Diagenode Atemwegsgrippe A/B Echtzeit-PCR-Kit

DIAGENODE Atemwegsgrippe A/B Echtzeit-PCR GEBRAUCHSANWEISUNG 

Diagenode DBDR-30-4-L096 Version 1 

BD 442985 Ausgabedatum: 24.10.2012 

Diagenode Atemwegsgrippe A/B 

Echtzeit-PCR-Kit 

Gebrauchsanleitung 

Vertrieben durch 

ZUR VERWENDUNG MIT DEM BD MAX TM SYSTEM

Diagenode sa / CHU - Tour GIGA - B34 – 3.Stock // Avenue de l’Hôpital, 1 // 4000 Liège (Sart Tilman) // Belgien // Telefon: (+32) 4 364 20 50 

// E -Mail: info@diagenode.com 

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1. EINLEITUNG .................................................................................................................................... 3 

2. DIAGENODE ATEMWEGSGRIPPE A/B ECHTZEIT-PCR-KIT ............................................................... 4 

2.1 VERWENDUNGSZWECK ....................................................................................................................... 4 

2.2 INFORMATIONEN ZUM KRANKHEITSERREGER ........................................................................................ 4 

2.3 INHALT DES KITS ............................................................................................................................... 5 

3. MATERIAL ....................................................................................................................................... 5 

3.1 BENÖTIGTES MATERIAL (NICHT MITGELIEFERT) ..................................................................................... 5 

3.2 AUSRÜSTUNG UND MATERIAL ZUR KOMBINATION MIT DIAGENODE ATEMWEGSGRIPPE A/B 

ECHTZEIT-PCR-KIT (NICHT MITGELIEFERT) .......................................................................................... 5 

4. ÜBERPRÜFUNG............................................................................................................................... 6 

5. QUALITÄTSKONTROLLE .................................................................................................................. 6 

6. LAGERUNG, TRANSPORT UND STABILITÄT DER REAGENZIEN ....................................................... 7 

7. PROBENAHME, LAGERUNG UND TRANSPORT ................................................................................ 7 

7.1 ART DER PROBENAHME ...................................................................................................................... 7 

7.2 PROBENLAGERUNG ............................................................................................................................ 7 

7.3 PROBENTRANSPORT .......................................................................................................................... 7 

8. WARN- UND VORSICHTSHINWEISE ................................................................................................. 8 

9. PROTOKOLL .................................................................................................................................... 9 

9.1 PROBEN- UND KONTROLLVORBEREITUNG ............................................................................................ 9 

9.2 ECHTZEIT-PCR MISCHUNGSVORBEREITUNG ........................................................................................ 9 

9.3 BD MAX TM SYSTEMAMPLIFIKATION ................................................................................................... 11 

10. ERGEBNISSE ............................................................................................................................... 13 

11. ANLEITUNG ZUR PROBLEMLÖSUNG ........................................................................................... 15 

12. LEISTUNGSEIGENSCHAFTEN ...................................................................................................... 16 

12.1 ANALYTISCHE SENSITIVITÄT UNTER BERÜCKSICHTIGUNG DER REINIGUNG ........................................... 16 

12.2. PRÄZISION ................................................................................................................................... 16 

12.3 ANALYTISCHE SPEZIFITÄT ............................................................................................................... 17 

12.4 KLINISCHE LEISTUNGSFÄHIGKEIT .................................................................................................... 18 

13. TESTBESCHRÄNKUNGEN ............................................................................................................ 20 

14. QUALITÄTSZERTIFIZIERUNG ....................................................................................................... 20 

15. REFERENZEN .............................................................................................................................. 20 

16. SYMBOLERKLÄRUNG .................................................................................................................. 21 

17. KAUFHINWEIS ............................................................................................................................ 22

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Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR), auch quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) genannt, ist 

eine Nukleinsäureamplifikationstechnik, welche verwendet wird, um bestimmte DNA-Sequenzierungen 

aufzufinden und zu quantifizieren ; diese erhält man nach Extraktion und reverser Transkription nach 

RNA-Sequenzierung. 

Eine solche Quantifizierung kann in absoluter oder relativer Anzahl von Kopien gemessen werden. 

Diese Echtzeit-PCR-Technologie ermöglicht eine schnelle, genaue und quantitative Messung der Gene, 

welche von ansteckenden Krankheiten, Krebs oder genetischen Anomalitäten betroffen sind. Diese 

beeindruckende Technologie wird in Kits der Firma Diagenode für eine genaue Erkennung von 

Krankheitserregern genutzt. 

Eine der markanten Eigenschaften der qPCR Technologie ist, dass die amplifizierte DNA während der 

Vermehrung in der Echtzeit-Reaktion für jeden PCR-Amplifikationszyklus quantifiziert wird, was 

wiederum weitaus genauere Messungen als mit herkömmlichen Endpunkt-PCR erlaubt. Die 

Quantifizierung von Signalen, die von fluoriszierenden Farbstoffen abgegeben werden, welche mit der je 

Amplifikationszyklus entstehenden Doppelstrang-DNA interkalieren, ermöglichen diese 

Echtzeitmessungen. Alternativ kann man doppelt mit fluoriszierenden Farbstoffen (z.B. TaqMan ® Sonde) 

markierte DNA (Oligonukleotide) als Sonden verwenden, welche sich dann mit der komplementären 

DNA kreuzen, um die Echtzeitmessung während der qPCR zu ermöglichen. Die dann folgenden 

fluoriszierenden Signale können mit einem Instrument, wie etwa einem für die qPCR programmierten 

Thermalzykler, genau beobachtet und gemessen werden. 


// E -Mail: info@diagenode.com


2.1 Verwendungszweck 

Das Diagenode Atemwegsgrippe A/B-Echtzeit-PCR-Kit wie es im BD MAX System implementiert ist, ist 

ein automatisiertes in vitro Diagnostikprodukt für die qualitative Erkennung der Atemwegsgrippe A, 

Atemwegsgrippe B Viren aus einem nasopharyngealen Abstrich von Patienten mit Infektionen der 

Atemwege. Virale Nukleinsäure wird aus der Probe entnommen, welche einer reversen Transkription 

unterzogen wird, um komplementäre DNA (cDNA) herzustellen. Die Ziel-cDNA wird durch qPCR 

verstärkt und anschließend analysiert um die Präsenz oder das Fehlen jedes Virus festzustellen. 

Negative Ergebnisse schließen keine Grippeninfektion aus und sollten nicht als alleinige 

Entscheidungsgrundlage für eine Behandlung oder sonstige Versorgungsentscheidungen verwendet 

werden. 

2.2 Informationen zum Krankheitserreger 

Das Diagenode Atemwegsgrippe A/B-Kit ist ein Multi-Target-Test zur Erkennung von 

Atemwegserkrankungsviren mit gravierenden gesundheitlichen Folgen für Kinder, ältere und 

immungeschwächte Patienten. Die Differenzierung zwischen und Erkennung von diesen Erregern führt 

zu effizientem Management von Patienten mit Infektionen der Atemwege, Überwachung der 

Krankheiten, und Infektionsschutzmaßnahmen. 

Atemwegsgrippeviren sind hoch ansteckend. Fehldiagnose, welche in verspäteter Behandlung resultiert 

kann zu primärer viraler Pneumonie oder sekundärer bakterieller Pneumonie führen, vor allem bei 

Patienten mit Lungen- oder Herzerkrankungen. 

Virale respiratorische Krankheiten sind für etwa 200.000 Krankenhausaufenthalte während der Grippe- 

Saison (November bis März) und ungefähr 23.600 Todesfälle verantwortlich. 1 Die Krankheit befällt meist 

Säuglinge und Kleinkinder und kann besonders bei Säuglingen unter 1 Jahr tödlich sein; auch 

Erwachsene können betroffen sein, wobei die größte Gefahr für Ernsthaftigkeit und Sterblichkeit bei den 

Älteren liegt. 2 Bei immungeschwächten Menschen kann eine respiratorische virale Krankheit zu 

häufigerem Krankenhausaufenthalt wegen Herz- oder Lungenproblemen oder weiteren 

Atemwegsgrippe-zugehörigen Komplikationen führen, welche mit dem Tod enden können. 3

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2.3 Inhalt des Kits 

Dieses Kit wird mit dem BD MAX TM System verwendet. 

Diagenode Atemwegsgrippe A/B Echtzeit-PCR-Kit: 96 PCR-Reaktionen (12,5 µl PCR Volumen), eine Box : 

I. Atemwegsgrippe A/B und RNA-interne Kontrolle mit doppeltgefärbten Sonden & 

Primern (4 Röhrchen) 

Atemwegsgrippe A mit doppeltgefärbten Sonden & Primern (FAM, 520 nm), 

Atemwegsgrippe B mit doppeltgefärbten Sonden & Primern (YD, 549 nm), und 

RNA-Extraktions und Inhibitionskontrolle mit doppeltgefärbten Sonden & Primern (TR, 603 nm): 

65 µl je rotem Röhrchen. 

II. Atemwegsgrippe A/B Positivkontrolle: 120 µl, grünes Röhrchen. 

III. Atemwegsgrippe A/B Negativkontrolle (H2O PCR Grad): 120 µl, himmelblaues Röhrchen. 

IV. H2O PCR Grad: 500 µl, himmelblaues Röhrchen. 

V. Optima PLUS Master-Mix: 720 µl, weißes Röhrchen 

VI. Inaktive RNA-Viruskultur (interne Kontrolle): 1000 µl, gelbes Röhrchen 

3.1 Benötigtes Material (nicht mitgeliefert) 

• Pipetten (präzise zwischen 1-1000 µl) 

• Sterile Pipettenspitzen mit Filtern 

• Puderfreie Handschuhe 

• Vortex-Mixer 

• Arbeitsmantel 

• RNase/DNase-freie Mikrozentrifugenröhrchen (1,5 und/oder 2 ml) 

• RNase/DNase-freies Wasser 

• Laminar-Flow-Haube 

• Ampulle mit Liquid Amies Medium und Abstriche (ESwab *) 

*ESwab Puffer : 3g NaCl ; 0.20g KCl ; 0.10g CaCl2 ; 0.10g MgCl2 ; 0.20g KH2PO4 ; 1.15g Na2HPO4 ; 1g C2H3NaO2S in 

1l destilliertem Wasser 

3.2 Ausrüstung und Material zur Kombination mit Diagenode Atemwegsgrippe A/B 

Echtzeit-PCR-Kit (nicht mitgeliefert) 

• Echtzeit- PCR Instrument: BD MAX System 

• BD MAX RNA Extraktions-Kit RNA-3 (Ref : 437522): RNA Extraktionsreagenz (E2-R) 

RNA Probenvorbereitungsreagenz (SP2-R) 

DNase Reagenz (D1) 

Einzel-RNA-Reagenztreifen 

BD MAX PCR Kartuschen (Ref : 437519) 




Diagenode Atemwegsgrippe Echtzeit-PCR-Kit wurde auf die Einhaltung der unten angegebenen 

Parameter hin überprüft: 

Gesammelte 

Proben 

PCR-Plattform 

Nasopharyngeale Probe gesammelt durch Abstrich in einem Liquid 

Amies Medium (ESwab) 

BD MAX TM System 

• Anforderungen an die Qualitätskontrolle sind in Übereinstimmung mit örtlichen, Landesund/oder 

Bundesrichtlinien oder Zulassungsbestimmungen und den in Ihrem Laboratorium 

üblichen Verfahren zur Qualitätskontrolle zu erfüllen. 

• Qualitätskontrollverfahren sollen die Reagenzien und Testverläufe überwachen. 

Kontrolltyp Für die Überwachung der folgenden Reagenzien und Testverläufe 

Positiv Elementares Versagen der Reagenzien inklusive Integrität von Primern und Sonden 

Negativ Reagenzien und/oder Verunreinigung der Umwelt 

Intern Versagen bei Lyse- und Extraktionsverfahren 

PCR-Hemmung in einzelnen Proben und Versagen der Reagenzien oder Prozessfehler 

• Testen Sie alle positiven und internen Kontrollen bevor Sie Proben durchführen mit jeder neuen 

Kitcharge um sich zu vergewissern, dass alle Reagenzien und Kit-Teile einwandfrei 

funktionieren. 

• Gemäß guter Laborpraxis wird empfohlen die interne Kontrolle in jedem Durchlauf der 

Nukleinsäureisolierung zu inkludieren. Die interne Kontrolle sollte als Probe behandelt werden. 

• Lassen Sie die Positivkontrolle niemals durch eine Nukleinsäureisolierung laufen. 

• Das Inkludieren einer Negativ- und zumindest einer Positivkontrolle wird für jeden 

durchgeführten Amplifikations-/Erkennungsdurchlauf empfohlen. 

• Das Versagen der Kontrollen setzt den Durchlauf außer Kraft und die Ergebnisse sollten nicht 

verwendet werden. 

- Falls die Positivkontrolle nicht innerhalb der angegebenen Ct Bandbreite positiv ist, aber 

die Negativkontrolle gültig ist, sollte ein wiederholtes Testen beginnend mit den 

gereinigten Nukleinsäuren und einer neuen aliquoten Anzahl an Positivkontrollen 

gestartet werden. Falls die Wiederholungsergebnisse noch immer ungültig sind, sollten 

die Ergebnisse nicht verwendet werden und das Testen sollte mit der originalen Probe 

wiederholt oder einer neue Probe sollte gesammelt und getestet werden. 

- Falls die interne Kontrolle nicht innerhalb der angegebenen Ct Bandbreite positiv ist 

oder die Negativkontrolle ungültig ist, dann sollte ein wiederholtes Testen beginnend mit 

der Originalprobe unter Verwendung einer neuen internen Kontrolle und einer neuen 

negativen Kontrolle gestartet werden. Falls die Wiederholungsergebnisse noch immer 

ungültig sind, sollten die Ergebnisse nicht verwendet und eine neue Probe gesammelt 

und getestet werden (siehe auch 11. Anleitung zur Problemlösung).

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Lagern Sie alle Reagenzien (geöffnet oder ungeöffnet) bei ≤-20°C bis zum Ablaufdatum wie unten 

angegeben: 

Zustand Lagertemperatur Ablaufdatum 

Ungeöffnete Reagenz ≤ -20°C Ablaufdatum laut Etikett 

Geöffnete Reagenz ≤ -20°C 1 Jahr nach Öffnungsdatum 

Achten Sie immer auf das Ablaufdatum wie auf der Reagenz angegeben. 

Wir empfehlen die Reagenz nicht mehr als 13 Einfrier-/Auftau-Abfolgen auszusetzen um den Abbau der 

Komponenten zu vermeiden. 

Diagenode Atemwegsgrippen A/B Echtzeit-PCR-Kit wird eingefroren versandt, sollte eingefroren 

geliefert und sollte nach Erhalt gefroren bei ≤ -20°C gelagert werden. Falls die Komponenten des Kits 

nicht gefroren sind kontaktieren Sie Ihren lokalen BD-Vertreter bitte umgehend. 

Reagenzien vor Licht schützen. 

Achtung 

Lagerung des Kits bei Raumtemperatur kann zum Abbau der Primer/Sonden/Positivkontrolle/Plasmide 

führen. Dies geht mit einer verringerten Sensibilität einher und wir würden dringendst den Gebrauch 

eines neuen Kits empfehlen. 

7.1 Art der Probenahme 

Der PCR-Test wird mit einer durch einen ESwab gesammelten nasopharyngealen Probe durchgeführt. 

7.2 Probenlagerung 

Respiratorische Proben können bei 2-8°C für bis zu 24 Stunden oder eingefroren bei -20°C oder -70°C 

für mehr als 24 Stunden gelagert werden. 

Die respiratorischen Proben sollten in einem ESwab Liquid Amies Transportmedium gelagert werden. 

Die Sensibilität des PCR könnte durch wiederholtes Einfrieren oder Auftauen der Stuhlproben verringert 

werden; vermeiden Sie daher Einfrier-/Auftau-Abfolgen. 

7.3 Probentransport 

Die respiratorischen Proben müssen in einem ESwab Liquid Amies Transportmedium transportiert 

werden. 

Die Proben müssen gemäß der lokalen und nationalen Vorschriften zum Transport von 

Krankheitserregern transportiert werden. 

Um einen Abbau von Nukleinsäure zu verhindern empfehlen wir Ihnen den Transport bei -20°C falls die 

Transportzeit mehr als 24 Stunden beträgt. 

Innerhalb des Labors können Proben bei Raumtemperatur transportiert werden. 




Allgemeine Hinweise 

Falls Sie ein beschädigtes Paket oder aufgetaute Kits erhalten sollten, 

kontaktieren Sie bitte unseren lokalen BD –Vertreter. Verwenden Sie das Kit nicht. 

• Lesen Sie die Bedienungsanleitung sorgfältig durch, bevor Sie das Experiment durchführen. 

• Die Verwendung dieses Produkts sollte auf Personal beschränkt werden, welches in den Techniken 

von Echtzeit-PCR ausgebildet sind. 

• Nur als Verwendung zur Invitro-Diagnostik geeignet. 

Schutzvorkehrungen 

• Verwenden Sie das Kit nicht falls das Label, das die äußere Box versiegelt, gebrochen ist. 

• Verwenden Sie die Reagenzien nicht falls die Schutzbox bei der Lieferung offen oder zerrissen ist. 

• Verwenden Sie die Reagenzien nicht falls die Sonde geöffnet oder beschädigt wurde. 

• Vermischen Sie keine Reagenzien aus verschiedenen Kits oder Kitchargen. 

• Verwenden Sie keine verfallenen Reagenzien oder Materialien. 

• Vermischen Sie keine Kappen zwischen Sonden oder verzichten Sie auf die Wiederverwendung von 

Kappen, da Kontamination auftreten und die Testergebnisse beeinträchtigen könnte. 

• Aerosol-resistente Spitzen müssen für alle PCR-Gemische verwendet werden. 

• Das PCR-Labor (Sicherheitswerkbank, DNA/ RNA-Extraktionsplattform, Schutzmantel, etc.) müssen 

nach jedem PCR-Experiment mit geeigneten Lösungen gereinigt werden. 

• Das Testen zusätzlicher Kontrollen kann gemäß den Richtlinien oder Anforderungen von örtlichen, 

Landes- und/oder Bundesbestimmungen oder akkreditierten Organisationen erforderlich sein. 

• Für den Fall, dass andere PCR-Tests in dem selben allgemeinen Teil des Labors durchgeführt 

werden, müssen geeignete Maßnahmen getroffen werden, damit das Diagenode Atemwegsgrippe A/B 

Echtzeit-PCR-Kit, BD MAX RNA Extraktions-kit RNA-3, jegliche weiteren für den Test benötigten 

Reagenzien und das BD MAX System nicht kontaminiert werden. Die Handschuhe müssen vor dem 

Manipulieren der Reagenzien oder Kartuschen gewechselt werden. 

• Entsorgen Sie das Kit bei Verdacht auf Vereunreinigung. 

• Handhaben Sie Proben immer als ob diese ansteckend wären und in Einhaltung von Regeln zum 

sicheren Ablauf von Labortätigkeit, wie etwa in lokaler Gesetzgebung dokumentiert. 

• Tragen Sie Schutzkleidung und geeignete Einweghandschuhe während Sie mit den Reagenzien des 

Kits hantieren. Waschen und desinfizieren Sie Ihre Hände gründlich, nachdem Sie den Test 

durchgeführt haben. 

• Das Kit sollte nicht von einer Person benutzt werden, die Symptome jener Krankheit zeigt, die durch 

das Kit erkannt werden soll. 

• Nicht mit dem Mund pipettieren. 

• Verschlucken Sie keine Komponenten des Kits. 

• In Bereichen, in denen Proben oder Kit- Reagenzien verwendet werden, darf nicht geraucht, 

getrunken oder gegessen werden. 

• Die Experimente sollten nicht während einer Schwangerschaft durchgeführt werden, da dies Risiken 

für das ungeborene Baby mit sich bringt. 

• Entsorgen Sie ungebrauchte Reagenzien und Abfälle gemäß den geltenden Bundes-, Landes- oder 

örtlichen Vorschriften.

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Entnehmen Sie die Proben und beschriften Sie diese passend (s. oben unter 7.1 Art der Probeentnahme) 

9.1 Proben- und Kontrollvorbereitung 

9.1.1 Probenvorbehandlung 

Für nasopharyngeale Abstriche in Liquid Amies medium: 

• Pipettieren Sie 10 µl der internen RNA-Kontrolle (gelbes Röhrchen) und 750 µl Probe in ein 

Probenaufbereitungreagenzienröhrchen. 

• Schließen Sie jedes Probenaufbereitungreagenzienröhrchen und mischen Sie diese für 10 

Sekunden in einem Vortexer. 

9.1.2 Vorbereitung der Diagenode Positiv- und Negativkontrolle (optional) 

Um die Reaktion zu überprüfen und die Ergebnisse zu analysieren, müssen eine Positiv- und eine 

Negativkontrolle durchgeführt werden. 

• Für die Positivkontrolle: 

Pipettieren Sie 10 µl der internen RNA-Kontrolle (gelbes Röhrchen) und 750 RNase/DNase-freies 

Wasser in ein Probenaufbereitungsreagenzienröhrchen. Verschließen Sie das Röhrchen wieder, 

mischen Sie im Vortex-Mixer und öffnen Sie das Röhrchen wieder vor dem Gebrauch. 

• Für die Negativkontrolle: 

Pipettieren Sie 10 µl der Negativkontrolle von Diagenode (himmelblaues Röhrchen) und 10 µl der 

internen RNA-Kontrolle (gelbes Röhrchen) und 740 µl RNase/DNase-freies Wasser in ein 

Probenaufbereitungsreagenzienröhrchen. Verschließen Sie das Röhrchen wieder, mischen Sie 

im Vortex-Mixer und öffnen Sie das Röhrchen wieder vor dem Gebrauch. 

9.2 Echtzeit-PCR Mischungsvorbereitung 

1. Zählen Sie die Gesamtzahl der Proben und Kontrollen, die in dem Durchlauf getestet werden sollen. 

2. Beginnen Sie - kurz bevor Sie den Testdurchlauf starten – mit der Vorbereitung des folgenden 

kompletten Master-Mix indem Sie jedes Komponentenvolumen mit der Gesamtzahl an Proben 

multiplizieren, plus 20% Überdosierung um Pipettierfehler zu berücksichtigen (siehe unten stehende 

Tabelle). 

Optima PLUS Master- Mix (weißes Röhrchen)…………..……………..…6,75 µl 

Atemwegsgrippe A/B Primer und Proben (rotes Röhrchen)………..…2,5 µl 

H2O PCR Grad (himmelblaues Röhrchen)…………..……………………..3,25 µl 

Endvolumen eines Streifens………………………………..……..………..12, 5µl 




Beispielberechnung für mehrere Streifen/Reaktionen: 

Anzahl der 

Proben 

Prozentuale 

Fehler beim 

Pipettieren 

Primer/Sonde 

(µl) 

Optima PLUS 

Master-Mix 

(µl) 

H 2 O 

PCR Grad 

(µl) 

Gesamt 

(µl) 

3 20% 9 24,3 11,7 45,0 

4 20% 12 32,4 15,6 60,0 

5 20% 15 40,5 19,5 75,0 

6 20% 18 48,6 23,4 90,0 

7 20% 21 56,7 27,3 105,0 

8 20% 24 64,8 31,2 120,0 

9 20% 27 72,9 35,1 135,0 

10 20% 30 81,0 39,0 150,0 

11 20% 33 89,1 42,9 165,0 

12 20% 36 97,2 46,8 180,0 

13 20% 39 105,3 50,7 195,0 

14 20% 42 113,4 54,7 210,1 

15 20% 45 121,5 58,6 225,1 

16 20% 48 129,6 62,5 240,1 

17 20% 51 137,7 66,4 255,1 

18 20% 54 145,8 70,3 270,1 

19 20% 57 153,9 74,2 285,1 

20 20% 60 162,0 78,1 300,1 

21 20% 63 170,1 82,0 315,1 

22 20% 66 178,2 85,9 330,1 

23 20% 69 186,3 89,8 345,1 

24 20% 72 194,4 93,7 360,1

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9.3 BD MAX TM Systemamplifikation 

Hinweis: Weitere Informationen hierzu finden Sie in der BD MAX System Bedienungsanleitung. 

9.3.1 Erstellung eines PCR-Tests für Diagenode Flu A/B 

Hinweis : Falls Sie bereits den Diagenode Flu A/B-Test erstellt haben können Sie Schritt 9.3.1 

überspringen und direkt mit Punkt 9.3.2 fortsetzen. 

1. Auf dem « Run » Bildschirm des BD MAX TM Systems wählen Sie das Registerblatt « Test Editor » 

2. Klicken Sie den « Create Test » Button. 

3. Im « Test Name » Fenster benennen Sie Ihren Test: Diagenode Flu A/B. 

4. Beim « Extraction Type » wählen Sie RNA-3. 

5. Wählen Sie bei der « Master Mix Format » Auswahlliste « Research MM, Probes/Primers Add 

Manually». 

6. Bei den « Channel Settings », setzen Sie « Gains » und « Threshold » wie folgt: 

Channel 

475/520 

530/565 

585/630 

630/665 

680/715 

Gain 

40 

80 

60 

0 

0 

Threshold 

100 

150 

250 

0 

0 

7. Im « GuardRail », wählen Sie « Default » 

8. Bei den « Test Details », geben Sie Ihr PCR-Profil ein : 

New Step 

Cycle 

1 

Profile type 

Hold 

Type 

Time (s) 

1800.0 

Temp (°C) 

50.3 

Detect 

 

New Step 

Cycle 

1 

Profile type 

Hold 

Type 

Time (s) 

600.0 

Temp (°C) 

98.0 

Detect 

 

New Step 

Type 

Cycle 

Profile type 

Time (s) 

15.0 

66.0 

45 

2-Temperature 

Temp (°C) 

98.0 

64.0 

Detect 

 

 




9. Klicken Sie auf das « Spectral Cross Talk » Registerblatt und geben Sie den folgenden Paramater ein: 

Excitation 

Channel 

False Receiving Channel 

475/520 530/565 585/630 630/665 680/715 

475/520 2.1 0.0 0.0 0.0 

530/565 1.2 0.0 0.0 0.0 

585/630 0.0 0.0 0.0 0.0 

630/665 0.0 0.0 0.0 0.0 

680/715 0.0 0.0 0.0 0.0 

10. Wählen Sie den « Save Test » Button. 

9.3.2 BD MAX TM Rack Einstellungen 

Weitere Informationen hierzu finden Sie in der BD MAX Gebrauchsanweisung. 

1. Beladen Sie die BD MAX Racks mit der entsprechenden Anzahl an Einzel-RNA-Reagenztreifen 

(URR). Vergewissern Sie sich durch leichtes Anklopfen jedes URR auf eine harte Oberfläche, dass 

sich die Flüssigkeiten am Boden befinden. 

2. Lassen Sie die RNA Extraktionsreagenzienröhrchen (weiße Folie) und die DNase Reagenzienröhrchen 

(gelbe Folie) in ihre jeweiligen Positionen in der URR einrasten. (siehe Abbildung 1). 

3. Pipettieren Sie 12.5 μl des kompletten Master-Mix (vorbereitet in Abschnitt 9.2 in das zum Einrasten 

vorbestimmte RNA Röhrchen (Position 3) des RNA URR. Vergewissern Sie sich, dass keine 

Luftbläschen bestehen und, dass sich die Flüssigkeit am Boden des Röhrchens befindet. 

4. Pipettieren Sie für die Positivkontrollprobe des URR 1 μl der Positivkontrolle (grünes Röhrchen) in 

das dafür vorgesehene RNA Röhrchen (Position 3) zusätzlich zum Master-Mix.

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9.3.3 BD MAX TM Instrumenteinstellung 

1. Wählen Sie die Registerkarte auf dem Bildschirm des BD MAX Systems. 

2. Wählen Sie In der “Assay” Auswahlliste den Diagenode Flu A/B (falls dieser noch nicht erstellt wurde 

gehen Sie bitte zum Abschnitt 9.3.1). 

3. Geben Sie den Barcode des Probenvorbereitungsreagenzienröhrchens für jede entsprechende 

Probe/Patienten oder kontrollieren Sie diesen per Barcodescanner oder manuell. Beginnen Sie mit 

Position 1 des Rack A. 

4. Bringen Sie das Probenvorbereitungsreagenzienröhrchen in seine entsprechende Position im BD 

MAX TM Rack(s). 

5. Geben Sie die Informationen zur Identifikation der Proben/Patienten in die Arbeitsliste ein, entweder 

per Barcodescanner oder manuelle Eingabe. Setzen Sie diesen Vorgang fort bis alle 

Probenvorbereitungsreagenzienröhrchen eingegeben wurden. Vergewissern Sie sich, dass die 

Proben/Patienten-ID und Probenvorbereitungsreagenzienröhrchen richtig übereinstimmen. 

6. Laden der Rack(s) in das BD MAX System (Rack A befindet sich auf der linken Seite des BD MAX 

System und Rack B auf der rechten Seite). 

7. Laden Sie die BD MAX TM PCR Kartusche(n). 

8. Schließen Sie die Tür des BD MAX System. 

9. Klicken Sie auf “Start Run”. 

1. Klicken Sie im Hauptmenü auf den “Results” Button. 

2. Doppelklick auf den Durchlauf in der Liste und klicken Sie auf das neue Registerblatt “Run …..” 

3. Im “Print” Registerblatt, wählen Sie: Result 

Protocol Details 

PCR 

4. Klicken Sie auf “Create Report” und dann auf den “Print Report” Button. 

Ergebnisinterpretation 

1. Damit ein Durchlauf gültig ist: 

a. Es darf keine BD MAX Systemausfälle geben. 

b. Die Negativkontrolle hat einen CT-Wert von -1 für alle Kanäle außer 585/630. 

c. Die Positivkontrolle hat einen CT-Wert von 30 ± 3.3 für die Kanäle 475/520, und 530/565. 

2. Falls der Durchlauf gültig ist, bewerten Sie die Probenergebnisse wie in der folgenden Grafik 

beschrieben: 

a. Ein CT-Wert von 0 bedeutet, dass kein CT-Wert berechnet wurde und die Probenkurve manuell 

überprüft werden muss um mit einer Anpassung der Grenzwertlinie einen neuen CT-Wert zu 

berechnen. 

b. Ein CT-Wert von -1 bedeutet, dass keine Verstärkung passiert ist. 

c. Jeder andere CT-Wert (ANY) muss in Korrelation mit PCR-Kurven ("PCR Analyse" Tab) und nach 

folgender Tabelle interpretiert warden : 




CT 475/520 CT 530/565 

CT 

585/630 

Ergebnisinterpretation 

-1 -1 ≤ 36 Atemwegsgrippe A und Atemwegsgrippe B RNA nicht 

erkannt. 

ANY -1 ANY Atemwegsgrippe A RNA erkannt. 

-1 ANY ANY Atemwegsgrippe B RNA erkannt. 

ANY ANY ANY Atemwegsgrippe A und Atemwegsgrippe B RNA erkannt. 

-1 -1 > 36 

Or -1 

Hemmende Proben* 

Hier kann keine Diagnose abgleitet werden. 

*Für hemmende Proben: Wiederholen Sie den Test mit den ursprünglichen Proben, die Sie zwischen 

2-8°C gelagert haben, indem Sie ein neues Probenvorbereitungsreagenzienröhrchen mit verdünnten 

(mit PBS) oder unverdünnten Proben vorbereiten. Alternativ können Sie eine neuentnommene Probe 

testen.

Seite | 15 

Beschreibung Mögliche Ursachen Korrekturmaßnahmen 

PCR wird durch exogene 

oder endogene 

Probentest wiederholen. 

Substanzen gehemmt 

Ziel- und interne Kontrolle verstärken 

sich nicht. 

Das Ziel verstärkt sich, aber nicht die 

interne Kontrolle. 

Spikes treten in allen 

Verstärkungskurven gleichzeitig auf. 

Sehr geringe Fluoreszenz in allen 

Proben, auch der internen Kontrolle 

Liquid-Handling 

Probleme 

Das Ziel hat die interne 

Kontrolle während der 

Reaktion um die 

Ressourcen gebracht. 

Spannungsschwankungen 

Primer oder 

Sondenverfall 

Problem mit dem 

Instrument 

Überprüfen Sie die URR und 

Mikrofluidik-Kartusche um festzustellen, 

wo die Liquid-Handling Probleme 

aufgetreten sind und wiederholen Sie die 

Probe. Falls das Problem weiter besteht 

kontaktieren Sie Ihren lokalen BD- 

Vertreter. 

Verifizieren Sie, dass die Probe eine 

Frühversorgung hat. 

Überprüfen Sie, dass das System mit 

dem USV verbunden ist 

(Unterbrechungsfreie Stromversorgung) 

Prüfen Sie das Verfallsdatum des Kits 

und ob das das Kit korrekt gelagert 

wurde. 

Näheres entnehmen Sie bitte dem BD 

MAX Benutzerhandbuch 

Nähere Informationen entnehmen Sie bitte dem Teil zur “Problemlösung” im BD MAX TM System 

Benutzerhandbuch. 

Bei weiteren Fragen zu Problemlösung und Problembehebung kontaktieren Sie bitte Ihren lokalen 

BD Vertreter oder den Diagenode Kundendienst. 




12.1 Analytische Sensitivität unter Berücksichtigung der Reinigung 

Die analytische Nachweisgrenze unter Berücksichtigung der Reinigung (Sensitivitätslimit) wurde für das 

Diagenode Atemwegsgrippe A/B Echtzeit-PCR-Kit in einem ESwab Liquid Amies Medium und in einer 

Matrix für nasopharyngeale Absaugung (NPA) bestimmt. Die analytische Nachweisgrenze unter 

Berücksichtigung der Reinigung wird unter der Verwendung von quantifizierten, inaktiven Grippe A/B 

Erregern bestimmt. 

Um die analytische Sensitivität des Diagenode Atemwegsgrippe A/B Echtzeit-PCR-Kit für die Erkennung 

von Atemwegsgrippe A in ESwab und nasopharyngealer Matrix zu bestimmen, wurden die 

Atemwegsgrippe A Verdünnungsreihen dementsprechend von 1 500 bis 12 Kopien/ml in einem Liquid 

Amies Medium und in einem Pool von Atemwegsgrippe A-negativen nasopharyngealen Abstrichen 

gesetzt. 

Um die analytische Sensitivität des Diagenode Atemwegsgrippe A/B Echtzeit-PCR-Kit für die Erkennung 

von Atemwegsgrippe B in ESwab und nasopharyngealer Matrix zu bestimmen, wurden die 

Atemwegsgrippe B Verdünnungsreihen dementsprechend von 3 250 bis 25 Kopien/ml in einem Liquid 

Amies Medium und von 5.000 zu 39 Kopien/ml in einem Pool von Atemwegsgrippe B-negativen 

nasopharyngealen Abstrichen gesetzt. 

Die Proben wurden mit dem BD MAX-System in Verbindung mit dem Diagenode Atemwegsgrippe A/B 

Echtzeit-PCR-Kit analysiert. Das Testen wurde an 3 verschiedenen Tagen mit 12 Replikaten 

durchgeführt. 

Die LOD-Berechnungen wurden durch eine Probit-Analyse bestimmt. Analytische Sensitvität (LOD), 

definiert als die niedrigste Konzentration bei der ≥ 95% der Replikate positiv getestet werden, wird in 

der folgenden Tabelle angegeben. 

Test Matrix LOD 

Atemwegsgrippe A ESwab 170 k/ml 

NPA 

614 k/ml 

Atemwegsgrippe B ESwab 1 719 k/ml 

NPA 

1 271 k/ml 

12.2. Präzision 

Die Präzisionsdaten des Diagenode Atemwegsgrippe A/B Echtzeit-PCR-Kit wurden mithilfe des BD 

MAX-Systems gesammelt und ermöglichen die Ermittlung der Variabilität innerhalb eines Durchlaufs 

(=Intra-Test Variabilität) (Variabilität von mehreren Ergebnissen von Proben der selben Konzentration 

innerhalb eines Experiments) und der Variabilität zwischen den Durchläufen (=Inter-Test Variabilität) 

(Variabilität von mehreren Ergebnissen des Tests über vier Durchläufe, die an 3 verschiedenen Tagen 

durchgeführt wurden) des Diagenode Atemwegsgrippe A/B Echtzeit-PCR-Kit im BD MAX System. Die 

gesammelten Daten wurden verwendet um die Standardabweichung und den Variationskoeffizient des 

jeweiligen Erregers sowie der internen PCR-Kontrolle zu bestimmen. 

Die Präzisionsdaten des Diagenode Atemwegsgrippe A/B Echtzeit-PCR-Kit im BD MAX System wurden 

mithilfe von ESwabs und einer nasopharyngealen Aspiraten-Matrix versetzt mit einer niedrigen 

Konzentration (Konzentration auf das LOD beschränkt in Anbetracht der Extraktion der betroffenen 

Erreger in der entsprechenden Matrix) von inaktiven Erregern von Atemwegsgrippe A und 

Atemwegsgrippe B gesammelt.

Seite | 17 

Das Testen wurde mithilfe von 12 Replikaten (4x3 Replikate je Durchlauf) durchgeführt. Die 

Präzisionsdaten wurden auf Basis von Ct-Werten der Amplfikationskurven wiefolgt berechnet: 

Intra-Test Abweichung = mittlerer Variationskoeffizient (CV) jedes einzelnen Durchlaufs 

Inter-Test Abweichung = CV des mittleren Ct-Werts jedes einzelnen Durchlaufs. 

Die Ergebnisse werden in der unten folgenden Tabelle angeführt. 

Test Matrix Erregerkonzentration Mittlerer Ct Standardabweichung¹ 

Variationskoeffizient 

(%)² 

Intra-Test 

ESwab 188 k/ml 31 0.69 2.26 

Atemwegsgrippe A NPA 750 k/ml 31 0.56 1.85 

Inter-Test 

ESwab 188 k/ml 31 0.84 2.70 

Atemwegsgrippe A NPA 750 k/ml 31 1.17 3.76 

Intra-Test 

ESwab 3250 k/ml 30 0.40 1.34 

Atemwegsgrippe B NPA 3250 k/ml 30 1.12 3.65 

Inter-Test 

ESwab 3250 k/ml 30 0,57 1.90 

Atemwegsgrippe B NPA 2500 k/ml 30 0.52 1.73 

Intra-Test IC ESwab NA 25 0.31 1.21 

NPA NA 27 0.66 2.50 

Inter-Test IC ESwab NA 25 0.35 1.38 

NPA NA 27 0.57 2.13 

¹ Werte beziehen sich auf die mittlere Standardabweichung jedes einzelnen Durchlaufs für Intra-Test 

Variabilität und auf die Standardabweichung des mittleren Ct-Werts jedes einzelnen Durchlaufs für 

Inter-Test Abweichung. 

² Werte beziehen sich auf die mittleren Variationskoeffizienten jedes einzelnen Durchlaufs für Intra-Test 

Variabilität und auf den Variationskoeffizienten des mittleren Ct-Werts jedes einzelnen Durchlaufs für 

Inter-Test Abweichung. 

12.3 Analytische Spezifität 

Die Spezifizität des Diagenode Grippe A/B Echtzeit-PCR-Kits wird zunächst und vor allem durch die 

Selektion der Primer und Sonden gewährleistet, als auch durch die Selektion von strengen 

Reaktionsbedingungen. Die Primer und Sonden wurden mittels Sequenzverwandtschaftsanalyse auf 

mögliche Homologien zu von Genbanken veröffentlichten Sequenzen überprüft. 

Um die experimentelle Spezifizität des Diagenode Grippe A/B Echtzeit-PCR zu bestimmen wurden die in 

der folgenden Tabelle angeführten Erreger auf Kreuzreaktivität getestet. Für keine der getesteten 

Erreger konnte eine Kreuzreaktivität gefunden werden. 

Erreger 

Bordetella pertussis 

Bordetella parapertussis, Stamm 522 

Bordetella bronchiseptica, Stamm RB50 

Haemophilus influenzae 

Mycoplasma genitalium 

Chlamydophila pneumoniae 

Legionella pneumophila, Stamm 1 

Adenovirus 5, Stamm Adenoid 75 

Streptococcus pneumoniae 

Streptococcus pyogenes, Stamm T1 

Staphylococcus aureus 

Pseudomonas aeruginosa, Stamm PRD-10 




Klebsiella pneumoniae, Stamm K6 

Enterococcus faecalis, Stamm V583 

Burkholderia cepacia, Stamm 249 

Menschliches Coxsackievirus B4 

Menschliches Coronavirus 229E 

Echovirus 7 

Masern 

Mumps 

Menschliches Parechovirus 

12.4 Klinische Leistungsfähigkeit 

Die Charakteristika zur Leistungsfähigkeit des Diagenode Atemwegsgrippe A/B Echtzeit-PCR-Kits 

wurden während einer retrospektiven Studie in einem Referenzlabor im Vergleich zu einem 

validierten PCR-Referenzverfahren bestimmt. 

Insgesamt 177 Proben (93 Atemwegsgrippe A-B-, 38 Atemwegsgrippe A+B- und 46 Atemwegsgrippe A- 

B+) wurden retrospektive mit dem Diagenode Atemwegsgrippe A/B Echtzeit-PCR-Kit im BD MAX- 

System getestet. Die Proben bestanden aus 126 pharyngealen/nasopharyngealen Abstrichen, 18 

nasopharyngealen Aspiraten und 33 Proben verschiedener Herkunft (siehe Tabelle). Die Proben wurden 

zunächst in MagNa-Pure extrahiert und dann mithilfe eines PCR-Referenzverfahrens Kombination mit 

dem LC480 Roche PCR-System und dem LC480-Sonden-Master-Mix analysiert. 

17 ungültige Proben, davon 9 Abstriche (keine interne Kontrollerkennung) wurden von der statistischen 

Analyse ausgenommen. Die diagnostische Sensitivität und die diagnostische Spezifizität wurden für 

Atemwegsgrippe A und Atemwegsgrippe B berechnet. Die Ergebnisse sind in den folgenden Tabellen 

zusammengefasst: 

Atemwegsgrippe A alle Probentypen 

Atemwegsgrippe A nur Abstriche 

Atemwegsgrippe A/B-Kit 


Positiv Negativ Positiv Negativ 

Referenzmethode 

Positiv 

Negativ 

34 1 

1 124 


Positiv 

Negativ 

24 1 

1 91 

Positive Regelung (Sensitivität): 97% 

Negative Regelung (Spezifizität): 99% 

Unbestimmte Rate: 0.6% 



Unbestimmte Rate: 7.2%

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Atemwegsgrippe A andere Probenarten: 

Atemwegsgrippe B alle Probentypen 

Atemwegsgrippe B nur Abstriche 



Positiv Negativ Positiv Negativ 


Positiv 

Negativ 

40 2 

7 111 


Positiv 

Negativ 

25 2 

6 84 







Atemwegsgrippe B andere Probenarten: 

N Unbestimmte Pos Neg + Regelung -Regelung 

Rate (%) 

NPA 18 2 (11) 3 13 3/3 13/13 

Sekretion 9 2 (22) 1 6 1/1 6/6 

BAL 7 0 0 7 na 7/7 

Sputum 8 3 (38) 4 1 4/4 1/1 

Mund- 

3 0 1 2 1/1 2/2 

/Halsspülwasser 

Biopsie 3 0 1 2 1/1 2/2 

Nasenrachen- 1 1 

spülwasser 

Sonstige 2 2 0 2 2/2 

N Unbestimmte Pos Neg + Regelung - Regelung 

Rate (%) 

NPA 18 2 (11) 12 4 12/12 3/4 

Sekretion 9 2 (22) 1 6 1/1 6/6 

BAL 7 0 1 6 1/1 6/6 

Sputum 8 3 (38) 0 5 NA 5/5 

Mund- 

3 0 0 3 NA 3/3 

/Halsspülwasser 

Biopsie 3 0 0 3 NA 3/3 

Nasenrachen- 1 1 

spülwasser 

Sonstige 2 0 1 1 1/1 1/1 




• Alle Reagenzien dürfen ausschließlich für in vitro Diagnostik genutzt werden. 

• Eine strikte Einhaltung der Benutzungsanleitung ist für die Erzielung optimaler Ergebnisse nötig. 

• Dieser Test wurde für die Verwendung von durch ESwabs gesammelte nasopharyngeale Abstriche 

validiert. 

• Dieser Test wurde für die Verwendung mit dem BD MAX TM System validiert. 

• Negative Ergebnisse schließen Infektion nicht aus und sollten nicht als alleinige Grundlage für 

Diagnose, Behandlungs- oder Managemententscheidungen verwendet werden. 

• Die Erkennung von viralen Nukleinsäuren hängt von vorangehender korrekter Entnahme, 

Handhabung, Transport, Lagerung und Vorbereitung der Proben ab. Das Verabsäumen der 

Befolgung korrekter Prozeduren bei jeglichem dieser Schritte kann zu inkorrekten Ergebnissen 

führen. Es besteht das Risiko von falschen Negativwerten durch unsachgemäß gesammelte, 

transportierte oder gehandhabte Proben. 

• Es besteht das Risiko von falschen Negativwerten durch die Präsenz von Sequenz-Varianten in den 

viralen Targets des Verfahrens, prozeduralen Fehlern, Amplifikationsinhibitoren in Proben, oder 

inadäquater Anzahl von Organismen zur Amplifikation. 

• Falsche negative Ergebnisse können durch den Verlust von Nukleinsäure auftreten. Die 

Inhibitionskontrolle wurde zum Test hinzugefügt um bei der Identifikation von Proben die 

Inhibitoren zur PCR-Amplifikation beinhalten zu helfen. Die Kontrolle trifft keine Aussage darüber, 

ob Nukleinsäure durch inadäquate Sammlung, Transport oder Lagerung von Proben verloren wurde 

oder nicht. 

• Es besteht das Risiko von falschen Positivwerten durch die Kreuzkontamination durch 

Zielorganismen, deren Nukleinsäure oder amplifiziertes Produkt, oder ein nicht spezifisches 

Ergebnis im Verfahren zu bilden. 

Diagenode hat das ISO 9001 und das ISO 13485 Zertifikat für Design, Herstellung und Verkauf von IVD 

Geräten mit Nukleinsäuretechnologie für Infektionskrankheiten erhalten. 

Das Diagenode Atemwegsgrippe A/B Echtzeit-PCR Kit ist auf zuvor festgelegte Spezifikationen hin 

überprüft um Produktqualität zu garantieren. 

1. FLU.gov. (2011). The Current Flu Situation. Abgerufen von 

http://www.flu.gov/individualfamily/about/current/index.html 

2. Centers for Disease Control and Prevention [CDC]. (2011). CDC Features: Flu Season is Here – 

Vaccinate. Abgerufen von http://www.cdc.gov/Features/FLU/ 

3. Centers for Disease Control and Prevention [CDC]. (2011). Seasonal Influenza (Flu). People at High 

Risk of Developing Flu-Related Complications. Abgerufen von 

http://www.cdc.gov/flu/about/disease/high_risk.htm

Seite | 21 

Katalognummer 

Chargencode 

Ausreichend für 

Obere Temperaturgrenze 

Zu verwenden bis jjjj-mm 

In vitro-diagnostisches Medizinprodukt 

Gebrauchsanweisung beachten 

Biologisches Risiko 

Kontrolle 

Negativkontrolle 

Positivkontrolle 

Vor direkter Sonneneinstrahlung schützen 

Hersteller 




Dieses Produkt ist für die Verwendung in der Polymerase Kettenreaktion (PCR) vorgesehen, welche durch Patente 

der Roche Molecular Systems, Inc., und F. Hoffmann-La Roche ltd. (Roche) geschützt wird. Durch den Kauf 

dieses Produktes werden weder direkt noch indirekt Lizenzrechte zur Nutzung des PCR-Verfahrens 

erworben. 

Eine Lizenz zur Verwendung des PCR-Prozess für bestimmte Forschung- und Entwicklungstätigkeiten 

geht mit dem Kauf bestimmter Reagenzien von lizenzierten Lieferanten einher, wenn diese in 

Kombination mit einem genehmigten Thermalzykler verwendet werden bzw. sind diese erhältlich durch 

Applied Biosystems. Für weitere Informationen zum Erwerb von Lizenzen zur Durchführung des PCR-Prozess wenden 

Sie sich an den Director of Licensing bei Applied Biosystems, 850 Lincoln Center Drive, Foster City, California 

94404 oder an Roche Molecular Systems, Inc, 1145 Atlantic Avenue, Alameda, California 94501. 

• Das BD MAX TM System ist ein Warenzeichen der Becton, Dickinson and Compagny. 

MA-FluAB-BD-DE-v1_24_10_12 

Diagenode s.a. 

Avenue de l’hôpital, 1 • Tour GIGA, 3 Stock • 4000 Liège • Belgien 

Telefon: +32 4 364 20 50 • Fax: +32 4 364 20 51 • info@diagenodediagnostics.com

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Diagenode sa 

CHU, Tour GIGA, 3. Stock 

Avenue de l’hôpital, 1 

4000 Liège (Sart Tilman) 

BELGIEN 

Tel. +32 4 364 20 50 

info@diagenodediagnostics.com 

www.diagenodediagnostics.com

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