Biochemie Praktikum I

Biochemie Praktikum I 

Biologen / Bachelor 

SS 2012

Praktikumsskript Biochemie für Biologen-Bachelor SS2012 

Institut für Biochemie, PD. Dr. Wolfgang Hilt, 18. Januar 2012


Sicherheitsinstruktionen 

Sicherheitsinstruktionen 

Allgemeine Sicherheit 

Informieren Sie sich bei Praktikumsbeginn über die Sicherheitseinrichtungen im 

Praktikumslabor: Feuerlöscher, Brandmelder, Brandduschen, Augenduschen, 

Not-Aus-Schalter, Erster Hilfe Kasten, Fluchtwege (siehe mündliche Instruktion) 

Ein Übersichtsplan und Notfallalarmplan befindet sich beim Telefon 

Bei Alarm das Gebäude auf dem kürzesten Weg umgehend verlassen 

Bei Brand oder Unfall im Praktikumsraum: Treffpunkt am Audimax gegenüber (wie in 

der mündlichen Belehrung besprochen) 

Tragen Sie im Labor Schutzkleidung 

Labormantel, flache Schuhe; bei Bedarf: Schutzbrille, Handschuhe 

Im Praktikumslabor ist Essen, Trinken, Rauchen verboten 

Mit dem Mund Pipettieren ist grundsätzlich verboten 

Gefährliche oder toxische Stoffe 

Beachten Sie die Hinweise im Skript 

Folgen Sie den Hinweisen / Anweisungen der Assistenten 

Gentechnische Arbeiten 

Wir führen gentechnische Arbeiten der niedrigsten Sicherheitsstufe durch 

Einzelheiten in der Betriebsanweisung S1 Labor 

gentechnisch veränderte Organismen werden gesammelt und vor der 

Entsorgung autoklaviert. 

Unfälle und Notfälle müssen sofort gemeldet werden 

bei Assistenten vor Ort sowie bei: 

Dr. Wolfgang Hilt 0711 685 64388 oder 

Dr. Hans Rudolph 0711 865 64389 

Verhalten Sie sich generell umsichtig!


Sicherheitsinstruktionen


Programm 

PROGRAMM 

Tag Gruppe A Gruppe B 

1 SDS-Gelelektrophorese LDH-Aktivität, Proteinkonzentration 

2 PAGE & Blotten Michaelis-Menten-Kinetik 

3 Western-Blot > Entwicklung 

DNA-Elektrophorese 

SDS-Gelelektrophorese 

4 LDH-Aktivität, Proteinkonzentration PAGE & Blotten 

5 Michaelis-Menten-Kinetik Western-Blot > Entwicklung 

DNA-Elektrophorese


Inhaltsverzeichnis 

Enzyme: Aktivität und Stabilität 7 

LDH-Aktivitätstest 10 

Proteinbestimmung (Bradford) 13 

Enyzmkinetik (Michaelis-Menten) 16 

Elektrophorese / Biosynthese von CPY 22 

Herstellung Proteinrohextrakt (TCA-Fällung) 23 

SDS-Elektrophorese 24 

Immunoblotting (Western-Blot) 30 

Restriktionsverdau, DNA-Elektrophorese 33

Enzyme: Aktivität und Stabilität 

Basiswissen: Proteine, Struktur, Enzymaktivität 


LDH-Test / Proteinbestimmung 

Proteine sind die wichtigsten Funktionseinheiten der lebenden Zelle. Sie sind aus 

Aminosäuren aufgebaut, die über Peptidbindungen zu Ketten verknüpft sind. Die 

Peptidketten haben üblicherweise Längen von mindestens 50 bis über mehrere hundert 

Aminosäuren. Für den Aufbau von Proteinen werden in der Zelle 20 verschiedene 

Aminosäuren verwendet. Diese besitzen Seitenketten unterschiedlicher Eigenschaft (sauer, 

basisch, polar, hydrophob, aromatisch). Die Abfolge der Aminosäuren in einem Protein 

(Primärstruktur) ist über die genetische Information genau definiert. Im wässrigen Medium 

falten sich die Peptiketten im Verlauf ihrer Synthese in definierte Strukturen. Kürzere 

Abschnitte nehmen dabei entweder schraubenartige Strukturen (α-Helices) oder gestreckte, 

übereinander geschichtete Strukturen (β-Faltblätter) ein (Sekundärstrukturen). Diese ordnen 

sich (zur Erreichung eines Energieminimums) in eine genau definierte 3D-Struktur 

(Tertiärstruktur). Hydrophobe Bereiche werden dazu im Kern des Proteins verborgen, polare 

und geladene Gruppen sind in Richtung Lösungsmittel exponiert und vermitteln Bindungen 

zu den Wassermolekülen. Ionische Bindungen, van-der-Waals-Kräfte und H- 

Brückenbindungen - in besonderen Fällen auch kovalente Bindungen - innerhalb der 

Peptidkette stabilisieren zusätzlich die native Struktur des Proteins. Korrekt gefaltete 

Proteinketten können sich zu Komplexen aus mehreren (auch unterschiedlichen) 

Untereinheiten zusammenlagern (Quartärstruktur). Proteine erfüllen nur in der korrekten 

Nativstruktur ihre biologischen Aufgaben / Aktivität. 

Abb. 1: Lactatdehydrogenase aus Skelettmuskeln 

Proteine sind relativ labil. Unter bestimmten Bedingungen (z.B. extreme pH-Werte, erhöhte 

Temperaturen, Detergenzien, hydrophobe Lösungsmittel, mechanische Kräfte) kann die 

native Struktur zerstört werden. Die Peptidketten entfalten dann zu Zufallsstrukturen; die 

biologische Funktion / Aktivität geht verloren. Zumeist verlieren die entfalteten Moleküle 

zusätzlich ihre Löslichkeit, bilden Bindungen zu anderen Peptidmolekülen und damit 

Aggregate, die aus der wässrigen Phase ausfallen. Organismen die in relativ lebensfeindlicher 

7



Umgebung existieren (zum Beispiel thermophile Bakterien) sind aber durchaus in der Lage 

Proteine zu synthetisieren, die auch unter solch extremen Bedingungen ihre Struktur und 

damit biologische Aktivität bewahren. 

Viele Proteine, so genannte Enzyme 1 , wirken in der Zelle als hocheffiziente Biokatalysatoren. 

Diese beschleunigen (bio)-chemische Reaktionen 2 und ermöglichen so die Umsetzung von 

Stoffen unter den milden Temperaturbedingungen des Lebens. Enzyme enthalten zusätzlich 

zur Pepidkette oft Cofaktoren. Diese sind für den Katalysemechanismus wichtig. Cofaktoren 

sind oft komplexe organische Moleküle oder Metallionen (z.B. Mg 2+ , Ca 2+ , Mn 2+ , Fe 2+ , Zn 2+ , 

Co 2+ ). Sind Cofaktoren fest an das Enzym gebunden spricht man von prostethischen Gruppen, 

transient bindende Cofaktoren nennt man Coenzyme. Enzyme sind wichtig für den 

chemischen Stoffwechsel der Zelle (Metabolismus), haben aber auch eine zentrale Bedeutung 

in der Regulation zellulärer Prozesse. 

Im vorliegenden Versuch sollen Enzymreaktionen am Beispiel der Lactatdehydrogenase 

(LDH) untersucht werden. 

Biowissen: Physiologische Bedeutung der Lactatdehydrogenase 

Lactatdehydrogenase (LDH) ist ein wichtiges Enzym des Energiestoffwechsels der Zelle. Die 

Zelle gewinnt Energie 3 durch Spaltung von Glucose 4 zu Pyruvat 5 , der sogenannten Glykolyse 

(siehe Abb. 2). In einem Zwischenschritt dieses metabolischen Weges wird Gycerinaldehyd- 

3-Phosphat oxidiert. Dazu werden Reduktionsäquivalente (in Form von negativ geladenem 

Wasserstoff H - (Proton + 2 Elektronen) auf das Coenzym NAD + übertragen und dieses zu 

NADH reduziert. Unter aeroben Bedingungen (Vorhandensein von O 2 ) werden diese 

Redoxäquivalente im Citratzyklus und der Atmungskette regeneriert. Unter anaeroben 

Bedingungen ist dies so nicht möglich. Um dennoch ein Zusammenbrechen der Reaktion 

durch vollständigen Verbrauch der in der Zelle nur begrenzt vorhandenen NAD + -Moleküle zu 

verhindern, wird NAD + durch Oxidation regeneriert. Die Reduktionsäquivalente werden dazu 

durch das Enzym LDH auf Pyruvat übertragen und dieses zu Lactat 6 reduziert. 

Dieser Fall tritt beim Menschen bei kurzzeitiger Überlastung der Skelettmuskeln zum 

Beispiel beim Sport ein. Bei Sauerstoffmangel gewinnen die Muskelzellen weiter ATP durch 

Glykolyse und produzieren über den oben beschriebenen Mechanismus als Endprodukt 

Lactat. Der Milchsäurespiegel steigt an (der Athlet übersäuert). Die Bildung von Milchsäure 

in Reaktion auf Muskelbeanspruchung dient deshalb in der Sportmedizin als Maß der 

Belastung bzw. Belastbarkeit. In der Regenerationsphase wird Lactat mit Hilfe der LDH in 

der Leber zu Pyruvat oxidiert, welches dann in den aeroben Energiestoffwechsel 

eingeschleust und "verbrannt" werden kann 7 . 

Bestimmte (fakultativ anaerobe) Mikroorganismen, z.B. Milchsäurebakterien setzen die 

LDH-Reaktion zur ständigen Energiegewinnung unter Sauerstoffmangel ein; diesen Prozess 

nennt man Milchsäuregärung. Hefen haben eine alternativen Weg entwickelt: Sie reduzieren 

Pyruvat unter Abspaltung von CO 2 zu Ethanol (alkoholische Gärung) 8 . 

1 εν ζψµe (en zyme): in Hefe (Wilhelm Kühne,1876) 

2 um mindestens den Faktor 10 6 

3 gespeichert in Form von ATP-Molekülen 

4 Traubenzucker 

5 Brenztraubensäure 

6 Milchsäure 

7 vollständiger Abbau zu CO 2 und Reduktionsäquivalenten, letztere werden in der Atmungskette der Mitochondrien unter 

Reduktion von O 2 zu H 2 O zur Synthese von ATP-Molekülen verwendet. 

8 Beide Mechanismen sind von zentraler Bedeutung in bestimmten "biotechnologischen" Prozessen der 

Nahrungsmittelbereitung: Milchsäuregärung: Joghurt, Sauermilch, Käse, Sauerkraut, 

Alkoholische Gärung: Wein, Bier, Spirituosen, Backen 

8



Abb 2: Glykolyse 

9



Versuchsdurchführung: Lactatdehydrogenase (LDH)-Enzymaktivitätstest 

Folgende LDH katalysierte Reaktion liegt dem Test zugrunde (vgl. Stryer, Biochemie): 

Pyruvat +NADH + H + ⇔ Lactat + NAD + 

LDH 

Den Verlauf dieser Reaktion kann man mit Hilfe eines Photometers anhand der Oxidation von 

NADH zu NAD + verfolgen. Bei 366 nm absorbiert nur NADH. 

Abb. 3. Struktur von NAD + und NAD + /NADH Redoxreaktion 

Die Geschwindigkeit der Reaktion - d.h. die zeitliche Änderung der Konzentration eines 

Reaktionsteilnehmers (Substrat) im Verlauf der Reaktion – kann anhand der Änderung der 

Extinktion gemessen werden. Die Extinktion (optische Auslöschung eines Lichtsignals durch 

Absorption von Lichtquanten an Molekülen) ist proportional zur Konzentration der 

absorbierenden Moleküle. E ist also ein Maß für die Konzentration (c) des verfolgten Stoffes 

(Lambert-Beersches Gesetz): 

E = -log I 1 / I 0 = ε ⋅ d ⋅ c (1) 

I 0 : Intensität des eingestrahlten Lichts 

I 1 : Intensität des austretenden Lichts 

c: Konzentration des absorbierenden Stoffes 

d: Schichtdicke der Lösung 

ε: Absorptionskoeffizient 

Aus der Steigung der erhaltenen Messkurve kann man die Geschwindigkeit (v) der Abnahme 

der NADH Konzentration errechnen. Diese ist ein direktes Maß für die vorhandene 

10



Enzymmenge und wir in der Enzymologie deshalb auch als Volumenaktivität (A V) 

bezeichnet. 

Durch Auflösen von (1) nach c erhält man 

E 

c = ––––– 

ε ⋅ d 

daraus folgt für die Reaktionsgeschwindigkeit (dc/dt) 

∆c ∆E 

v = A V = ––– = –––––– (2) 

∆t ∆t ⋅ ε ⋅ d 

v : Reaktionsgeschwindigkeit 

Av: Enzymaktivität (in der Küvette [1 µmol Substratumsatz / (min ⋅ ml) = U (unit) / ml] 

∆E : Extinktionsänderung (2 cm = 0,1 bei 100mV, 2 cm = 0,01 bei 10mV) 

∆t : Zeitänderung [min] 

ε 366nm : 3,3 ml / (µmol ⋅ cm) 

d : Lichtweg durch Küvette (1 cm) 

Da uns eigentlich die Enzymaktivität in der Probe (nicht in der Messküvette interessiert) muss 

die Verdünnung mit einberechnet werden. Gleichung (2) erweitert sich zu: 

∆E V T 

A V = ––––––– 

∆t ε ⋅ d 

–––– 

V P 

V T : Testvolumen (1000 µl) 

V P : Probenvolumen (20 µl) 

Quotient entspricht dem Verdünnungsfaktor 

Durchführung des LDH-Aktivitätstests 

Das Spektrometer wird im abs-Modus (absorbance (engl)= Extinktion 9 ) betrieben. Vor 

Beginn der Messung wird das Spektrometer und der angeschlossene Schreiber mit dem 

Nullwert geeicht (set reference am Photometer + Schreiber auf Nulllinie; Eingangsspannung 

10 mV: Papierbreite entspricht einer Extinktionseinheit). Der Maximalausschlag des 

Schreibers (Startposition zu Beginn der Reaktion) wird mit dem Maximalwert festgelegt. 

Zur Messung wird folgender Testansatz verwendet: 

67 mM Phosphatpuffer pH 7.2 940 µl 

Pyruvatlösg. (2,75 mg / ml) 

20 µl 

NADH-Lösg. (11 mg / ml) 

20 µl 

Probenlösung (LDH) 20 µl 

Zur Herstellung der Pyruvatlösung ca. 1 mg einwiegen und mit der zum Erreichen der 

geforderten Konzentration notwendigen Menge Puffer auffüllen. 

Zur Herstellung der NADH-Lösung ca. 4 mg einwiegen und mit der zum Erreichen der 

geforderten Konzentration notwendigen Menge Puffer auffüllen. 

9 unterscheide dazu: absorption (engl) = Absorption 

11



Um Pipettierfehler möglichst gering zu halten kann für den Testansatz folgende Lösung (Mix) 

vorbereitet werden (bei RT aufbewahren!): 

Versuchsdurchführung: 

67 mM Phosphatpuffer pH 7.2 9.4 ml 

Pyruvatlösg. (2,75 mg / ml) 

200 µl 

NADH-Lösg. (11 mg / ml) 200 µl 

LDH aus Schweinherzmuskel so verdünnen 10 , dass die Ausgangslösung eine 

Volumenaktivität von ca. 2 – 4 U/ml (ΔE/min = 0,13 – 0,26) hat. 

Die Reaktion wird mit der Zugabe der LDH-Probenlösung gestartet. Dafür werden in die 

Küvette 980 µl Testlösung vorgelegt und 20 µl LDH-Probenlösung dazu pipettiert. Die 

Küvette mit Parafilm abdichten, mischen, zum Entfernen von Luftbläschen einige Male auf 

den Tisch klopfen ins Photometer stellen und sofort mit Hilfe des Schreibers die Abnahme der 

Extinktion verfolgen. 

Es werden mehrere Tests (>3) zur Messung der Volumenaktivität in der Ausgangslösung 

durchgeführt. Dazu wird ΔE/min ermittelt und die Volumenaktivität errechnet 11 . 

10 wird in kristalliner Form als Suspension in Ammoniumsulfat gelagert. 

Herstellung der Testlösung: 400 µl Suspension 10 min bei 13 000 Rpm zentrifugieren, Niederschlag in 200 µl 

Phosphatpuffer aufnehmen und zum Erreichen der geforderten Volumenaktivität verdünnnen. 

11 die Vorgehensweise beim Test sollte danach verinnerlicht sein. Abweichungen in der Messwerte sollte < 10% sein. 

12



Bestimmung der Proteinkonzentration (Gesamtprotein) nach Bradford 

Neben der Proteinbestimmung nach der Biuret-, bzw. der Lowry-Methode stellt die 

Bestimmung der Proteinkonzentration nach Bradford eine geeignete Möglichkeit dar, auch 

sehr kleine Proteinkonzentrationen (10-100 µg/ml) zu ermitteln. Zur Messung der 

Proteinkonzentration werden Proteinlösungen mit dem blauen Farbstoff Coomassie Brillant 

Blue R250 versetzt. Die Farbstoffmoleküle binden adsorptiv an die Proteinmoleküle; dadurch 

tritt eine Verschiebung des Absorptionsmaximum nach 595 nm auf (vgl. Lottspeich, 

Bioanalytik). Diese wird anhand von Extinkitionsmessungen ermittelt und daraus die 

Proteinkonzentration bestimmt: 

SO 3 Na 

H 3 C 

N 

HN CH 3 

H 3 C 

CH 3 

O CH 3 

N + 

SO 

- 3 

Abb. 3: Coomassie Brillant Blue R 250 

Gegenüber anderen Proteinbestimmungen hat die Bradford -Methode folgende Vorteile: 

- hohe Empfindlichkeit Proteinkonzentration im Test 1-10 µg (Biuret ca 100 µg) 

- kurze Reaktionszeit (ca. 2 min) 

- geringe Störanfälligkeit: keine Beeinflussung des Testergebnisses durch K + -, Mg 2+ - 

Ionen, EDTA, TRIS, Thiolreagentien und Kohlenhydrate 

Versuchsdurchführung 

Erstellen einer Eichgerade 

Um die ermittelten Extinktionswerte einer Proteinkonzentration c zuweisen zu können, muß 

eine Eichgerade erstellt werden. Eine Verdünnungsreihe mit Rinderserumalbumin (BSA) 

ansteigender Konzentration (10 – 100 µg/ml) wird zur Verfügung gestellt. 

Von den Verdünnungen werden nun jeweils 100µl zu 1 ml Bradford-Stammlösung (vorgelegt 

in Küvetten) gegeben (Verdünnungsfaktor 1 : 11). Die Küvetten mit Parafilm abdichten, gut 

vermischen, 10 min inkubieren und anschließend messen 

13



Gemessen wird bei 595 nm. Vor Beginn der Messung wird das Spektrometer mit 1 ml 

Bradford-Stammlösung + 100 µl H 2 O auf Null gestellt (Extinktion der Negativkontrolle 

entspricht dem Nullwert). 

Durch Auftragen der bekannten Proteinkonzentrationen gegen die zugehörigen 

Extinktionswerte erhält man eine Eichgerade. 

Proteinverdünnungen zur Ermittlung der Eichgerade (2 mal unabhängig voneinander ansetzen 

und messen): 

Konz. c [µg/ml] 

Eichlösungen 

Extinktion 

1. Messung 

Extinktion 

2. Messung 

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 

Auswertung: 

Erstellen der Eichgeraden auf Millimeterpapier: 

Extinktion 

Konzentration [ µg / ml ] 

Messung der Proteinkonzentration der LDH-Lösung / spezifische Aktivität 

Messung der Proteinkonzentratoin der LDH-Lösung mit Hilfe der Bradford-Methode. LDH- 

Probe so vorverdünnen, dass die Extinktion im Bereich der Eichkurve liegt. Extinktion 

bestimmen; Konzentration aus der Eichgerade ablesen. 

Aus der Volumenaktivität (VA; [U/ml]) und Proteinkonzentration (PK [mg/ml]) kann die 

spezifische Aktivität der Enzymlösung ermittelt werden. 

VA : PK = SA [U/mg] 12 

diese kann ein Maß für den Reinheitsgrad des Enzyms sein 

Bei bekanntem MW 13 kann die Proteinkonzentration in µmol/ml umgerechnet werden. Bei 

Bildung des Quotienten erhält man die Umsatzzahl: 

K cat = VA[µmol/(ml • s) : PK [µmol/ml]; 

[µmol • ml / µmol • ml • s] = [1/s] 

K cat gibt an wie viele Substratmoleküle ein Enzymmoleküle in der Sekunde umsetzt 

12 entsprechende Rechnungen wurden in den Übungen zur Biochemie I Vorlesung durchgeführt 

13 LDH: 135 000 Da 

14



Fragen zur Überprüfung ihres Wissensstandes / zum Nachdenken 

Wie sind Proteine aufgebaut? 

Was ist wichtig für die biologische Funktion von Proteinen? 

Was ist ein Enzym? 

Welche Bedingungen sind von Bedeutung für die Stabilität eines Proteins? 

Wie kann man die Änderung der Konzentration eines Substratmoleküls und damit die 

Reaktionsgeschwindigkeit messen? 

Welche Geräte werden dafür benötigt? 

Ist K cat ein Maß für die Effektivität eines Enzyms? 

15

Enzymkinetik: Michaelis-‐Menten-‐Kinetik 


Michaelis-Menten-Kinetik 

Die Abhängigkeit einer Enzym-‐katalysierten Umsetzung von der Substratkonzentration bei 

konstanter Enzymmenge ist in Abb. 1 dargestellt. Im Bereich niedriger 

Substratkonzentrationen zeigt sich eine nahezu lineare Beziehung. Bei höheren 

Konzentrationen nimmt die Reaktionsgeschwindigkeit nur noch langsam zu und nähert sich 

schließlich einem Grenzwert, der maximalen Geschwindigkeit v max . 

Abb.1. 

Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit von der Substratkonzentration 

MICHAELIS MENTEN KINETIK 

Die mathematische Beschreibung dieses Verhaltens erfolgt nach MICHAELIS und MENTEN. 

Dabei werden folgende Abkürzungen verwendet. 

E = Enzym C = Symbol für Konzentrationen 

S = Substrat k x = Geschwindigkeitskonstanten 

ES = Enzymsubstrat-‐Komplex 

P 

E t 

v 

= Produkt 

= Gesamte Enzymmenge 

= Reaktionsgeschwindigkeit 

KM = Michaelis-‐Konstante 

16



Für die Enzymreaktion wurde folgendes Modell aufgestellt: 

k 1 

k 2 

E + S ES E + P 

k -1 

k 2 = k cat = Wechselzahl 

Die Reaktionsgeschwindigkeit v zur Bildung des Produkts P ist gleich dem Produkt aus der 

Geschwindigkeitskonstanten k 2 und der Konzentration des Enzymsubstratkomplexes: 

v = k 2 ·∙ C ES 

(1) 

C ES kann folgendermaßen bestimmt werden: 

Die zeitliche Änderung der Konzentration des Enzymsubstratkomplexes ergibt sich aus seiner 

Bildungsgeschwindigkeit (1. Term der folgenden Gleichung) vermindert um die 

Geschwindigkeit des Zerfalls von ES (2.+3. Term): 

dC ES /dt = k 1 C E C S -‐ k -‐1C ES -‐ k 2 C ES 

(2) 

Kurze Zeit nach Beginn der Umsetzung erreicht die ES-‐Konzentration nach der "steady-‐state" 

Theorie von Briggs und Haldane einen konstanten Wert. Daraus folgt: 

dC ES /dt = 0 

Aus (2) folgt damit 

k 1 C E C S -‐ k -‐1 C ES -‐ k 2C ES = 0 

mit C E =C Et -‐C ES folgt 

k 1 (C Et -‐C ES )C S -‐ k -‐1C ES -‐ k 2 C ES = 0 

k 1 C Et C S -‐ k 1C ES C S -‐k -‐1C ES -‐ k 2 C ES = 0 

k 1 C Et C S = C ES (k 1C S + k -‐1 + k) 

17



Mit 

K M = k -1+k 2 

k 1 

unter Berücksichtigung von Gl. (1) folgt 

v= k 2 C ES = k 2C ET 

(1+K M /C S ) 

(3) 

Die maximale Reaktionsgeschwindigkeit wird erreicht wenn alle Enzymmoleküle als Enzym-‐ 

substratkomplex vorliegen, d.h. C ES =C Et 

Daraus folgt: v max = k 2 C Et in (3) 

Dies ist die so genannte MICHAELIS-‐MENTEN-‐Gleichung 

Durch Umformung ergibt sich auch 

Was lässt sich aus dieser Formel ableiten: 

1. Bei konstanter Enzymmenge ist v nur von der Substratkonzentration C S abhängig, da 

K M und v max Konstanten sind. 

2. Die Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit von der Substratkonzentration zeigt 

zwei charakteristische Bereiche: 

a) Ist C S sehr klein gegenüber K M so kann dieser Summand unter dem Bruchstrich 

der Michaelis-‐Menten Gleichung gegenüber K M vernachlässigt werden und es ergibt 

sich eine Geradengleichung mit der Steigung v max /K M 

18



b) Für sehr große Werte der Substratkonzentration geht kann K M gegenüber C S und 

man erhält: v = v max C S / C S 

Zur Auswertung von Messergebnissen wird meistens die Auftragung nach Lineweaver-‐Burk 

verwendet. Dazu wird die Michaelis-‐ Menten Gleichung wie folgt umgeformt: 

v= 

v max 

(1+K M /C S ) 

= v max 

K M +C S 

C S 

Der reziproke Ausdruck hiervon lautet: 

1 K M +C S K = M 1 1 

= + 

V v max C S v max C v S max 

Mit 1/v und 1/C S als Variable erhält man eine Gerade mit der Steigung K M /v max und dem 

Achsenabschnitt 1/v max. 

Das heißt: 

Trägt man gemessene Werte für 1/v über 1/C S auf, so kann man aus Steigung und 

Achsenabschnitt K M und v max ermitteln (siehe Abb. 2). 

Abb.2: Auftragung nach Lineweaver-‐Burk 

19



Versuchsdurchführung: 

Zur Ermittlung der MICHAELIS-‐MENTEN Kinetik der LDH für das Coenzym NADH/H + misst 

man die Enzymaktivität analog dem LDH-‐Test, allerdings mit unterschiedlicher NADH/H + -‐ 

Konzentration. 

Der Test wird in 1 ml Plastikküvetten am Eppendorf-‐Photometer bei 366 nm und 

Raumtemperatur durchgeführt. 

Die Testlösung enthält: 67 mM Phosphatpuffer pH 7.2 950 µl 

Pyruvatlösg (2.75 mg/ml) 

20 µl 

Enzymlösg. (25 µg/ml) 

10 µl 

NADH-‐Lösg. aus Verdünnungsreihe 

20 µl 

Stammlösung vorbereiten: 67 mM Phosphatpuffer pH 7.2 9.5 ml 

Pyruvatlösg (2.75 mg/ml) 

200 µl 

Enzymlösg. (25 µg/ml) 

100 µl 

Start der Reaktion durch Zugabe der NADH-‐Lösung. 

Verdünnungsreihe: 

NADH-‐Stammlösg: 15,5 mM (11 mg/ml) 

Verdünnungsfaktor: 1 2 4 8 10 20 30 40 

__________________________________________________________________________ 

Schreiberempfindlichkeit 

__________________________________________________________________________ 

NADH-‐Konz. [mM]: 

__________________________________________________________________________ 

NADH-‐Konz. im Test [mM]: 

__________________________________________________________________________ 

Reaktionsgeschw. V [U/ml]: 

Bestimmumg der Reaktionsgeschwindigkeit (d.h. Volumenaktivität) 

20



Extinktionskoeffizient: 3.3 l/(mmol⋅cm)= 3.3 ml/(µmol⋅cm) 

Schichtdicke d= 1 cm 

A V = 

∆E 

⋅ 

∆t 

V T ⋅ n 

ε ⋅ d ⋅ V P 

Achtung: Hier keine Verdünnung des Enzyms einberechnen, da für diesen Versuch die 

Aktivität in der Küvette relevant ist! 

Graphische Ermittlung von v max und K M : 

1. v in U/ml gegen Substratkonzentration C S in µmol/l auftragen 

2. Auftragung nach Lineweaver-‐Burk: d.h. 1/v gegen 1/C S 

K M = _________ 

v max = ___________ 

3. Ermittlung der katalytischen Konstante 

v max in Küvette (in U/ml=µmol/ml*min) 

K 2 = K cat = __________________________________________ 

Enzymkonzentration in Testküvette (µmol/ml) 

Molekulargewicht der LDH = 130 000 g / mol 

K cat 

= _________ 

Achtung: Überlegt Euch, ob sich alle Werte auf das gleiche Volumen beziehen! 

Die Auswertung findet im Praktikum statt. Die Michaelis-‐Menten -‐ und Lineweaver-‐Burk – 

Diagramme werden den Assistenten vorgelegt. 

21


Elektrophorese / CPY-Synthese 

Biosynthese von CPY 

Carboxypeptidase yscY (CPY) ist eine Exopeptidase, die in der Vakuole (entspricht dem 

Lysosom) der Hefe Saccharomyces cerevisiae lokalisiert ist. Es handelt sich um eine 

unspezifisch agierende Peptidase, welche ihre natürlichen Substrate, d.h. in die Vakuole 

eingeschleuste Proteine, vom Carboxy-Terminus her durch Spaltung von Peptidbindungen 

abbaut. Dabei spaltet sie bevorzugt hinter hydrophoben Aminosäuren. 

So lässt sich ihre Aktivität mit Hilfe synthetischer Peptidsubstrate, in denen z.B. an ein 

Phenylalanin oder ein Tyrosin carboxyterminal ein Chromophor gekoppelt ist, durch die 

Freisetzung dieser gefärbten Komponente verfolgen. Für die Spaltung des Substrats ist u. a. 

ein Serin-Rest im aktiven Zentrum des Enzyms erforderlich, die CPY wird deshalb zu den 

Serin-Peptidasen gerechnet. 

Die Carboxypeptidase yscY durchläuft nach ihrer Synthese einen Teil des sekretorischen 

Weges der Zelle (Endoplasmatisches Retikulum; Golgi-Apparat) und wird von dort in die 

Vakuole sortiert. Sie wird als ein höher-molekulares Vorläufermolekül (61 kDa) hergestellt, 

das nach seiner Modifizierung mit 4 Kohlenhydratketten im ER ein Molekulargewicht von 67 

kDa erreicht (p1-Form) und später durch weitere „outer-chain“-Mannosylierung im Golgi als 

69 kDa (p2)-Form vorliegt. In der Vakuole erfolgt die proteolytische Reifung zur aktiven 

Carboxypeptidase yscY mit einem Molekulargewicht von 61 kDa. 

Die proteolytische Reifung des Enzyms wird durch zwei weitere vakuoläre Peptidasen, 

Proteinase yscA und Proteinase yscB, katalysiert. Eine mutierte Form des Proteins, CPY*, 

wird im ER als falsch gefaltet erkannt und durch retrograden Transport aus dem ER hinaus 

dem Abbau durch das Proteasomen zugeführt. Für den Ablauf dieses Prozesses wird u. a. das 

Der3 Protein benötigt. 

In diesem Versuch sollen die verschiedenen Reifestadien der CPY mit Hilfe eines Immuno- 

Blots visualisert werden. Dazu werden Proteinextrakte von mutierten Hefestämmen 

verwendet. 

YWO 342 (WT); YWO 1527 (prc1-1 Δder3 Δdoa10); YWO 664 (Δpep4); YWO 636 

(Δprc1) 

22


Elektrophorese / TCA-Fällung 

TCA Fällung/ Herstellung eines Proteinrohextrakts 

Im folgenden Versuch soll ein Proteinextrakt von Hefezellen für die spätere Auftrennung in 

einer SDS-Elektrophorese (PAGE) hergestellt werden. 


Ca. 1,5 ml einer über Nacht gewachsenen Hefekultur werden in 1,5 ml Reaktionsgefäßen 

(Eppendorf Tubes) geerntet. Dazu wird die Flüssigkultur in das Tube überführt, 1min bei 

4000 rpm in der Tischzentrifuge zentrifugiert und der Überstand anschließend verworfen. 

Das Zellpellet wird nun in 300µl Kaliumphoshatpuffer (50mM K 2 PO 4 , pH 7,5) resuspendiert. 

Anschließend werden der Suspension 100µl 50%ige TCA (Trichloressigsäure) zugegeben und 

die Probe nochmals im Vortexer geschüttelt 1 . 

Durch die Zugabe von TCA wird den Proteinen u.a. die Wasserhülle entzogen: dies führt zur 

Denaturierung und Ausfällung der Proteine führt. 

Die Proben werden nun > 30 min bei -80°C inkubiert. 

Dieser Schritt wird benötigt um die Zellen aufzubrechen und die ausgefallenen Proteine 

freizusetzen, 

Nach der Inkubation werden die Proben bei 37°C im Thermoblock aufgetaut und die 

ausgefallenen Proteine in der Tischzentrifuge präzipitiert (8 min, 13 000 rpm). 

Der Überstand wird verworfen und das Pellet mit 500µl eiskaltem 80%igem Aceton 

gewaschen. Bei diesem Schritt ist es besonders wichtig jede Probe gut zu vortexen, damit das 

Pellet resuspendiert wird und ihm die verbliebene TCA und die Membranfette entzogen 

werden. 

Durch erneute Zentrifugation (8 min, 13 000 rpm) werden die ausgefallenen Proteine erneut 

pelletiert. Der Überstand wird vollständig mit der Vakuumpumpe abgenommen (! Mit der 

Spitze nicht zu nah an das Pellet kommen, da dieses sonst mit eingesaugt wird und die Probe 

verloren geht!). 

Das Pellet wird nun an der Luft getrocknet, bis kein Acetongeruch mehr vorhanden ist. 

Bei unvollständigem Trocknen löst sich das Pellet nur schlecht oder gar nicht. 

Das getrocknete Pellet wird in 80µl 1% SDS 0,1N NaOH aufgenommen. Nach 5 min 

Inkubation bei Raumtemperatur wird das Pellet durch vortexen resuspendiert. 

Der Lösung werden 20µl 5fach SDS-Probenpuffer zugesetzt und die Probe anschließend für 

5min bei 95°C inkubiert. Nach einem Zentrifugationsschritt (1 min, 13 000 rpm) ist die Probe 

für den Auftrag auf das SDS-Gel bereit. Alternativ kann sie bei -20°C gelagert werden. Vor 

dem Auftrag muss sie dann nochmals gekocht und nicht gelöste Anteile durch Zentrifugation 

abgetrennt werden. 

1 Laborjargon: Vortexen 

23


SDS-Elektrophorese 


Neben der Gelfiltration wird die Polyacrylamid-Gel-Electrophorese (PAGE) in SDS 

(Natriumdodecylsulfat) zur Molekulargewichtsbestimmung von Proteinen benutzt. Zur Trennung 

von Proteinen im Polyacrylamidgel wird einerseits der Siebeffekt des Gels, zum anderen die 

Ladung der Proteine ausgenutzt. Für die Molekulargewichtsbestimmung in der PAGE muss die 

unterschiedliche individuelle Ladung (stammt von den geladenen Aminosäureseitenketten des 

jeweiligen Proteins) der Proteine ausgeschaltet werden, damit die elektrophoretische Trennung 

allein von der Größe des Moleküls abhängt. Dies wird durch Verwendung des Detergens SDS 

erreicht. Durch Bindung von SDS werden Proteine: 

1. denaturiert, d.h. von der nativen Struktur zu einer frei beweglichen Kette 

entfaltet und 

2. durch Anlagerung des hydrophoben Teils des SDS an hydrophobe Bereich der Proteine 

wird dieses mit negativen Ladungen beladen, d.h. zu Polyanionen. 

+SDS 

natives Protein 

SDS-beladenes entfaltetes Protein 

SDS (Sodiumdodecylsulfate): Na + SO 4 - -CH 2 -(CH 2 ) 10 -CH 3 

Da Proteine mit Disulfidbrücken in der SDS-PAGE häufig ein anormales Verhalten zeigen, 

werden die Disulfidbrücken vor der Elektrophorese mit β-Mercaptoethanol reduziert. Die 

Vorinkubation mit SDS und Mercaptoethanol schafft die Vorrausetzung für die Molekulargewichtbestimmung 

im SDS-Gel, da jetzt die Beweglichkeit der Proteine nur eine Funktion der 

Größe des Moleküls darstellt. 

Für die Molekulargewichtsbestimmung wird die relative Beweglichkeit von Proteinen mit 

bekanntem Molekulargewicht in Bezug auf einen internen Standard (meist Bromphenolblau) 

verglichen und eine Eichkurve aufgestellt, indem der Logarithmus des Molekulargewichts gegen 

den Rf-Wert (relative Beweglichkeit) aufgetragen wird. Aus dem Rf Wert des unbekannten 

Proteins kann somit dessen Molekulargewicht ermittelt werden. 

24



Das Trennmedium 

Durch Polymerisation des monomeren Acrylsäureamids und eines quervernetzenden 

bifunktionellen Reagenzes, meist Bis-Acrylsäureamid, wird ein dreidimensionales Netzwerk 

aufgebaut. 

Stryer, Biochemistry, Fifth Edition, 2002 

Die Porengröße ist in einem weiten Bereich variabel: Die Polyacrylamidkonzentration kann in 

einem Bereich zwischen 2% und 30% liegen. Bei zu geringer Konzentration zerfließen die Gele, 

bei zu hoher Konzentration werden sie brüchig. Ein 7.5%iges Gel entspricht einem 

Porendurchmesser von 5 nm, ein 30% iges Gel einem Porendurchmesser von 2nm. Um schärfere 

Protein-Banden und damit eine bessere Auflösung zu erzielen, wird eine diskontinuierliche 

Elektrophorese durchgeführt (SDS-DISC-PAGE). Dazu wird ein diskontinuierliches Gel, 

bestehend aus einem kleinporigen Trenngel und einem großporigen Sammelgel, hergestellt. 

Die Polymerisationsreaktion verläuft radikalisch und wird durch Zusetzen eines Radikalbildners 

(Ammoniumpersulfat, TEMED) gestartet. 

25




[SDS-Page nach U. Laemmli (1970) Nature 227,680-685] 

Lösungen: 

30% Acrylamid (29,22% Acrylamid 4x, 0,78% Bisacrylamid 4x) 

Vorsicht: monomeres Acrylamid ist stark toxisch ! 

Trenngelpuffer: 

18.17 g Tris 

(1.5 M Tris / 0.4 % SDS) mit 6N HCl auf pH 8.8 einstellen add 100 ml H 2 O 

Sammelgelpuffer: 

6.06 g Tris 

(0.5 M Tris / 0.4 % SDS) mit 6N HCl auf pH 6.8 einstellen add 100 ml H 2 O 

Elektrophoresepuffer: 

12 g Tris 

57.6 g Glycin add 1000 ml H 2 O 

Elektrophoresepuffer für den Lauf: 125 ml Elektrophoresepuffer 

5 ml 10 % SDS add 500 ml H 2 O 

Probenpuffer: 

Konz in der Probe 

20 ml Glycerin 10 % 

10 ml β-Mercaptoethanol 5 % 

40 ml 10 % SDS 2 % 

25 ml Sammelgelpuffer 0.0625 M add 100 ml H 2 O 

Ammoniumpersulfatlösg. 100 mg add 1 ml H 2 O (genau wiegen !!) 

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Durchführung 

1. Zwei unterschiedliche Glasplatten werden mittels Abstandhalter (Spacer) zusammengesetzt. 

2. Die Trenngellösung wird entsprechend oben stehendem Rezept angerührt und zwischen die 

Glasplatten gegossen (bis 2 cm unter den Rand) und bis zur Polymerisation mit Isopropanol 

oder Wasser überschichtet (vermeidet die Ausbildung von Blasen sowie das Austrocknung 

des Gels, dadurch wird eine möglichst ebene Grenzfläche zum Sammelgel erhalten). 

3. Nach der Polymerisation wird die überstehende Flüssigkeit entfernt. 

4. Danach wird das Sammelgel aufgetragen und ein Plastikkamm in die Sammelgelschicht 

eingesetzt. Dadurch bilden sich Taschen zum Auftragen der Proteinproben. 

5. Nach der Polymerisation wird vorsichtig der Kamm herausgezogen und das Gel mit der 

kompletten Halterung inklusive Elektroden in eine Pufferkammer eingesetzt. 

6. Beide Pufferkammern (innen und außen) werden mit Elektrophoresepuffer befüllt. 

7. Proteinproben und Proteinstandard in Probentaschen auftragen: 

• Proben vor dem Auftragen 3 min bei 90°C denaturieren, anschließend 1 min bei 13000rpm 

zentrifugieren. 

• 2 µl Proteinstandard in die erste Geltasche einfüllen, in die folgenden Taschen die 

vorbereiteten Proben (10 µl) geben. 

8. Elektrophorese durch Anlegen einer Spannung von 150 V starten (Polung beachten). 

9. Die Elektrophorese ist beendet, wenn die Bromphenolblau-Bande das untere Ende des Gels 

erreicht hat (ca. 70 min). 

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Proteinstandard zur Bestimmung der molekularen Masse der Proteine: 



Gelzubereitung 

(für 2 kleine Gele mit 10er Kämmen; 

für 2 große Gele mit 15er Kämmen doppelte Menge ansetzen) 

Trenngel 

10% 

H 2 O 

4ml 

30% Acrylamid 3,3ml 

Trenngelpuffer 2,5ml 

10% SDS 100µl 

10% APS 50µl 

TEMED 10µl 

Sammelgel 

5% 

H 2 O 

3ml 

30% Acrylamid 850µl 

Sammelgelpuffer 1,25ml 

10% SDS 50µl 

10% APS 25µl 

TEMED 10µl 

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SDS-Gelelektrophorese 

Gel nach Coomassie-Färbung 

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Immunoblotting (Western-Blotting) und Immunodetektion 

Theorie 

Durch Western-Blotting können Antigene spezifisch durch poly- und monoklonale Antikörper 

erkannt und damit sichtbar gemacht werden. Proteinproben werden beim SDS-PAGE mit Hilfe 

von Detergenzien wie Sodiumdodecylsulfat (SDS) und reduzierenden Reagenzien wie 

Dithiothreitol (DTT) oder 2-Mercaptoethanol (b-ME) solubilisiert und denaturiert. Anschließend 

werden die Proteine durch SDS-PAGE Gelelektrophorese aufgetrennt und mit Hilfe einer Wet 

tank Blotting Apparatur auf eine Nitrozellulose, PVDF oder Nylonmembran transferiert. Die auf 

der Membran gebundenen Proteine können dann bei Verwendung einer Nitrozellulosemembran 

durch reversible Anfärbung mit Ponceau S-Lösung sichtbar gemacht werden. 

Die auf der Membranoberfläche fixierten Proteine können jetzt mit Antikörpern detektiert werden. 

Aufbau des Blot-"Sandwichs" und Transfer der Proteine auf Nitrozellulose 

Im Anschluss an die Elektrophorese werden die aufgetrennten Proteine aus dem Gel auf 

Nitrozellulose-Membran überführt. Dazu werden pro Gel 2 Blatt Filterpapier und 1 Blatt 

Nitrozellulose-Membran in Blotting-Puffer getränkt. Achtung, die Nitrozellulose darf nur mit 

Handschuhen angefasst werden. Vorher die Membran auf einer Seite mit der Gruppennummer 

beschriften !! 

Blotting-Puffer: 

20 mM Tris 

150 mM Glycin 

20 % MeOH 

Dann wird ein "Sandwich" aufgebaut (Handschuhe tragen): 

Kathode 

2 Lagen Filterpapier (Whatman-Papier) 

Gel 

Nitrozellulose Membran 

2 Lagen Filterpapier (Whatman-Papier) 

Anode 

Luft- und Pufferblasen beim Auflegen der Filter vermeiden! 

Es wird 30 min bei einer Stromstärke von 360 mA geblottet. Anschließend wird das Gel zur 

Kontrolle, ob noch Proteine darin enthalten sind, 10 min lang in Coomassie-Brillant-Blue-Lösung 

gebadet und über Nacht in Entfärbungslösung (45 % Methanol, 7,5 % Essigsäure in H2O) 

geschüttelt. 

Die Nitrozellulose Membran wird in Ponceau S Färbelösung 1-2 min geschüttelt, dann wird die 

Membran mit H 2 O gewaschen. Die Proteine sollten sichtbar werden. (Die Membran kann 

zwischen Whatman Papier trocken gelagert werden.) 

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Immunodetektion von CPY mit einem spezifischen Antikörper 

Die Nitrozellulose wird zur Abdeckung unspezifischer Bindestellen 1 h lang (oder über Nacht) in 

Blocking-Lösung gebadet. 

Blocking-Lösung: 5 % Milchpulver in TBS-T 

TBS-T: 20 mM Tris/HCl, pH 7,5 

137 mM NaCl 

0,1 % Tween-20 

Anschließend wird die Blocking-Lösung verworfen, die Membran 3 mal 10 Minuten mit 15 ml 

TBS-T gewaschen und der anti-CPY Antikörper (monoklonal, aus Maus) 1:10.000 verdünnt in 

TBS-T zugegeben. Nach 1-stündiger Inkubation wird 3 mal 10 Minuten mit 15 ml TBS-T 

gewaschen. Dann erfolgt die Zugabe von in TBS-T verdünntem Peroxidase-markiertem anti- 

Maus Antikörper, (1:10000). Erneut wird 1 Stunde inkubiert und gewaschen wie zuvor. Die 

Entwicklung erfolgt mit dem ECL-Detektionskit (Prinzip: Chemolumineszenz, Details siehe Abb. 

ECL) auf einem lichtempfindlichen Film (mit Hilfe der Assistenten im Institut für Biochemie, 

Dunkelkammer) 

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DNA-Restriktionsanalyse & Elektrophorese 

Schneiden von DNA mit Restriktionsenzym Pvu I/Gelelektrophorese 

Zwei Eppendorf-Reaktionsgefässe vorbereiten: 

14 µl Wasser 

2 µl 10x Restriktionspuffer 

2 µl DNA (jede Gruppe erhält eine andere DNA-Probe) 

beide Ansätze kurz mischen, abzentrifugieren 

Ansätze entsprechend beschriften: 

ein Ansatz erhält 2 µl Pvu I – Enzym-Lösung (wird ausgegeben) 

ein Ansatz erhält 2 µl Wasser, dient als Negativkontrolle 

beide Ansätze 1 h bei 37°C inkubieren 

in dieser Zeit müssen die Agarose-Gele gegossen werden 

3 Gruppen giessen 1 Gel: 

0,4 g Agarose in 50 ml 1x TAE-Puffer aufkochen 

in der Mikrowelle, Assistenten VORHER fragen 

zur klaren Lösung 5 µl Ethidiumbromid (Handschuhe!) zugeben, mischen 

Gel giessen 

nach Ablauf der Inkubationszeit (1h, 37°C): 

zu beiden Ansätzen 2 µl der 10x dye-Lösung zugeben 

beide Proben auf das Gel auftragen, 

auf jedes Gel auch einen Längenstandard (10 µl) auftragen 

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Biochemie Praktikum I

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