Biochemie Praktikum I

Praktikumsskript Biochemie für Biologen-Bachelor SS2012
SDS-Elektrophorese
SDS-Elektrophorese
Neben der Gelfiltration wird die Polyacrylamid-Gel-Electrophorese (PAGE) in SDS
(Natriumdodecylsulfat) zur Molekulargewichtsbestimmung von Proteinen benutzt. Zur Trennung
von Proteinen im Polyacrylamidgel wird einerseits der Siebeffekt des Gels, zum anderen die
Ladung der Proteine ausgenutzt. Für die Molekulargewichtsbestimmung in der PAGE muss die
unterschiedliche individuelle Ladung (stammt von den geladenen Aminosäureseitenketten des
jeweiligen Proteins) der Proteine ausgeschaltet werden, damit die elektrophoretische Trennung
allein von der Größe des Moleküls abhängt. Dies wird durch Verwendung des Detergens SDS
erreicht. Durch Bindung von SDS werden Proteine:
1. denaturiert, d.h. von der nativen Struktur zu einer frei beweglichen Kette
entfaltet und
2. durch Anlagerung des hydrophoben Teils des SDS an hydrophobe Bereich der Proteine
wird dieses mit negativen Ladungen beladen, d.h. zu Polyanionen.
+SDS
natives Protein
SDS-beladenes entfaltetes Protein
SDS (Sodiumdodecylsulfate): Na + SO 4 - -CH 2 -(CH 2 ) 10 -CH 3
Da Proteine mit Disulfidbrücken in der SDS-PAGE häufig ein anormales Verhalten zeigen,
werden die Disulfidbrücken vor der Elektrophorese mit β-Mercaptoethanol reduziert. Die
Vorinkubation mit SDS und Mercaptoethanol schafft die Vorrausetzung für die Molekulargewichtbestimmung
im SDS-Gel, da jetzt die Beweglichkeit der Proteine nur eine Funktion der
Größe des Moleküls darstellt.
Für die Molekulargewichtsbestimmung wird die relative Beweglichkeit von Proteinen mit
bekanntem Molekulargewicht in Bezug auf einen internen Standard (meist Bromphenolblau)
verglichen und eine Eichkurve aufgestellt, indem der Logarithmus des Molekulargewichts gegen
den Rf-Wert (relative Beweglichkeit) aufgetragen wird. Aus dem Rf Wert des unbekannten
Proteins kann somit dessen Molekulargewicht ermittelt werden.
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