Biochemie Praktikum I

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Praktikumsskript Biochemie für Biologen-Bachelor SS2012 LDH-Test / Proteinbestimmung Versuchsdurchführung: Lactatdehydrogenase (LDH)-Enzymaktivitätstest Folgende LDH katalysierte Reaktion liegt dem Test zugrunde (vgl. Stryer, Biochemie): Pyruvat +NADH + H + ⇔ Lactat + NAD + LDH Den Verlauf dieser Reaktion kann man mit Hilfe eines Photometers anhand der Oxidation von NADH zu NAD + verfolgen. Bei 366 nm absorbiert nur NADH. Abb. 3. Struktur von NAD + und NAD + /NADH Redoxreaktion Die Geschwindigkeit der Reaktion - d.h. die zeitliche Änderung der Konzentration eines Reaktionsteilnehmers (Substrat) im Verlauf der Reaktion – kann anhand der Änderung der Extinktion gemessen werden. Die Extinktion (optische Auslöschung eines Lichtsignals durch Absorption von Lichtquanten an Molekülen) ist proportional zur Konzentration der absorbierenden Moleküle. E ist also ein Maß für die Konzentration (c) des verfolgten Stoffes (Lambert-Beersches Gesetz): E = -log I 1 / I 0 = ε ⋅ d ⋅ c (1) I 0 : Intensität des eingestrahlten Lichts I 1 : Intensität des austretenden Lichts c: Konzentration des absorbierenden Stoffes d: Schichtdicke der Lösung ε: Absorptionskoeffizient Aus der Steigung der erhaltenen Messkurve kann man die Geschwindigkeit (v) der Abnahme der NADH Konzentration errechnen. Diese ist ein direktes Maß für die vorhandene 10
Praktikumsskript Biochemie für Biologen-Bachelor SS2012 LDH-Test / Proteinbestimmung Enzymmenge und wir in der Enzymologie deshalb auch als Volumenaktivität (A V) bezeichnet. Durch Auflösen von (1) nach c erhält man E c = ––––– ε ⋅ d daraus folgt für die Reaktionsgeschwindigkeit (dc/dt) ∆c ∆E v = A V = ––– = –––––– (2) ∆t ∆t ⋅ ε ⋅ d v : Reaktionsgeschwindigkeit Av: Enzymaktivität (in der Küvette [1 µmol Substratumsatz / (min ⋅ ml) = U (unit) / ml] ∆E : Extinktionsänderung (2 cm = 0,1 bei 100mV, 2 cm = 0,01 bei 10mV) ∆t : Zeitänderung [min] ε 366nm : 3,3 ml / (µmol ⋅ cm) d : Lichtweg durch Küvette (1 cm) Da uns eigentlich die Enzymaktivität in der Probe (nicht in der Messküvette interessiert) muss die Verdünnung mit einberechnet werden. Gleichung (2) erweitert sich zu: ∆E V T A V = ––––––– ∆t ε ⋅ d –––– V P V T : Testvolumen (1000 µl) V P : Probenvolumen (20 µl) Quotient entspricht dem Verdünnungsfaktor Durchführung des LDH-Aktivitätstests Das Spektrometer wird im abs-Modus (absorbance (engl)= Extinktion 9 ) betrieben. Vor Beginn der Messung wird das Spektrometer und der angeschlossene Schreiber mit dem Nullwert geeicht (set reference am Photometer + Schreiber auf Nulllinie; Eingangsspannung 10 mV: Papierbreite entspricht einer Extinktionseinheit). Der Maximalausschlag des Schreibers (Startposition zu Beginn der Reaktion) wird mit dem Maximalwert festgelegt. Zur Messung wird folgender Testansatz verwendet: 67 mM Phosphatpuffer pH 7.2 940 µl Pyruvatlösg. (2,75 mg / ml) 20 µl NADH-Lösg. (11 mg / ml) 20 µl Probenlösung (LDH) 20 µl Zur Herstellung der Pyruvatlösung ca. 1 mg einwiegen und mit der zum Erreichen der geforderten Konzentration notwendigen Menge Puffer auffüllen. Zur Herstellung der NADH-Lösung ca. 4 mg einwiegen und mit der zum Erreichen der geforderten Konzentration notwendigen Menge Puffer auffüllen. 9 unterscheide dazu: absorption (engl) = Absorption 11
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