Biochemie Praktikum I
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<strong>Praktikum</strong>sskript <strong>Biochemie</strong> für Biologen-Bachelor SS2012<br />
SDS-Elektrophorese<br />
Immunoblotting (Western-Blotting) und Immunodetektion<br />
Theorie<br />
Durch Western-Blotting können Antigene spezifisch durch poly- und monoklonale Antikörper<br />
erkannt und damit sichtbar gemacht werden. Proteinproben werden beim SDS-PAGE mit Hilfe<br />
von Detergenzien wie Sodiumdodecylsulfat (SDS) und reduzierenden Reagenzien wie<br />
Dithiothreitol (DTT) oder 2-Mercaptoethanol (b-ME) solubilisiert und denaturiert. Anschließend<br />
werden die Proteine durch SDS-PAGE Gelelektrophorese aufgetrennt und mit Hilfe einer Wet<br />
tank Blotting Apparatur auf eine Nitrozellulose, PVDF oder Nylonmembran transferiert. Die auf<br />
der Membran gebundenen Proteine können dann bei Verwendung einer Nitrozellulosemembran<br />
durch reversible Anfärbung mit Ponceau S-Lösung sichtbar gemacht werden.<br />
Die auf der Membranoberfläche fixierten Proteine können jetzt mit Antikörpern detektiert werden.<br />
Aufbau des Blot-"Sandwichs" und Transfer der Proteine auf Nitrozellulose<br />
Im Anschluss an die Elektrophorese werden die aufgetrennten Proteine aus dem Gel auf<br />
Nitrozellulose-Membran überführt. Dazu werden pro Gel 2 Blatt Filterpapier und 1 Blatt<br />
Nitrozellulose-Membran in Blotting-Puffer getränkt. Achtung, die Nitrozellulose darf nur mit<br />
Handschuhen angefasst werden. Vorher die Membran auf einer Seite mit der Gruppennummer<br />
beschriften !!<br />
Blotting-Puffer:<br />
20 mM Tris<br />
150 mM Glycin<br />
20 % MeOH<br />
Dann wird ein "Sandwich" aufgebaut (Handschuhe tragen):<br />
Kathode<br />
2 Lagen Filterpapier (Whatman-Papier)<br />
Gel<br />
Nitrozellulose Membran<br />
2 Lagen Filterpapier (Whatman-Papier)<br />
Anode<br />
Luft- und Pufferblasen beim Auflegen der Filter vermeiden!<br />
Es wird 30 min bei einer Stromstärke von 360 mA geblottet. Anschließend wird das Gel zur<br />
Kontrolle, ob noch Proteine darin enthalten sind, 10 min lang in Coomassie-Brillant-Blue-Lösung<br />
gebadet und über Nacht in Entfärbungslösung (45 % Methanol, 7,5 % Essigsäure in H2O)<br />
geschüttelt.<br />
Die Nitrozellulose Membran wird in Ponceau S Färbelösung 1-2 min geschüttelt, dann wird die<br />
Membran mit H 2 O gewaschen. Die Proteine sollten sichtbar werden. (Die Membran kann<br />
zwischen Whatman Papier trocken gelagert werden.)<br />
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