Biochemie Praktikum I

Praktikumsskript Biochemie für Biologen-Bachelor SS2012
Elektrophorese / CPY-Synthese
Biosynthese von CPY
Carboxypeptidase yscY (CPY) ist eine Exopeptidase, die in der Vakuole (entspricht dem
Lysosom) der Hefe Saccharomyces cerevisiae lokalisiert ist. Es handelt sich um eine
unspezifisch agierende Peptidase, welche ihre natürlichen Substrate, d.h. in die Vakuole
eingeschleuste Proteine, vom Carboxy-Terminus her durch Spaltung von Peptidbindungen
abbaut. Dabei spaltet sie bevorzugt hinter hydrophoben Aminosäuren.
So lässt sich ihre Aktivität mit Hilfe synthetischer Peptidsubstrate, in denen z.B. an ein
Phenylalanin oder ein Tyrosin carboxyterminal ein Chromophor gekoppelt ist, durch die
Freisetzung dieser gefärbten Komponente verfolgen. Für die Spaltung des Substrats ist u. a.
ein Serin-Rest im aktiven Zentrum des Enzyms erforderlich, die CPY wird deshalb zu den
Serin-Peptidasen gerechnet.
Die Carboxypeptidase yscY durchläuft nach ihrer Synthese einen Teil des sekretorischen
Weges der Zelle (Endoplasmatisches Retikulum; Golgi-Apparat) und wird von dort in die
Vakuole sortiert. Sie wird als ein höher-molekulares Vorläufermolekül (61 kDa) hergestellt,
das nach seiner Modifizierung mit 4 Kohlenhydratketten im ER ein Molekulargewicht von 67
kDa erreicht (p1-Form) und später durch weitere „outer-chain“-Mannosylierung im Golgi als
69 kDa (p2)-Form vorliegt. In der Vakuole erfolgt die proteolytische Reifung zur aktiven
Carboxypeptidase yscY mit einem Molekulargewicht von 61 kDa.
Die proteolytische Reifung des Enzyms wird durch zwei weitere vakuoläre Peptidasen,
Proteinase yscA und Proteinase yscB, katalysiert. Eine mutierte Form des Proteins, CPY*,
wird im ER als falsch gefaltet erkannt und durch retrograden Transport aus dem ER hinaus
dem Abbau durch das Proteasomen zugeführt. Für den Ablauf dieses Prozesses wird u. a. das
Der3 Protein benötigt.
In diesem Versuch sollen die verschiedenen Reifestadien der CPY mit Hilfe eines Immuno-
Blots visualisert werden. Dazu werden Proteinextrakte von mutierten Hefestämmen
verwendet.
YWO 342 (WT); YWO 1527 (prc1-1 Δder3 Δdoa10); YWO 664 (Δpep4); YWO 636
(Δprc1)
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