<strong>Funktionen</strong> <strong>des</strong> <strong>RER</strong><br />
• Einschleusung von Proteinen ins <strong>RER</strong><br />
• N-Glykosylierung (Dolichol)<br />
• Trimmen der Oligosaccharidreste<br />
Oligosaccharyltransferase
<strong>Funktionen</strong> <strong>des</strong> <strong>RER</strong><br />
• Proteinfaltung und Bildung von Komplexen<br />
(Chaperone, z.B. Hsp70 = BiP)<br />
• Proteine haben Faltungsanleitung in Primärstruktur (Aminosäuresequenz)<br />
• Viele Proteine falten sich spontan korrekt (trotz Mrd. Möglichkeiten der<br />
Strukturbildung), Anfinsen Nobelpreis<br />
• Was passiert häufig ohne Chaperone?<br />
Faltung<br />
(kein aggregiertes Protein)<br />
Aggregation<br />
plus<br />
Chaperon<br />
minus<br />
Chaperon<br />
Huntington disease, Alzheimer,<br />
Parkinson, Creutzfeld-Jacob
<strong>Funktionen</strong> <strong>des</strong> <strong>RER</strong><br />
• Proteinfaltung und Bildung von Komplexen<br />
Mechanismus:<br />
=Hsp70<br />
Ungefaltet Nativ gefaltet<br />
– Bindung von Chaperonen an ungefaltete (hydrophobe)<br />
Proteinregionen<br />
– Dadurch niedrige Konzentration an freien, ungefalteten Proteinen<br />
– Geringere Aggregation entfalteter (klebriger) Proteine und mehr<br />
Zeit zur Faltung<br />
• Disulfidbrückenbildung (-S-S-)<br />
(Proteindisulfidisomerase, Ero1)<br />
Stabilisierung der Proteine<br />
WICHTIG für Sekretproteine (z.B. Antikörper), Insulin
<strong>Funktionen</strong> <strong>des</strong> <strong>RER</strong><br />
• "Quality control“<br />
(Kein Verlassen <strong>des</strong> ER ohne korrekte Faltung/Assemblierung)<br />
– WICHTIG bei Mucoviscidose = Cystische Fibrose<br />
Faltung und Assemblierung von Haemagglutinin (Influenza-Virus)<br />
1. Faltung<br />
BiP<br />
Calnexin<br />
Calreticulin<br />
2. S-S<br />
Brücken<br />
3. Assemblierung<br />
Prozesse wichtig bei biotechnologischer Produktion von<br />
– Erythropoietin (Proliferation von Blutzellen; Doping)<br />
– Plasminogen-Aktivator (Antigerinnungsfaktor bei Herzinfarkt)<br />
– Insulin (Diabetes)
Die Idee <strong>des</strong> vesikulären Transports<br />
Ein über Vesikel<br />
verbundenes<br />
Endomembransystem<br />
• Endoplasmatisches<br />
Retikulum<br />
• Golgi Apparat<br />
• Sekretorische Vesikel<br />
• Plasmamembran<br />
• Lysosomen<br />
• Endosomen<br />
Konstitutive Sekretion (alle Zellen)<br />
Regulierte Sekretion (Drüsen)<br />
Anterograder und retrograder Transport<br />
NICHT verbunden: Mitochondrien<br />
Peroxisomen<br />
Zellkern<br />
Membrantransport von Proteinen
Pulse-chase<br />
Radiomarkierung<br />
+<br />
Elektronenmikroskopische<br />
Autoradiographie<br />
(G. Palade)<br />
• Radiomarkierung mit<br />
3<br />
H Leucin für 3 min ⇒ A<br />
• „Chase“ mit kaltem Leucin<br />
C<br />
A<br />
D<br />
B<br />
♦<br />
♦<br />
7 min Inkubation⇒ B<br />
37 min Inkubation⇒ C<br />
♦ 117 min Inkubation⇒ D<br />
• EM und Autoradiographie
Vesikulärer Transport - Wie funktioniert das?<br />
• Prinzip <strong>des</strong> Vesikeltransports<br />
– 1. Vesicle budding (Fission, Knospen)<br />
– 2. Vesicle Transport (Zytoskelett Tubulin und Aktin)<br />
– 3. Fusion mit Zielmembran<br />
– 4. Membranorientierung (Asymmetrie, z.B Zuckerketten)<br />
1.<br />
-Z<br />
-Z<br />
2. 3.<br />
-Z<br />
-Z
Vesikulärer Transport - Wie funktioniert das?<br />
• Prinzip <strong>des</strong> Vesikeltransports<br />
– 1. Vesicle budding (Fission, Knospen)<br />
– 2. Vesicle Transport (Zytoskelett Tubulin und Aktin)<br />
– 3. Fusion mit Zielmembran<br />
– 4. Membranorientierung (Asymmetrie, z.B Zuckerketten)<br />
1.<br />
-Z<br />
-Z<br />
2. 3.<br />
-Z<br />
-Z<br />
Plasmamembran (Zucker extrazellulär)
Vesikulärer Transport - Wie kann man das verfolgen?<br />
Live cell imaging mit Fluoreszenzmikroskopie<br />
v17-04-Golgi_sorting_a.avi<br />
v17-04-Golgi_sorting_b.avi
Film als Übersicht<br />
Secretion
Wie erfolgt das vesicle budding ???<br />
oder<br />
Vor dem Weggehen einen Mantel anziehen<br />
• Verschiedene coats für verschiedene Membranen
Vesikulärer Transport - Das Clathrin coat<br />
• „Coat“-abhängiges budding, z.B. mit Clathrin Bindung<br />
dadurch Krümmung der Membran<br />
Clathrin<br />
Coated pit<br />
(Stachelsaumgrübchen)<br />
Coated vesicle<br />
(Stachelsaumvesikel)<br />
Dann rasches Uncoating (Coat-ablösung)
Starke Ähnlichkeiten zwischen<br />
Clathrin Coats und COP II Coats<br />
Verschiedene COP II<br />
Strukturen im EM<br />
Vergleich: COP II Clathrin coat
Vesikulärer Transport - Wie wird Sortierung erreicht?<br />
• Proteine enthalten spezifische Signale für Wirkort<br />
• Je<strong>des</strong> Vesikel wird spezifisch mit Proteinen bestückt<br />
• Unterschiedlich für anterograden und retrograden Transport<br />
• Komplizierte „Sorting machinery“<br />
Bsp: KDEL-Rezeptor, Rückholmechanismen, SNAREs<br />
Prä<br />
Lösliches ER Protein<br />
KDEL<br />
• KDEL:<br />
K = Lys<br />
D = Asp<br />
E = Glu<br />
L = Leu
Das V- und T-SNARE Konzept<br />
oder<br />
Wie wird der Vesikeltransport spezifisch?<br />
V-SNARE<br />
T-SNARE<br />
Vesikel<br />
Target
SNAREs als Ziele der Botulinum- and Tetanustoxine<br />
• Toxine sind<br />
– aus verschiedenen Bakterien (Clostridien)<br />
– extrem giftig (
• 1898 Camillo Golgi (Padua)<br />
– Apparato reticolare interno<br />
(Metallfärbung - OsO 4 )<br />
Der Golgi-Apparat<br />
– Nobelpreis 1906 mit Ramon y Cajal<br />
• Bis in 50 er Jahre Kontroverse:<br />
Golgi App.: Organell oder Artefakt??<br />
• ≈ 1950 EM Daten:<br />
Golgi Strukturen in allen Zellen<br />
vor allem in sekretorischen Zellen<br />
(Schleimbildende Zellen)<br />
– Ausgeprägt in Pflanzen Zellen<br />
– Dictyosomen
Der Golgi-Apparat – zentral im sekretorischen Weg<br />
Golgi-Subkompartimente: CGN - cis - medial - trans - TGN
Der Golgi-Apparat - Morphologie<br />
EM-Techniken
Der Golgi-Apparat<br />
• Golgi Kompartimente: CGN - cis - medial - trans - TGN<br />
– Versch. Färbemethoden (z.B. Immuno-Gold EM,<br />
Histochemische Färbungen<br />
Trans<br />
(Nukleosid-<br />
Diphosphatase)<br />
Cis (OsO 4 )<br />
Golgi!<br />
TGN<br />
(Saure<br />
Phosphatase)
<strong>Funktionen</strong> <strong>des</strong> Golgi-Apparates<br />
• O-Glykosylierung<br />
(Ser, Thr, Hydroxylysin)<br />
• Komplexe Modifikation<br />
der N-Glykosyl-<br />
Oligosaccharidreste
<strong>Funktionen</strong> <strong>des</strong> Golgi-Apparates<br />
• O-Glykosylierung (Ser, Thr, Hyl)<br />
• Komplexe Modifikation der N-Glykosyl-Oligosaccharidreste<br />
• Sulfatierung der Zuckerreste<br />
(Aufbau Extrazelluläre Matrix, Schleimbildung)<br />
Glucosaminoglykane, Hyaluronsäure
<strong>Funktionen</strong> <strong>des</strong> Golgi-Apparates<br />
• Synthese von Glykolipiden (Sphingolipide, Ganglioside)<br />
– Bedeutung der Zucker für Blutgruppe (wirken als Antigene)
<strong>Funktionen</strong> <strong>des</strong> Golgi-Apparates<br />
• Proteinspaltungen (im TGN und später<br />
in sekretorischen Vesikeln):<br />
Spezifische Proteasen spalten ...<br />
– Proinsulin Insulin (Hyperproinsulinämie)<br />
– Neuropeptide<br />
– virale Proteine<br />
– Hormone<br />
Condensing<br />
vacuole<br />
Secretory<br />
granula<br />
α-Proinsulin<br />
α-Insulin<br />
In kondensierenden Vakuolen In sekretorischen Granula
Rolle <strong>des</strong> TGN bei der Sortierung von Proteinen<br />
• Regulierte Sekretion (Pankreas, andere Drüsen, Neuronen)<br />
(Kondensierende Vakuolen, Zymogengranula, Sekretorische Granula)<br />
Aktivierung von Proteasen, Hormonen, Neuropeptiden<br />
SG<br />
CV =<br />
kondensierende SG =<br />
Vakuolen sekretorische<br />
Granula
Rolle <strong>des</strong> TGN bei der Proteinsortierung - 4 Wege<br />
• Regulierte Sekretion<br />
(Exozytose)<br />
• Konstitutive Sekretion<br />
(Exozytose, sekretorische Vesikel)<br />
Exozytose<br />
• Lysosomen - Endosomen<br />
• Retrograder Transport
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