Enterisches virenpanel Echtzeit-PCR Kit - Diagenode Diagnostics

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12.1 Analytische Sensitivität
Die analytische Nachweisgrenze unter Berücksichtigung des Reinigungsvorgangs (LOD) wurde für
Norovirus I und II in der Stuhl-Matrix bewertet. Die analytische Nachweisgrenze unter Berücksichtigung
des Reinigungsvorgangs wird unter Verwendung von quantifizierten inaktiven Norovirus I und II
Krankheitserregern bewertet. Zum Zeitpunkt der Durchführung des analytischen Empfindlichkeitstest
waren keine Genomstandards für die Rotaviren verfügbar. Daher wurde der LOD für die Rotaviren mit
direkt in die PCR-Master-Mix-Lösung hinzugefügte Plasmid-DNA durchgeführt. Die Anzahl der
Kopien/Reaktion wurde dann in theoretische Kopien/ml der Probe umgewandelt bei Annahme einer
Extraktionseffizienz von 100%.
Um die analytische Sensitivität unter Berücksichtigung des Reinigungsvorgangs des Diagenode
Enterisches Virenpanel Echteit-PCR-Kit für die Erkennung von Norovirus (I/II) in den Stuhlproben zu
ermitteln, wurden Verdünnungsproben in Pools von negativen Stuhlproben durchgeführt.
Um die analytische Sensitivität des Diagenode Enterisches Virenpanel Echtzeit-PCR-Kit für die
Erkennung von Rotavirus zu ermitteln, wurden Verdünnungsproben eines bestimmten Plasmid, welcher
die Rotavirus-Zielsequenz beinhaltet, direkt in die PCR-Master-Mix-Lösung vermischt.
Proben wurden auf dem BD MAX TM –Instrument in Kombination mit dem Diagenode Enterisches
Virenpanel Echtzeit-PCR-Kit analysiert. Für Rotavirus wurde der Extraktionsschritt ausgelassen. Das
Testen wurde an verschiedenen Tagen mit 24 Replikaten durchgeführt. Die Ergebnisse wurden durch
eine Probit-Analyse bestimmt. Analytische Sensitivität (LOD) definiert als die niedrigste Konzentration
bei der ≥ 95% der Replikate positive getestet werden sind der unteren Tabelle zu entnehmen:
LOD 95%
Kopien/PCR
Kopien/mL
Norovirus I NA 5 151 (300 to 10 000)*
Norovirus II NA 587
Rotavirus 30 397
* Die Sensitivität von Norovirus I ist stark durch die Stuhlprobe beeinflusst.
In der vorliegenden Sensitivitätsstudie variierte die Bestimmungsgrenze
(LOD) von 300 bis 10 000 Kopien/mL je welches Pool für den Stuhl verwendet
wurde
12.2 Präzision
Die Präzisionswerte des Diagenode Enterisches Virenpanel Echtzeit-PCR-Kit wurden mittels des BD
MAX TM- Instrument gesammelt und ermöglichen die Bestimmung der Variabilität innerhalb der
Durchläufe (Variabilität von mehreren Probenergebnissen der selben Konzentration innerhalb eines
Experiments) und der Variabilität zwischen der Durchläufe (Variabilität von mehreren Ergebnissen des
durchgeführten Vorgang mittels vier an verschiedenen Tagen gestarteter Durchläufe) von Norovirus I/II
and Rotavirus. Die gesammelten Daten wurden zur Bestimmung der Standardabweichung und dem
Variationskoeffizienten für die drei erkannten Erreger verwendet.
Präzisionswerte für Norovirus I und II wurden mit Verwendung der Stuhlmatrix unter Hinzugabe von den
entsprechenden inaktiven Krankheitserregern bei hoher und niedriger (nahe den entsprechenden LODs)
Konzentration der Krankheitserreger bestimmt. Kein quantifizierter Genomstandard für Rotavirus war
zum Zeitpunkt der Durchführung der Präzisionstests verfügbar. Daher wurden Präzisionswerte für
Rotavirus mittels direkt in den Master-Mix hinzugefügter Plasmid-DNA bei hoher und niedriger (nahe
den entsprechenden LODs) Konzentration des Rotavirus gesammelt.
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