SS 2005 BIOCHEMISCHE ARBEITSMETHODEN für Biologen ...

SS 2005
BIOCHEMISCHE ARBEITSMETHODEN
für Biologen
Versuchsvorschriften zum
Praktikumsblock BB 01
Version 1.3
26.09. bis 07.10. 2005
Betreuer : Dr. Thomas Jostock (e-mail: t.jostock@tu-bs.de)
Dipl. Biotech. Bernd Voedisch
Dipl. Biotech. Christian Menzel
Dipl. Biotech. Nina Strebe
BTA Doris Meier
BTA Saskia Helmsing
stud. biotech. Christoph Otreba

Inhaltsverzeichnis
1. Isolierung von Alkohol-Dehydrogenase aus Bäckerhefe 4
1.1 Allgemeines 4
1.2 Gewinnung eines ADH-Rohextrakts aus Bäckerhefe 6
1.2.1 Aufschluß der Hefezellen 7
1.2.2 Hitzedenaturierung von Fremdprotein 9
1.2.3 Fraktionierte Ammoniumsulfatfällung 9
1.2.4 Ermittlung des Fraktionierungsbereiches für die Fällung der ADH durch
Ammoniumsulfat 10
1.2.5 Dialyse
1.3 Äktaprime: Ein Gerät für die FPLC 11
1.4 Anionenaustauschchromatographie (DEAE Sepharose) 13
1.4.1 Allgemeines 13
1.4.2 Aufreinigung von ADH mittels Anionenaustausch-Chromatographie 14
1.5 Affinitätschromatographie 16
1.5.1 Allgemeines 16
1.5.2 Aufreinigung von ADH mittels Affinitätschromatographie 17
1.6 Aktivitätstest 18
1.7 Proteinbestimmung 20
2. ELISA 21
2.1 Allgemeines 21
2.2 Lösungen 22
2.4 Pipettierschema 23
2.5 Durchführung 23
2.6 Auswertung 23
3. Diskontinuierliche Gelelektrophorese und Western Blot 24
3.1 Allgemeines 24
3.2 Probenaufarbeitung 25
3.2 Gelvorbereitung 26
3.3 Elektroblot 28
3.4 Antikörpernachweis 29
4. Zweidimensionale (2D)-Gelektrophorese 31
4.1 Allgemeines 31
4.2 2D-Gelelektrophorese 32
4.2.1 1. Dimension 32
4.2.2 2. Dimension 34
4.2.3 Silberfärbung 35
2

Entsorgungshinweise:
Folgende Sammelgefäße (Abzug) nach Versuchsende benutzen:
A: Lösungen mit organischen Lösungsmitteln
B: Ethidiumbromid- Abfälle
C: Schwermetallhaltige Abfälle
3

1. Isolierung von Alkohol-Dehydrogenase aus Bäckerhefe
1.1 Allgemeines
In diesem Teil des Praktikums soll das Enzym Alkohol-Dehydrogenase aus Bäckerhefe (Saccharomyces
sp.) aufgereinigt werden. Da das Enzym relativ temperaturstabil ist, läßt es sich unter „Praktikums-
bedingungen“ recht unproblematisch bearbeiten. Die Alkohol-Dehydrogenase gehört laut EC-System
(enzyme classification of the International Union of Biochemistry; IUB) der ersten Klasse, den
Oxidoreduktasen, an. Die ADH ist bei Hefen ein weitverbreitetes Enzym. Es ist in der Lage, Alkohole in
Aldehyde bzw. Ketone umzuwandeln. Diese Oxidation ist Coenzym abhängig. Der bei der Oxidation des
Alkohols freiwerdende Wasserstoff wird auf NAD + übertragen:
R2CHOH + NAD + R2C=O + NADH + H +
Die Aktivität wird optisch bestimmt. Im NADH ist der aromatische Charakter des Pyrimidinrings
aufgehoben; dadurch ändert sich das Absorptionsverhalten. NADH besitzt ein zweites
Absorptionsmaximum bei 340nm. Die Zunahme der Absorption pro Zeiteinheit für den Übergang von
NAD + zu NADH ist ein direktes Maß für die Reaktionsgeschwindigkeit.
Abbildung 1.1: Absorption der oxid. und red. Nicotinamidnucleotide NAD bzw. NADP im UV-
Bereich.
4

Die katalytische Aktivität eines Enzyms wird nach Empfehlung der IUB in Katal [kat] angegeben. Sie ist
definiert als diejenige Enzymmenge, die unter den für das Enzym festgelegten Bedingungen bei 30 0 C den
Umsatz von 1 Mol Substrat pro Sekunde katalysiert (1 kat = 1 Mol Substrat • s -1 ). Veraltet, aber ein leider
noch häufig in der Literatur oder in Chemikalienkatalogen zu findender Begriff, ist das Unit (1 U = 1 μMol
Substrat • min -1 = 16.66 nkat). Der die Qualität einer Enzymaufreinigung beschreibende Wert ist die
spezifische Enzymaktivität [kat • g -1 Protein], da hier die Proteinkonzentration mit berücksichtigt wird.
Das Verhältnis der spezif. Aktivität einer Enzymfraktion nach einem Aufreinigungsschritt zur spezif.
Aktivität der Ausgangslösung bestimmt den Aufreinigungsfaktor des Aufreinigungsschrittes.
Aufreinigungsstufe Spezif. Aktivität
[nkat/mg]
Aufreinigungsfaktor Ausbeute
Rohaufschluß 0,68 1,0 100
Hitze/EtOH-Behandlung 1,17 1,7 54
Dialyse 1,87 2,7 54
Anionenaustauschchr. pH 6.5 17,0 25,0 12,4
Anionenaustauschchr. pH 7.5 132,0 194 9,2
Konzentrierung 153,0 225,0 3,6
Gelfiltration 273,0 401,0 2,3
Abbildung 1.2: Beispiel einer Aufreinigungstabelle
Die Ausbeuten einer Enzymaufreinigung werden über die volumetrische Aktivität [kat • ml -1 ] berechnet
(als Beispiel siehe Aufreinigungstabelle Abbildung 1.2). Wenn also in z.B. 300 ml Rohextrakt 6 nkat/ml
Aktivität vorhanden waren (→insgesamt 1800 nkat) und nach einem anschließenden Fällungsschritt das
Pellet in 50 mL Puffer mit einer vol. Aktivität von 26.3 nkat/ml aufgenommen wurde (→insgesamt 1315
nkat), so beträgt die Ausbeute nach der Fällung 73.05%.
Der Erfolg einer Enzymaufreinigung hängt stark mit den Stabilitätseigenschaften des Enzyms zusammen.
Extrazelluläre Enzyme sind naturgemäß stabiler als intrazelluläre und die wiederum stabiler als
membrangebundene Enzyme (extr. E > intr. E > membr. E). Dementsprechend versucht man von Beginn
an das zu bearbeitende Enzym vor inaktivierenden Einflüssen zu schützen und dessen „natürliche
Umgebung“, in der es aktiv ist, zu imitieren. Das heißt, man hält Enzymlösungen bei konstantem pH-Wert
solange wie möglich im Eisbad und gibt, je nach Enzym, Zusätze wie a) Zucker (0.05 -0.2 M), b) EDTA
(1.5 mM), c) Salze (in der Zelle liegt die Ionenstärke um 0.15 - 0.2 M), d) Mercaptoethanol oder Cystein
(5 - 20 mM) und/oder e) spezifische, stabilisierende Agenzien für bestimmte Enzyme wie Zn 2+ für
zinkabhängige Proteine oder Pyridoxalphosphat für pyridoxalphosphat-abhängige Enzyme hinzu.
5
[%]

Zellaufschluß und Entwicklung
einer Aufreinigungsstrategie
Grundkenntnisse zur
Stabilität
Abtrennung
der Zelltrümmer
Grobreinigung
(Fällung, Ultrazentrifugation)
Feinreinigung
(Chromatographische Methoden)
Konzentrierung und
Konfektionierung
Abbildung 1.3: Arbeitsschema zur Aufreinigung eines intrazellulären Enzyms
Während des Praktikums sollte darauf geachtet werden, dass die Enzymlösungen gekühlt und die
Zusätze langsam zugegeben werden (Vermeidung starker Konzentrationsgradienten). In der Literatur
werden eine Vielzahl von verschiedenen Aufreinigungsmethoden beschrieben (z.B. SCOPES 1987). Je
mehr Fremdprotein bei größtmöglichem Erhalt der Enzymaktivität abgetrennt wird, desto effektiver der
Reinigungsschritt. Für intrazelluläre Enzyme lässt sich das in Abbildung 1.3 gezeigte Arbeitsschema zur
Aufreinigung eines „neuen“ Enzyms anwenden.
1.2 Gewinnung eines ADH-Rohextraktes aus Bäckerhefe
Jede Praktikumsgruppe wird, ausgehend von ganzen Zellen, die Alkohol-Dehydrogenase über
Hitzedenaturierung von Fremdprotein, über eine Fällung und Dialyse sowie über zwei
säulenchromatographische Methoden aufreinigen. Die Beurteilung der Qualität dieser Aufreinigung wird
anhand einer zu erstellenden Aufreinigungstabelle und einer elektrophoretischen Überprüfung der
Aufreinigungsschritte zu bewerten und zu diskutieren sein. ⇒ Dementsprechend müssen jeweils von den
Ausgangs- und Endextrakten der einzelnen Aufreinigungsschritte Proben aufgehoben (beschriften → für
die Elektrophorese, Proben NIE ohne Rücksprache wegwerfen!) und Aktivitätstests sowie
Proteinbestimmungen durchgeführt werden (nötig für die Aufreinigungstabelle).
6

Wichtig: Um die Aufreinigung des Enzyms in den einzelnen Schritten über-
prüfen zu können, wird aus den im nachfolgenden schematischen
Versuchsablauf mit * markierten Fraktionen jeweils 1ml entnommen. Diese Proben
dienen zur Proteinbestimmung und zum Test auf ADH-Aktivität. Ferner ist es wichtig,
die Volumina der Fraktionen zu bestimmen und zu notieren!
1.2.1 Aufschluss der Hefezellen
Zur Aufreinigung intrazellulärer Enzyme müssen zuerst die Zellwände der Mikroorganismen bzw. der
pflanzlichen oder tierischen Zellen zerstört, zumindest jedoch permeabilisiert werden. Gleichzeitig sollte
die Aktivität des freigesetzten Enzyms erhalten bleiben. Einen Überblick über die in der Biochemie
verwendeten Methoden gibt Abbildung 1.4. Industriell kommen davon hauptsächlich zwei Methoden zum
Einsatz; die Nassvermahlung in schnelllaufenden Rührwerkskugelmühlen und der Aufschluss durch
drastische Druckdifferenzen in Hochdruckhomogenisatoren. Im Labor können alle hier vorgestellten
Methoden zum Einsatz kommen.
Zellaufschluß
Mechanische Methoden Nicht mechanische Methoden
Scherkräfte in Scherkräfte in
Festsubstanz Lösung
Druck,
Vermahlen
Rühren,
Druck,
Schall
Abbildung 1.4: Zellaufschlussmethoden
Lyse Trocknung
Physikalisch Biochemisch
Osmotischer
Schock,
Einfrieren-
Auftauen
Lysozym u.ä.
Enzyme,
Antibiotika,
Phagen,
Detergentien
Benötigte Lösung:
Zellaufschlusspuffer: 50 mM KH2PO4/K2HPO4, 3 mM EDTA, pH 8.0 2 l
Gefriertrocknung,
Lufttrocknung,
Entspannung,
Trocknung mit
Lösungsmitteln
-
Eine wässrige Lösung von Dihydrogenphosphat (H2PO4 ) hat einen sauren, eine Lösung von
2-
Hydrogenphosphat (HPO4 ) einen basischen pH-Wert. Phosphatpuffer werden durch das Mischen der
- 2-
wässrigen Salzlösungen von H2PO4 und HPO4 gleicher Molarität hergestellt.
7

Da im Praktikum meist Kaliumphosphatpuffer mit basischem pH-Wert (pH 8,0) verwendet werden,
werden zur Herstellung der Puffer zunächst mindestens 80% des gewünschten Endvolumens in Form
von K2HPO4-Lösung vorgelegt und am pH-Meter KH2PO4-Lösung zudosiert, bis der gewünschte pH-
Wert des Puffers erreicht ist.
Für den in Versuch 1 verwendeten Zellaufschlusspuffer (50 mM Kaliumphosphatpuffer + 3 mM EDTA,
pH 8,0) wird das EDTA in 50 mM K2HPO4 gelöst. Da EDTA selbst pH-aktiv ist, ergibt sich bei diesem
Puffer der Endwert direkt – die Kontrolle erfolgt am pH-Meter.
Die Rührwerkskugelmühle wird mit ca. 400 ml Glaskugeln (∅ 0.75-1 mm) gefüllt, anschließend wird eine
20%ige Zellsuspension (ca. 1 l) in Aufschlusspuffer unter Kühlung durch die Rührwerkskammer gepumpt.
Dieser Vorgang wird 3x wiederholt, nach jedem Durchlauf wird eine 1 ml Probe entnommen und die
Enzymaktivität bestimmt. Insgesamt lassen sich so ca. 800 mL Homogenat gewinnen. Jede Gruppe
erhält 100 ml des Homogenats.
Schema zum Versuchsablauf: *: Proben nehmen !
Proben der einzelnen Durchläufe aus Rührwerkskugelmühle
(H1-H4) * 1.
aufgeschlossene Hefe in Kalium-
phosphatpuffer rühren ⇒ Homogenat (H) * 2.
⇓
Zentrifugation
⇓
Überstand (Ü0) * / Sediment verwerfen 3.
⇓
Hitzedenaturierung
⇓
Zentrifugation
⇓
Überstand (Ü1) * / Sediment verwerfen 4.
⇓
Fraktionierte Ammoniumsulfatfällung
⇓
Zentrifugation ⇒ Überstand (Ü2) * 5.
⇓
Sediment in Puffer aufnehmen ⇒ Enzymextrakt (E) * 6.
⇓
Dialyse ⇒ entsalzter Enzymextrakt (EE) * 7.
⇓
Säulenchromatographie
8

1.2.2 Hitzedenaturierung von Fremdprotein
• Zentrifugation in der Kühlzentrifuge bei > 28.000 g für etwa 30 Minuten
• Überstand (Ü0) in einem bereits auf 55°C vorgeheizten Wasserbad (Schüttelwasserbad mit
Einsatz für 250 mL Erlenmeyerkolben) schnell erwärmen und 15 Minuten bei dieser
Temperatur belassen; unter fließendem Wasser abkühlen lassen
• Zentrifugation >17.000 g für 30 Minuten bei 4°C / Sediment verwerfen
• Überstand (Ü1) auf Eis kalt stellen und für Ammoniumsulfatfällung einsetzen
(Nicht vergessen: Proben zur Bestimmung der Aktivität und Proteingehalt abnehmen)
1.2.3 Fraktionierte Ammoniumsulfatfällung
Das Löslichkeitsverhalten eines Proteins in einem Lösungsmittel wird durch die Interaktionen seiner
geladenen Oberflächenreste mit den Molekülen des Lösungsmittels bestimmt. Diese Interaktionen
können durch folgende Zusätze manipuliert werden, so dass die Proteine als Aggregate aus der Lösung
ausfallen:
• Zugabe anorganischer Salze • Zugabe organischer Lösungsmittel
• Zugabe basischer Proteine • Zugabe von Polyethylenglycol
• pH Änderung • Temperaturänderung
Die am häufigsten angewandte Methode ist die fraktionierte Fällung durch die Zugabe von anorganischen
Salzen, meist (NH4)2SO4. Das „Aussalzverhalten“ eines Proteins wird durch Anzahl und Fläche der
hydrophoben Bereiche auf der Proteinoberfläche bestimmt (Seitenketten von Phe, Tyr, Trp, Leu, Ile, Met,
Val). Wenn zur Hydratation eines Salzes immer mehr Wassermoleküle benötigt werden, kommt es zu
häufigeren hydrophoben Wechselwirkungen der Proteine untereinander und zur Bildung von Aggregaten,
die schließlich präzipitieren. Stark apolare Proteine präzipitieren daher bei geringerer Salzkonzentration
als solche, deren Polarität groß ist. Durch Co-Präzipitation unterschiedlicher Proteine ist eine völlige
Aufreinigung selten möglich. Eine Ausnahme ist die Salzfällung der Glycerinaldehydphosphat-
Dehydrogenase (EC 1.2.1.12). Bei pH 6.0 ist das Enzym in 3.2 M (NH4)2SO4 löslich. Durch einen pH-
Shift auf pH 7.5 oder höher kristallisiert das Enzym aus dem Rohextrakt aus.
Benötigte Chemikalien:
fein gemörsertes Ammoniumsulfat
10mM Kaliumphosphat-Puffer, pH 8.0 1 l
Zu 100 mL des erhaltenen Überstandes (Ü1) bei 4°C 21g festes, vorher fein gemörsertes
Ammoniumsulfat (40% Sättigung) in kleinen Portionen (insges. auf ca. 20 min verteilen) unter Rühren
zugeben. Die Lösung für 30 min. stehen lassen und anschließend mit ca. 30.000 x g = 16.000 rpm (SS34
Rotor) für 20 Minuten abzentrifugieren. Das Pellet verwerfen und zum Überstand weitere 14,2 g
Ammoniumsulfat in kleinen Portionen unter Rühren bei 4°C zugeben (55% Sättigung). Wiederum 30 min.
stehen lassen und anschließend bei ca. 30.000 x g (SS34 Rotor) für 20 Minuten abzentrifugieren (nicht
vergessen: Probe Ü2).
9

Pellet in 10mL 10 mM Phosphatpuffer aufnehmen (= Enzymextrakt E, Probe nehmen!) [um möglichst
geringe Verluste zu haben: zunächst das Pellet in einem Teil des Puffers suspendieren; mit einer
Plastikpasteurpipette mehrfach aufsaugen, um eine homogene Verteilung zu erreichen].
1.2.4 Ermittlung des Fraktionierungsbereiches für die Fällung der ADH durch
Ammoniumsulfat
Benötigte Chemikalien:
Rohextrakt aus dem Hitzeschritt (Ü1)
gesättigte Ammoniumsulfatlösung (AS) 66g/100ml
10mM Kaliumphosphat-Puffer pH 8.0 (PP)
100 ml
Durchführung:
Folgende Testreihe ist unter Nutzung von Eppendorf-Reaktionsgefäße als Inkubationsgefäße
anzusetzen:
Röhrchen Ü1 PP AS
(ml) (ml) (ml)
1 0.2 0.8 0
2 0.2 0.5 0.3
3 0.2 0.4 0.4
4 0.2 0.3 0.5
5 0.2 0.2 0.6
Nach einer Inkubationszeit von 30 min. im Eisbad wird die ADH-Aktivität in jedem Röhrchen durch
Entnahme von 10 µl bestimmt. Um Extinktionsänderungen von 0.1 bis 0.2 pro min. zu erzielen, ist eine
Verdünnung von 1:20 bis 1:100 notwendig. Danach werden die Gefäße 5 min. bei 10.000 x g zentrifugiert
und die Aktivität in gleicher Weise im Überstand bestimmt.
Auswertung:
Die Aktivität der ersten Messserie wird in Prozent (bezogen auf Gefäß 1) angegeben. Sie gibt Auskunft
über die Stabilität des Enzyms unter den Inkubationsbedingungen. Die Überstandsaktivität der zweiten
Messserie wird ebenfalls in Prozent, bezogen auf den jeweiligen Wert vor der Zentrifugation, ermittelt.
Hieraus wird der Anteil an ausgefällter ADH (wiederum in [%] angegeben) bestimmt, gegen die
Ammoniumsulfatkonzentration (angegeben in %-Sättigung) aufgetragen und das erhaltenen Resultat
interpretiert.
10

1.2.5 Dialyse
• der Dialyseschlauch (ca. 30 cm; ∅ ca. 1,6 cm, Porengröße 12-14 kD) liegt eingeweicht in
Ethanol vor und muss vor Verwendung gründlich mit Wasser gewaschen werden (Schlauch
nur mit Handschuhen anfassen!)
• anschließend wird ein Ende mit 2 Knoten verschlossen, der Enzymextrakt (E) eingefüllt und
auch das andere Ende verknotet
• der Dialyseschlauch wird in 2L eiskalte Pufferlösung oder dest. H2O eingehängt
• es wird über Nacht auf einem Magnetrührer (Kühlraum) langsam gerührt
• der Dialyseschlauch wird vorsichtig geöffnet, das Dialysat im Messzylinder aufgefangen und
das Volumen bestimmt; dieser entsalzte Enzymextrakt (EE) kann auf die
Anionenaustauschersäule aufgetragen werden (Probe von EE nehmen).
Aktivitätstests und Proteinbestimmung erfolgen wie in Kap. 1.5 und Kap. 1.6 beschrieben.
1.3 ÄKTAprime: Ein Gerät für die FPLC (Fast Protein Liquid
Chromoatography)
ÄKTAprime: Ein Gerät für die FPLC (Fast Protein Liquid Chromoatography)
FPLC-Anlagen bestehen aus Pumpen, Ventilen und Messsonden. Mit ihrer Hilfe werden
Pufferlösungen und flüssige Proben (mobile Phase) über die in Glassäulen gepackten
Chromatographiematrices (stationäre Phase) geleitet. Die Maschine dient zur Automatisierung des
Prozesses. Im folgenden werden grundlegende Prinzipien der FPLC am Beispiel des Flusspfades der
ÄKTAprime erklärt.
Abb. 1.3.1 Aufbau der FPLC-Anlage ÄKTAprime (Amersham/GE Healthcare)
11

Benötigte Pufferlösungen werden in Vorlagegefäßen (A, B) vorrätig gehalten. Über Pufferventile
(Buffer valve) können mehrere, unterschiedliche Puffer gleichzeitig angeschlossen werden (A1, A2, ...,
theoretisch, aber an der ÄKTAprime nicht verwirklicht, auch B1, B2, ...). An der Pumpe (System pump)
wird eine Flussrate eingestellt, mit der die Pumpe die Pufferlösungen durch das System pumpt. Es
kann auch eine Mischung der Puffer A und B eingestellt werden. Dazu wird bei der ÄKTAprime der
„%B-Wert“ gesetzt. Dieser Wert gibt an, welcher prozentuale Anteil des eingestellten Flusses aus dem
Vorlagegefäß B gezogen wird – der Rest des Flusses wird aus Vorlagegefäß A gezogen. Das
Gradientenventil (Gradient switch valve) schaltet entsprechend zwischen den Vorlagen hin und her.
Abb. 1.3.2 Flusspfad bei der FPLC-Anlage ÄKTAprime
Ein Drucksensor (Pressure sensor) überwacht, dass ein eingestellter Maximaldruck nicht überschritten
wird. Das ist notwendig, um ein Platzen von Schläuchen und Säulen oder eine Verdichtung des
Säulenmaterials zu verhindern. Setzt sich die Säule durch Partikel zu oder steigt die Viskosität der
Puffer, so steigt auch der Rückdruck – u.U. so weit, dass die Flussrate verringert werden muss. Ein
Flussbegrenzer (Flow restrictor) weiter hinten im Flusspfad sorgt für einen Mindestdruck im System,
um die Entstehung von Luftblasen zu vermeiden.
Eine zentrale Rolle spielt das Injektionsventil (Injection valve, IV), welches bestimmt, ob der
Flüssigkeitsfluss über die Säule geleitet wird oder nicht.
Abb. 1.3.3 Flusspfad innerhalb des Injektionsventils bei unterschiedlichen Einstellungen
12

Das IV hat sieben unterschiedliche Anschlüsse (Ports), die sich über drei unterschiedliche
Ventilstellungen miteinander verbinden lassen. In der Position LOAD liefert die Systempumpe den
Flüssigkeitsstrom über Port 7 direkt an Port 1 und von dort auf die Säule. In dieser Position lässt sich
über eine Spritze ein chromatographisch zu trennende Probe in die Vorlageschleife (Sample loop)
spritzen. Diese ist ein einfaches Schlauchstück von definiertem Volumen, über das die Probe vor ihrer
Auftrennung im System gelagert werden kann. In der Position INJECT wird der Strom vom Port 7
zunächst über die Probenschleife umgeleitet und deren Inhalt über Port 1 auf die Säule geleitet, um
dort aufgetrennt zu werden. In der dritten Position WASTE gelangt der Flüssigkeitsstrom über Port 7
nicht zum zur Säule führenden Port 1, sondern wird in ein Abfallgefäß umgeleitet.
Auf der Säule (Column) erfolgt die chromatographische Trennung der Probe. Hinter der Säule sitzen
Messzellen, die z.B. die Leitfähigkeit der von der Säule kommenden Flüssigkeit erfassen. Eine UV-
Messzelle erfasst die Absorption bei einer Wellenlänge von 280nm – bei dieser Wellenlänge
absorbieren bekanntlich Proteine. Die Messzellen leiten ihre Messdaten an Schreiber bzw. Computer
zur Protokollierung weiter.
Je nach Bedeutung des von der Säule kommenden Stroms kann die Flüssigkeit in Fraktionen
aufgefangen werden oder in einem (Abfall-)Gefäß gesammelt werden. Dies wird durch das
Fraktionsventil (Flow diversion valve) gesteuert.
Ausgefeilte FPLC-System haben weitere Messzellen, lassen sich über Computer ansteuern und
programmieren, können u.U. mehrere Säulen gleichzeitig oder in Serie ansteuern u.v.m. Die hier
dargestellten Grundzüge sind aber in allen Anlagen wiederzufinden.
1.4 Anionenaustauschchromatographie (DEAE Sepharose)
Wichtig: Alle Puffer für die Säulenchromatographie müssen vor Gebrauch mikrofiltriert
und entgast werden.
1.4.1 Allgemeines
Ionenaustauscher bestehen aus einem unlöslichen Trägermaterial (Matrix), das positiv oder negativ
geladene Gruppen in kovalenter Bindung enthält. Die Ladungen dieser Austauschergruppen werden
durch frei bewegliche Gegenionen kompensiert, welche gegen Ionen gleichen Ladungssinns
reversibel austauschbar sind. Je nach Art des Gegenions unterscheidet man zwischen Anionen und
Kationenaustauscher.
Proteine sind amphotere Polyelektrolyte und lassen sich daher sowohl an Anionen als auch an
Kationenaustauscher reversibel binden. Im pH-Bereich unterhalb seines isoelektrischen Punktes
(pH

Die Bindung eines Proteins am Ionenaustauscher wird durch die Ionenstärke erheblich beeinflusst. Eine
Erhöhung der Salzkonzentration verstärkt die Konkurrenz der Ionen um die Bindungsstelle des
Ionenaustauschers. Gleichzeitig werden die elektrostatischen Eigenschaften des Systems verändert,
wobei die Wechselwirkungen zwischen Ionenaustauscher und Gegenion vermindert werden. Durch
Erhöhung der Ionenstärke werden somit die Bindungskräfte zwischen Ionenaustauscher und adsorbierten
Proteinmolekülen geschwächt. Dieser Effekt wird häufig zur Elution gebundener Moleküle ausgenutzt.
Proteine können auch durch eine Änderung des pH-Wertes in Richtung des isoelektrischen Punktes vom
Ionenaustauscher abgelöst werden.
Abbildung 1.5: Ionenaustausch-Chromatographie
1.4.2 Aufreinigung von ADH mittels Anionenaustausch-Chromatographie
Benötigte Lösungen und Chemikalien:
0,5N HCl (vorhanden)
0,5N NaOH (vorhanden)
2M NaCl (vorhanden)
(Silbernitrat)
Säulenpuffer A:
5mM Kaliumphosphatpuffer pH 8.0 2 l
Säulenpuffer B:
200mM Kaliumphosphatpuffer pH 8.0 2 l
14

Allgemein werden nachfolgende Schritte zur Aktivierung von Anionenaustauschern durchgeführt:
• Säulenmaterial in 15 Volumina 0,5N HCl aufrühren (bezogen auf Trockengewicht (g/v)) und 30
Minuten rühren lassen
• Überstand mit Hilfe einer Glasfritte absaugen und Säulenmaterial mit Wasser waschen bis pH 4
erreicht ist
• Säulenmaterial in 0,5N NaOH weitere 30 Minuten stehenlassen
• nachfolgend waschen bis der Durchlauf nahezu neutral ist
Zur wiederholten Benutzung d.h. Regenerierung des Säulenmaterials kann (in der Säule) mit dem
dreifachen Säulenvolumen 2M NaCl (mikrofiltriert und entgast) gewaschen werden. Anschließend wird
das Natriumchlorid durch Waschen mit Wasser wieder entfernt (Nachweis mit Silbernitrat: durch Zugabe
einer Spatelspitze Silbernitrat zu einer kleinen Menge Waschwasser fällt bei Anwesenheit von Chlorid
AgCl2 aus).
Die in diesem Praktikum zu verwendende DEAE Sepharose liegt entweder aktiviert in alkoholischer
Lösung oder regeneriert in NaCl-Lösung vor. Somit muss man vor Gebrauch sorgfältig mit dest.
Wasser waschen, um das Ethanol bzw. Salz zu entfernen.
Packen der Säule: (wird von Betreuer durchgeführt)
Die vorbereitete DEAE Sepharose wird bei zunächst geöffnetem Auslauf homogen in eine Glassäule
gepackt, bis ein Säulenvolumen von ca. 20 ml erreicht ist anschließend wird mit 2 -3 Säulenvolumina
Puffer A äquilibriert (Flußrate: 1.5 bis 3 ml / Minute). Ca. 75 ml.
Säulenlauf:
Der Enzymextrakt wird auf die Säule gepumpt; maximal 300 mg Protein auftragen. Eluat in einem
Sammelgefäß auffangen (=Fraktion "Vorlauf“). Nach Probenauftragung 2-3 x waschen mit einem
Säulenvolumen des Säulenpuffers A (= Fraktion "Durchlauf"). Anschließend Eluat in Fraktionen
weitersammeln. Elution unter einem
linearen Phosphatgradienten mit 60 mL Puffer A (Startpuffer) und 60mL Puffer B (Endeluent); mit
ca. 60 -100 mL reinem Puffer B nacheluieren.
Aktivitätstests und Proteinbestimmung erfolgen wie in Kap. 1.5 und Kap. 1.6 beschrieben.
Bedingungen:
Säulenfüllung: DEAE-Sepharose
Fraktionsgröße: 5 mL
Enzymauftrags- und Elutionsgeschwindigkeit.: 2mL/min
nach Probenauftrag: linearer Gradient mit 60mL Puffer A
60mL Puffer B
anschließend restliches Protein mit 100% Puffer B entfernen
15

1.5 Affinitätschromatographie
1.5.1 Allgemeines
Die Reinigung eines Moleküls mit Hilfe der Affinitätschromatographie nutzt eine hervorstechende
Eigenschaft der biologischen Makromoleküle aus: Ihre Spezifität. Deshalb ist theoretisch mit dieser
Chromatographie eine vollständige Reinigung zu erreichen. Diese Methode ist neben der Reinigung
von Proteinen auch für die Reinigung von Antigenen und Antikörpern, Vitaminen, Hormonen und
polyribosomalen Komplexen geeignet.
Die dreidimensionale Struktur eines Enzyms ist so, dass das aktive Zentrum und das oder die
regulatorischen Zentren nur für eine kleine Anzahl von Verbindungen (Liganden), die entweder
Substrate oder Effektoren vom reversiblen bzw. irreversiblen Typ sein können, zugänglich sind. Die
Reinigung mit Hilfe der Affinitätschromatographie ist möglich, wenn die Affinität des Zentrums für den
Liganden hoch und die Bindung reversibel ist. Nach Bindung an den Liganden erfolgt keine weitere
Reaktion unter den Trennbedingungen.
Bei dieser Technik wird ein Ligand (z.B. kompetitive Inhibitoren oder Strukturanaloge für Cofaktoren)
an eine geeignete unlösliche Matrix (z.B. Agarose oder vernetzte Dextrane) kovalent gebunden. Dabei
ist der Ligand meist nicht direkt, sondern über einen Spacer (mehrere Methylengruppen) mit dem
Polysaccharid verknüpft. Eine Behinderung der Bindung zwischen Ligand und Enzym wird auf diese
Weise vermieden.
Eine Lösung des zu reinigenden Enzyms wird auf eine Säule mit der ligandenbestückten Matrix im
passenden Puffersystem gegeben. Das Enzym wird selektiv zurückgehalten, während andere
Proteine ausgewaschen werden (s. Abb. 1.6).
Abbildung 1.6: Trennung von Makromolekülen durch Affinitätschromatographie
16

Farbstoffe, die eine Affinität zu bestimmten Enzymen haben, können ebenfalls als Ligand benutzt
werden. So bindet Blue Sepharose Cl-6B (Fa. Pharmacia, Freiburg; s. Abb. 1.7) Kinasen,
Dehydrogenasen und andere Enzyme, die Adenylyl-enthaltende Substanzen (z.B. NAD + ) benötigen.
Die Enzyme lagern sich an, weil der Farbstoff eine strukturelle Ähnlichkeit zu den Nukleotidcofaktoren
hat. Die Elution erfolgt zumeist mit freiem Cofaktor.
Abbildung 1.7: Trennung von Makromolekülen durch Affinitätschromatographie
1.5.2 Aufreinigung von ADH mittels Affinitätschromatographie
Geräte und Reagenzien:
Blue Sepharose Cl-6B (Pharmacia), Glassäule, Äkta Prime Fraktionssammler, Spektralphotometer
Benötigte Lösungen:
Startpuffer: Phosphatpuffer nach Sörensen 20mM, pH 6.4
5mM MgCl2
0,4mM EDTA
500 ml
Elutionspuffer: 60 mg NAD in 15 ml Startpuffer (5mM)
Für den in der Affinitätschromatographie verwendeten Startpuffer werden 75% des gewünschten
Endvolumens an Puffer in Form von 20 mM KH2PO4 vorgelegt und mit 20 mM Na2HPO4 der pH-Wert
von pH 6.4 eingestellt. (Nach Sörensen betragen die Volumenanteile idealerweise 73,6% und 26,4%.)
Diesem Phosphatpuffer werden dann 5 mM MgCl2 und 0,4 mM EDTA zugesetzt.
Vorbereitung:
1,8 g Blue Sepharose werden in 10 ml Startpuffer für 24 h äquilibriert und dann in die Säule gefüllt (ca.
10 cm Füllhöhe). Bei 10 Tropfen/min lässt man das Gel für ca. 30 min sedimentieren.
(Die Säulen werden von den Betreuern vorbereitet)
Durchführung:
Probenvolumen am Fraktionssammler auf 10 ml pro Reagenzglas einstellen. Der Enzymextrakt wird
auf die Säule gepumpt; maximal 300 mg Protein auftragen. Vom Säulendurchlauf eine Probe nehmen.
17

Anschließend mit 30 ml Startpuffer pH 6.4 waschen und von der Waschfraktion ebenfalls eine Probe
nehmen.
Die Elution erfolgt mit 15 ml Elutionspuffer, während der Elution Probenvolumen des
Fraktionensammlers auf 3 ml einstellen. Die Säule wird nach der Elution mit 60 ml Startpuffer
gewaschen.
Da NAD bei UV Licht (280nm) stark absorbiert (Abb. 1.1) kann der Proteingehalt der Elutionsfraktionen
nur schlecht durch UV-Absorbtionsmessungen verfolgt werden. Daher werden mit allen
Elutionsfraktionen, sowie dem Säülendurchlauf und der Waschfraktion Aktivitätstests durchgeführt.
Aktivitätstests und Proteinbestimmung erfolgen wie unter Kapitel 1.5 und 1.6 beschrieben.
1.6 Aktivitätstest
Ethanol wird durch NAD in Gegenwart des Enzyms Alkohol-Dehydrogenase (ADH) zu Acetaldehyd
oxidiert:
ADH
Ethanol + NAD + Acetaldehyd + NADH + H +
Das gebildete NADH ist die Messgröße (Absorption bei 340 nm).
Benötigte Lösungen:
Glycinpuffer: 0,1M, pH 9.0
Ethanolpuffer: 100mL 0,1M Glycinpuffer mit 3mL Ethanol versetzen
NAD-Lösung: 12mg/mL dest. Wasser
BSA-Lösung: 0,1% BSA in 0,1M Glycinpuffer lösen
Verfolgt wird die Extinktionszunahme (Zunahme von NADH) bei 340nm. Bei zu stark konzentrierten
Enzymlösungen müssen diese mit reinem Glycinpuffer vorverdünnt werden.
Testansatz: 0,85ml Ethanolpuffer
0,05ml Enzymlösung
0,05ml BSA-Lösung
in Küvette mischen; .........Nullabgleich am Photometer
Start mit 0,05ml NAD Lösung
(außer Elutionsfraktionen der Affinitätschromatographie, Start hier mit Probe)
_____________________________________________________________
gesamt 1,00 ml
sofort Extinktionsänderungen mit Hilfe eines Schreibers aufzeichnen.
18

Die Zunahme der Extinktion sollte möglichst nicht mehr als 0,05 Extinktionseinheiten pro Minute betragen
(sonst weniger Enzym einsetzen bzw. verdünnen).
Für die Auswertung der Schreiberdaten ist der Schreibervortrieb zu notieren. Da Schreibersignal und
am Photometer gezeigte Extinktion nicht aufeinander kalibriert sind, muss auch notiert werden, welche
Extinktion dem Schreiberausschlag zugeordnet ist. Für die Berechnung der Enzymaktivität sind
ausschließlich Daten aus dem linearen Bereich der Messung zu verwenden.
Berechnung der Aktivität
Extinktionsänderung
ΔE
Schreibervorschub
Zeit t
linearer Bereich
Sprung bei
Reaktionsstart
Nulllinie
Die Aktivitätsmessung erfolgt photometrisch, Grundlage der Messung ist das „Lambert-Beer’sche
Gesetz“. Nach diesem Gesetz ist die photometrische Extinktion E proportional zur Schichtdicke der
Messlösung d und der Konzentration der gelösten Substanz c. Der Proportionalitätsfaktor
(„dekadischer Extinktionskoeffizient“) ist u.a. abhängig von der Substanz und der verwendeten
Wellenlänge. Die Enzymaktivität EA wird gemessen in der umgesetzten Teilchenanzahl des
Substrates Δn pro Zeit t.
E = ε • d • c (Lambert-Beer) bzw. ΔE = ε • d • Δc
Δn
Δc =
V
Δn
EA =
t
19

Eingesetzt und nach EA aufgelöst ergibt sich dann:
ΔE • V
erfolgt nach der Formel: EA = __________
t • ε • d
mit: EA = Enzymaktivität [kat]
t = Zeit [s]
ΔE = Extinktionsänderung
ε = Extinktionskoeffizient von NADH bei 340 nm
= 6300 [L/mol cm]
d = Schichtdicke [cm]
V = Volumen des Testansatzes [L]
Hier gilt:
ΔE • 0.001 L • mol • cm
EA = _______________
EA = 158,7
t • 6300 • 1 s • L • cm
ΔE
_____ [nkat]
t
Berechnung der Volumenaktivität: EA · 20 [nkat/ml EE]
Berechnung der spez. Aktivität: auf mg Protein beziehen [nkat / mg]
1.7 Proteinbestimmung
Erfolgt nach Bradford mit fertigem Bio Rad Reagenz.
Testansatz: 0,8mL Wasser
0,2mL Bio Rad Reagenz
0,02mL Probe
Wasser und Bio Rad Reagenz werden vor Zugabe der Probe vermischt.
Jeder Ansatz sollte nach 20-30 Minuten photometrisch vermessen werden (Wellenlänge: 595 nm). Zur
Eichung wird BSA (Rinderserumalbumin) verwendet (Konzentrationen: 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,75
und 1g/L). Der Bereich der linearen Extinktionsänderung kann zur Proteinbestimmung der Proben genutzt
werden, d.h. die Proben müssen (vor Reagenzzugabe) so verdünnt werden, dass der gemessene Wert
in diesem Bereich liegt (!).
20

2. ELISA (enzyme linked immunosorbent assay)
2.1 Allgemeines
Der ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) ist eine weitverbreitete, sehr empfindliche Methode,
um einzelne Proteine nachzuweisen. Dabei nutzt man die hohe Spezifität der Bindung von Antikörpern
an ihr Antigen. Diese sogenannte Antigen-Antikörper-Reaktion wird für den ELISA genutzt und erlaubt
die Identifizierung des Zielproteins auch in komplexen Proteingemischen. Soll ein bestimmtes Protein
durch ELISA nachgewiesen werden, müssen entsprechende Antikörper verfügbar sein. Diese können
entweder durch Immunisierung von Versuchstieren oder gentechnologisch gewonnen werden und
sind inzwischen in großer Auswahl kommerziell erhältlich.
Der ELISA basiert auf der Immobilisierung der Proteine des zu untersuchenden Gemisches auf einer
Trägeroberfläche und anschließendem Nachweis des gebundenen Zielproteins durch einen
Antikörper. Dieser kann entweder direkt an ein Enzym gekoppelt sein oder durch einen enzymgekoppelten
Zweitantikörper detektiert werden. Eine durch das konjugierte Enzym katalysierte
Farbreaktion kann photometrisch gemessen werden und erlaubt die Konzentrationsbestimmung des
Zielproteins anhand einer Eichkurve.
Eine spezielle Form des ELISA ist der Sandwich-ELISA. Dabei wird das gesuchte Protein durch einen
immobilisierten „Fänger-Antikörper“ spezifisch aus einem Proteingemisch herausgefischt. Ein weiterer,
gegen das Protein gerichteter (1.) Antikörper, der aus einer anderen Spezies als der Fänger-
Antikörper stammt, wird auf den gewaschenen Antigen-Antikörper-Komplex gebracht. Schließlich folgt
ein mit Enzym-konjugierter (2.) Antikörper, der gegen den zuletzt aufgebrachten (1.) Antikörper
gerichtet ist. Nach einem weiteren Waschschritt führt ein zugegebenes Substrat zum sichtbaren
Farbumschlag. Eine photometrische Messung folgt dem Abstoppen der Reaktion und anhand der
mitgeführten Eichkurve kann eine Konzentrationsbestimmung erfolgen.
In dem nachfolgenden ELISA muss auf ein „Fänger-Antikörper“ verzichtet werden, da es nur
Antikörper gegen Alcohol-Dehydrogenase aus Kaninchen gibt. Ein klassischer Sandwich-ELISA ist
nicht möglich. Die Proteine bzw. komplexen Proteinmischungen werden direkt an das Trägermedium
gebunden, mit dem Nachteil, dass kein Einfluss auf die Art der gebundenen Proteine genommen
werden kann.
21

2.2 Lösungen
1. Coating buffer
0,1M Carbonatpuffer 4,29g Na2CO3 x 10 H2O
2,93g Na2HCO3 auf pH 9.6; ad 1L H2O
2. Blocking buffer
2% (w/v) Magermilchpulver 1g ad 50ml 1x PBS
3. Wash buffer
1xPBS, 0,05% (v/v) Tween 20
4. Proben
Eichkurve: Alcohol-Dehydrogenase (Yeast) 1mg/ml
1.Konzentration: 1µg/ml -> geometrische Verdünnungsreihe ->
8. Konzentration: ~7,8ng/ml
Proben: H, Ü0, Ü1, Ü2, E, EE -> 1:1.000, 1:10.000
Ü3 -> 1:10, 1:100
Durchfluss (DF), Wash(W), Eluate (F) -> 1.1.000, 1:10.000, 1:100.000
Verdünnungen in Carbonatpuffer herstellen
5. 1. Antikörper
Anti-Alcohol Dehydrogenase (Yeast) [Rabbit] (Fa. Rockland 100-4143)
1:10.000 in Blocking buffer
6. 2. Antikörper
Anti-rabbit IgG (whole molecule) HRP (Fa. Sigma A-0545)
1:20.000 in Blocking buffer
7. TMB
Lösung A
9,73g Kaliumcitrat (30mmol/l EK)
mit ca. 10g (gelöst in ~100ml H20) Zitronensäure auf pH 4,1; ad 1L H2O
Lösung B
240mg Tetramethylbenzidin (Roth 6350.2)
+ 10ml Aceton
+ 90ml Ethanol
+ 907µl 30% H2O2 (80mmol/l EK)
beide Lösungen werden gestellt
8. Stopplösung
10% (v/v) Schwefelsäure
2.3 Materialien / Geräte
1. Mikrotiterplatte: Greiner high (Art. 655081)
2. Inkubationskammer: Plastikbox mit feuchten Tüchern ausgelegt
3. Elisa-washer: Columbuswasher (Fa. TECAN)
4. Elisa-reader: Sunrise (Fa. TECAN)
22

2.4 Pipettierschema
Coaten
Blocken
Datum
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A 1µg/ml H H DF DF DF
B 500ng/ml Ü1 Ü1 W W W
C 250 Ü2 Ü2 F F F
D 125 Ü3 Ü3 F F F
E 62,5 E E DF DF DF
F 31,23 EE EE W W W
G 15,6 Blank1 Blank1 F F F
H 7,8 Blank2 Blank2 F F F
1. Antikörper
2. Antikörper
Substrat
Eichkurve (ADH) Inkubation
2.5 Durchführung
1. Coaten: Verdünnungen von allen Proben und der Eichkurve in Carbonatpuffer
herstellen; je 100µl/well (Vertiefung) pipettieren (Achtung!
Doppelbestimmungen)
Blank1 und Blank2 ist nur Carbonatpuffer
(zügig arbeiten!)
2. Inkubation: 1h, 37°C in feuchter Kammer
3. Waschen: 3x mit 1x PBS, 0,05% (v/v) Tween 20 (Programm 5)
4. Blocken: je 250µl/well Blocking buffer (auch Blanks)
5. Inkubation: 1h, 37°C in feuchter Kammer
6. Waschen: 3x mit 1x PBS, 0,05% (v/v) Tween 20 (Programm 5)
7. 1. Antikörper: je 100µl/well des 1:10.000 in blocking buffer verd. Antikörpers
Achtung! In Blank2 nur Blocking buffer einfüllen!
8. Inkubation: 1h, 37°C in feuchter Kammer
9. Waschen: 3x mit 1x PBS, 0,05% (v/v) Tween 20 (Programm 5)
10. 2. Antikörper: je 100µl/well des 1:20.000 in Blocking buffer verd. Antikörpers
auch in Blank1 und 2
11. Inkubation: 1h, 37°C in feuchter Kammer
12. Waschen: 3x mit 1x PBS, 0,05% (v/v) Tween 20 (Programm 5)
13. Substrat: je 100µl/well der frisch angesetzten Lösung (10 Teile A + 0,5 Teile B)
14. Inkubation: 10-30min, RT in feuchter Kammer, dunkel
15. Abstoppen: +je 100µl/well 10%ige Schwefelsäurelösung
16. Messung: 450/620nm am Elisareader (Thermo)
2.6 Auswertung
Mit Hilfe der Eichkurve können die Konzentrationen der einzelnen Proben ermittelt werden.
Die gefundenen Werte stellen nur die Menge, nicht aber die Funktionalität, hier Enzymaktivität, der
Alcohol-Dehydrogenase dar.
23

3. Diskontinuierliche Gelelektrophorese und Western Blot
3.1 Allgemeines
Man schätzt, dass in Eukaryontenzellen etwa 20.000 verschiedene Strukturgene aktiv sein können,
deren Produkte zum größten Teil Polypeptidketten (Translationsprodukte) sind. Diese falten sich zu
aktiven Proteinen (Enzyme, Transportproteine, Strukturproteine, Peptidhormone, etc.), wobei
kovalente (postranslationale) Modifikationen (Disulfidbrückenbidlung, Peptidabspaltung, Anhängen
von Kleinmolekülen, z.B. Phosphorylierungen, Gykosylierungen) und nicht-kovalente Bindungen an
andere Moleküle (Kleinmoleküle, z.B. Häm, Proteine, Nukleinsäuren) stattfinden können. Man
unterscheidet: “Haushaltsproteine” = Proteine, die für das Leben jeder Zelle notwendig sind und die
deshalb in fast allen Zelltypen eines Organismus vorkommen (z.B. Enzyme der Glykolyse) und
zellspezifische Proteine, die für spezialisierte Zellfunktionen notwendig sind (z.B. Hämoglobin,
Muskelproteine, Peptidhormone).
Abbildung 3.1: Prinzip der diskontinierlichen Elektrophorese.
Zum spezifischen Nachweis eines bestimmten Proteins in einem Gemisch bedient man sich häufig
eines spezifischen Antikörpers der in einem als Western Blot bezeichneten Verfahren eingesetzt wird.
Hierzu wird das Proteingemisch zuerst auf einem diskontinuierlichen SDS Gel elektrophoretisch
aufgetrennt (Abb. 3.1). Im Sammelgel liegt ein pH von 6.8 vor, während im Trenngel ein basischer pH
von 8.8 vorliegt. Im Sammelgel entsteht ein hoher Spannungsabfall zwischen den langsamen, weil
überwiegend ungeladenen Glycinionen und den schnellen Chloridionen. Dadurch bewegen sich die
dazwischen befindlichen Proteine relativ schnell im elektrischen Feld. Wenn die Proteine das Trenngel
erreichen werden sie durch die geringere Porengröße abgebremst. Die Glycinionen überholen an
24

diesem Punkt die Proteine. Durch den pH-Shift im Trenngel sind die Glycinionen nun voll geladen und
die Feldstärke im Gel ist konstant. Durch die Veränderung der Wanderungsgeschwindigkeit der
Glycinionen werden die Proteine in einer scharfen Bande konzentriert, darauf beruht die hohe
Trennleistung dieser Elektrophorese-Methode.
Nach Beendigung des Laufs wird das aufgetrennte Gemisch auf eine Nitrozellulose-Membran mittels
Elektroblot übertragen (Abb. 3.2). Die Membran wird danach mit einem unspezfischen Protein (BSA, oder
Milchpulver) abgesättigt und dann mit einem spezifischen Antikörper inkubiert. Dabei bindet der
Antikörper an sein Antigen, das dann mit Hilfe einer Nachweisreaktion sichtbar gemacht wird. Ziel des
Versuchs ist es die Alkohol-Dehydrogenase mit einem spezifischen polyclonalen Antikörper im Western
Blot nachzuweisen.
Abbildung 3.2: Schematische Darstellung des Western-Blot Verfahrens.
3.2 Probenaufarbeitung
Ziel des Versuchs ist die Alkohol-Dehydrogenase aus Hefe-Rohextrakten und verschiedenen
Aufreinigungsschritten über SDS Elektrophorese in einer Coomassie-Färbung und im Western Blot
nachzuweisen. Der Proteingehalt der Proben, falls unbekannt, ist durch Proteinbestimmung zu ermitteln,
da in jede Spur die gleiche Proteinmenge geladen werden soll. Von jeder Probe werden jeweils 20 μl
Proteinlösung mit 5x SDS Ladepuffer (5 μl ) versetzt und bis zur Durchführung des Versuchs bei -20 o C
gelagert.
25

Durchführung:
Proben vor der Elektrophorese auftauen, kurz vortexen und danach für 5 min. auf 95 ˚C erhitzen. Nach
Abkühlen auf Eis und einer Zentrifugation in der Eppendorfzentrifuge ist der Überstand gebrauchsfertig.
Es werden 10 μl von jeder Probe geladen.
4 x konz. SDS reduzierender Probenpuffer : (Stocklösung)
H2O dest. 3.8 ml
0.5 M Tris-HCl, pH 6.8 1.0 ml
Glyzerin 0.8 ml
10% (w/v) SDS 1.6 ml
β-Mercaptoethanol 0.4 ml
1% Bromphenolblau 0.4 ml
Total 8.0 ml
Im Probenpuffer werden die Proteine solubilisiert, dissoziiert, denaturiert (durch Dodecylsulfat und Hitze)
und reduziert (β-Mercaptoethanol). Das Glyzerin dient der Beschwerung, das Bromphenolblau der
Anfärbung und als Referenz bei der Elektrophorese (läuft als Bande vorweg!).
3.2 Gelvorbereitung
Platten nach Demonstration gut reinigen und zusammenbauen.
Trenngel (12%)
H2O dest. 2.6 mL
1.5M Tris Cl, pH 8.8 2.0 mL
10% SDS 80 µL
Acylamid/bis 3.2 mL
APS 80 µL
TEMED 4 µL
_____________________________________________
Ergibt 8 ml Lösung. (ausreichend für 2 Gele)
Nach der Zugabe von APS und TEMED gut mischen und zwischen die Gelplatten pipettieren. Die
Geloberfläche zum Schluß mit H2O dest. überschichten. Das Trenngel braucht ca. 45 Minuten bis es
polymerisiert ist, anschließend wird das Sammelgel gegossen.
Sammelgel
H2O dest. 2.0 mL
1 M Tris Cl, pH 6.8 0.4 mL
10% SDS 30 µL
Acylamid/bis 0,52 mL
APS 30 µL
TEMED 4 µL
_____________________________________________
Ergibt 3 ml Lösung. (ausreichend für 2 Gele)
26

Wasser von der Geloberfläche mit einem Whatman Filterpapier absaugen, dabei nicht die
Geloberfläche berühren. Sammelgellösung zwischen die Platten pipettieren; Kamm einsetzen
(Luftblasen vermeiden). Nach 30-45 Minuten ist das Gel polymerisiert. Kamm langsam aus dem Gel
ziehen. Die Geltaschen von restlichem unpolymerisierten Acrylamid durch Spülen mit Laufpuffer
befreien. Gel in die Kammer einbauen und 5-10-µl Proben auftragen. Jede Probe zweimal auftragen
(siehe Schema). Gellauf: 40 mA konstant. Lauf dauert etwa 45 min.
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Coomassie Färbung Western Blot
M= Marker Proteine (Molekulargewichtsstandard)
Ein Gel direkt färben mit Coomassie Blue. Das andere Gel wird für den Western Blot benötigt .
Stock Lösungen
1. Acrylamid/bis (30 % T, 2.6 % C)
87.6 g Acrylamid
2.4 g N’N’-bis-methylene-Acrylamid
auf 300 mL mit H2O dest. auffüllen. Filtrieren und bei 4 ˚C dunkel lagern. Achtung Acrylamid ist im
unpolymersierten Zustand ein Nervengift und ist cancerogen!!!
(Es wird eine gebrauchsfertige Acrylamidlösung bereitgestellt)
2. 1.5 M Tris-HCl, pH 8.8
18.15 g Tris
50 mL H2O dest.
Mit HCl auf pH 8.8 bringen, auf 100 mL auffüllen mit H2O dest. und bei 4 o C lagern.
3. 1 M Tris-HCl, pH 6.8
12g Tris
60 mL H2O dest.
Mit HCl auf pH 6.8 bringen, auf 100 mL auffüllen mit H2O dest. und bei 4 o C lagern.
4. 10% APS Lösung.
Dazu 1 g Ammoniumpersulfat/10 mL Aqua bist. ansetzen. Für 2 Wochen bei 4 o C lagern.
27

5. 10% SDS
10 g SDS in 90 mL H2O dest. lösen und auf 100 mL auffüllen. (Einwaage unterm Abzug, da SDS
Stäube reizend sind).
6. 10 x Laufpuffer pH 8,3
250 mM Tris
1,92 M Glycin
Vor dem Lauf wird der Puffer 1:10 mit Wasser verdünnt und mit SDS versetzt (aus 10% Lösung):
Endkonzentration: 0.1 % SDS
7. Molekulargewichte des Proteinmarkers
Wir verwenden einen Proteinstandard der Firma Bio Rad
(Precision Plus Protein Standards)
Mw (daltons)
250.000
150.000
100.000
75.000
50.000
37.000
25.000
20.000
15.000
10.000
3.3 Elektroblot
1. Gel in Blot-Puffer 10 – 20 Minuten schütteln
2. PVDF-Membran auf Gelgröße zurechtschneiden
3. Membran kurz in Methanol inkubieren
Aufbau des Blots:
-
Kathodenplatte
3x Whatman Papier
Gel
Nitrozellulose
3x Whatman Papier
Anodenplatte
+
28

4. Transfer mit der Semidry Apparatur für 40 Minuten bei RT mit 5 mA/cm 2
5. Nach dem Transfer Membran entnehmen und die Position der Proben, sowie Markerbanden auf
der Membran markieren.
6. Membran in 1 x PBS spülen. Danach entweder trocknen und zwischen zwei Whatman Papiere
lagern oder sofort mit der Antikörper Inkubation beginnen.
3.4 Antikörpernachweis
1. Membran für 30 Minuten in Blocking-Puffer bei RT inkubieren.
2. Waschen der Membran bei RT mit
3 x kurz mit 1 x PBS-T
1 x 5 Minuten 1 x PBS-T
3. Anti-Alkohol-Dehyrogenase (polyclonal, rabbit) 1:1000 in TBS-T verdünnen, 1 h bei RT
inkubieren.
4. Waschen der Membran bei RT mit
3x kurz mit 1x PBS-T
1 x 5 Minuten 1xPBS-T
5. Anti-rabbit IgG mit AP gekoppelt 1:2000 in PBS-T verdünnen, 1 h bei RT inkubieren.
6. Waschen der Membran bei RT mit
3 x kurz mit 1x PBS-T
1 x 5 Minuten 1x PBS-T
1 x kurz mit Substratpuffer
1 x 5 Minuten mit Substratpuffer
7. Substrat NBT und BCIP 1:100 in Substratpuffer verdünnen (10 ml) und Blot so lange
inkubieren, bis Banden zu sehen sind (2-20 min)
8. Mit Wasser 1x kurz, 1x 5 Minuten gründlich spülen und zwischen Filterpapier trocknen
(Achtung: Wenn nicht ausreichend gespült wurde, kommt es beim Trocknen zu einer
häßlichen Nachfärbung!)
29

Lösungen:
1. Blot-Puffer = Laufpuffer ohne SDS
25mM Tris
192mM Glycin
2. Blocking Puffer
5% Trockenmilch
0.1% Tween-20
1x PBS
3. 20x PBS
170 g NaCl (2.9M)
21.38 g Na2HPO4 (150mM)
6.9 g NaH2PO4 *H2O (50mM)
ad 1 L H2O
4. 1x PBS-T
1x PBS + 0.1% Tween-20
5. Coomassie Färbelösung
100 mg Coomassie R250
40 mL Ethanol
10 mL Essigsäure
50 mL H2O
6. Entfärber
40 mL EtOH
10 mL Eisessig
50 mL H2O
10. Substrat-Puffer
100mM Tris HCl pH 9.5
0,5mM MgCl2
11. NBT (Nitrotetrazolium blue chlorid) und BCIP (5-Bromo-4-Chloro-3-Indolylphosphat)
NBT (30 mg NBT in 1 mL 70 % Dimethylformamid)
BCIP (15 mg BCIP in 1 mL 100 % Dimethylformamid)
30

4. Zweidimensionale (2D)-Gelektrophorese
4.1 Allgemeines
Mit Hilfe der zweidimensionalen Elektrophorese nach O’Farrell kann eine Mischung von bis zu 5000
Proteinen hinreichend gut in einzelne Spezies aufgetrennt werden. Bei dieser hochauflösenden Technik
wird die Mischung erst einer isoelektrischen Fokussierung (IEF) in einer Gel-Kapillare unterworfen (Abb.
4.1a). Die isoelektrische Fokussierung wird in gleicher Weise durchgeführt wie die Elektrophorese, nur
mit dem Unterschied, dass vor der Probenauftragung dem Gel beigefügte Ampholyte elektrophoretisch
getrennt werden und dabei einen pH-Gradienten innerhalb des Gels aufbauen. Nach Beendigung der IEF
wird das IEF-Gel auf ein konventionelles SDS-Gel überführt und die Proteine werden nun durch SDS-
Gelelektrophorese nach ihrem Molekulargewicht getrennt (Abb. 4.1b).
Abbildung 4.1: Prinzip der zweidimensionalen Gelelektrophorese. a) Trennung der Proteine in der
IEF nach Ladung. Nach Aufbringen des IEF Gelstäbchens auf das SDS-Gel werden die Proteine
dann nach Molekulargewicht getrennt.
31

4.2 2D-Gelelektrophorese
4.2.1 1. Dimension
Herstellung der Kapillar-Gele für die 1. Dimension
• Der Gießzylinder wird mit mehreren Lagen Parafilm verschlossen
• Den Gießzylinder mit Kapillarröhrchen füllen. Die blauen Strichmarkierungen müssen nach oben
zeigen.
• Zugabe von TEMED und APS zur Monomer Lösung. Mit einer Spritze die Lösung aufziehen,
Nadel aufsetzen.
• Nadel in den Gießzylinder einführen und die Kapillaren 3/4 der Länge mit Gellösung füllen.
• Nach der Polymerisierung Parafilm abnehmen und die Röhrchen aus dem Gießzylinder drücken.
• Außen an der Kapillare polymerisiertes Acrylamid entfernen. Kapillaren mit Luftblasen verwerfen.
• Kapillaren in die Apparatur einbauen. Es müssen alle Plätze in der Apparatur mit Kapillaren
Vorlauf:
besetzt sein.
• Mit einer Hamilton Spritze oben NaOH Puffer in die Kapillaren füllen und Luftblasen sehr
sorgfältig aus den Kapillaren entfernen.
• In die untere Pufferkammer ein Rührstäbchen legen und mit H3PO4 Puffer bis zur blauen Marke
auf den Kapillaren (etwa 800 ml) füllen.
• Obere Pufferkammer mit NaOH Puffer füllen (etwa 60 ml)
• Elektroden anschließen und die Kammer auf einen elektrischen Rührer stellen.
• Präelektrophorese mit 200 V für 10 Minuten
300 V für 15 Minuten
400 V für 15 Minuten
Probenbeladung:
• Nach erfolgtem Vorlauf werden die Laufpuffer verworfen. 800 ml frischen H3PO4 Laufpuffer in die
untere Pufferkammer füllen. NaOH Puffer mit Hamilton Spritze aus den Kapillaren entfernen.
Darauf achten, daß die Geloberfläche nicht durchstochen wird.
• Kapillaren mit Hilfe der Hamilton Spritze mit Sample Puffer dreimal spülen.
• 0 – 20 µl Probe in die Kapillare füllen und mit 20-40 µl Sample Overlay Puffer überschichten.
Schließlich bis zum Rand mit NaOH füllen. (auf Luftblasen achten!)
• Vorsichtig mit NaOH Puffer die obere Kammer auffüllen
• Laufbedingungen: 500 V für 10 Minuten
750 V für 3.5 Stunden
• Nach Beendigung des Laufs Kapillaren aus der Apparatur ausbauen. Danach entweder direkt die
2. Dimension anschließen, oder die Gele in Parafilm einwickeln und über Nacht einfrieren.
32

Lösungen:
1. Erste Dimension Monomer Lösung
9.2 M Harnstoff 5.5 g
4% Acrylamid 1.33 mL von der Acrylamid Stock Lösung
2.0% Triton X-100 2.0 mL 10% Triton X-100 Stock
1.6% Bio-Lyte 5/7 Ampholyte 400 µL
0.4% Bio-Lyte 3/10 Ampholyte 100 µL
0.01% Ammonium Persulfat (APS) 10 µL 10% Ammonium Persulfat (frisch ansetzen)
0.1% TEMED 10 µL TEMED
1.97 mL H2O
____________________________________________________
Ergibt 10 mL Lösung.
Harnstoff einwiegen, dann die anderen Lösungen bis auf APS und TEMED zufügen. Im Wasserbad
erwärmen, um den Harnstoff zu lösen . Zum Gießen der Kapillar-Gele APS und TEMED zugeben,
kurz umschütteln und dann die Kapillaren füllen
2. Acrylamid Stocklösung (cancerogen, deshalb Handschuhe!)
Acrylamid/bis 28.38 g
(30% T/5.4% C) 1.62 g
_____________________________
100 mL
(wird gestellt)
3. 10% Triton X-100 Stock Lösung
10 g Triton X-100 mit 100 mL mit H2Odest. verdünnen
4. 40% Triton X-100 Stock Lösung
4 g Triton X-100 mit 10 mL mit H2Odest. verdünnen
5. Probenpuffer für die erste Dimension
9.5 M Harnstoff 5.7 g
2.0% Triton X-100 2.0 mL10% Triton X-100 stock
5% β-Mercaptoethanol 0.5 mL
1.6% Bio-Lyte 5/7 Ampholyte 400 µL
0.4% Bio-Lyte 3/10 Ampholyte 100 µL
auf 10 mL mit H2Odest. verdünnen. Im Wasserbad (

7. Puffer für die obere Pufferkammer (100 mM NaOH)
1 g NaOH in 250 mL H2O dest. lösen und für 30 Minuten entgasen.
8. Puffer für die untere Pufferkammer (10 mM H3PO4)
1.36 mL H3PO4 in 2 L H2O dest. und für 30 Minuten entgasen.
4.2.2. 2. Dimension: SDS Gel
• Gel nach Vorschrift Western Blot (1.4) herstellen. Pro Kapillare wird ein SDS Gel benötigt.
• Sammelgel ohne Kamm gießen. Für den MG-Marker wird eine Tasche unter Zuhilfenahme eines
weiteren Spacers erzeugt. Sammelgel mit Isopropanol überschichten.
• Kapillargel aus der Kapillare auf ein Stück Parafilm drücken. Wird vom Assistenten durchgeführt.
• Gel mit Äquilibrierungspuffer beträufeln (Abzug).
• Mit Hilfe eines Spatels oder Parafilm wird das Gel auf das SDS Gel befördert
• 1 µL Marker in die Tasche geben.
• Erwärmter 1%iger Agarose-Probenpuffer vorsichtig mit einer Pasteurpiette auf das Gel träufeln
(Abzug).
• Nach dem Erkalten Kammer mit Laufpuffer füllen.
• Normale Laufparameter siehe Western Blot Vorschrift.
• Nach dem Lauf eine Silberfärbung vornehmen.
Lösungen für die 2. Dimension
1. Äqulibrierungspuffer
0.0625 M Tris HCl, pH 6.8 1.25 mL 0.5 M Tris/HCl, pH 6.8
2.3% (w/v) SDS 2.3 mL 10% (w/v) SDS
5% β-Mercaptoethanol 500 µL
10% Glycerin (w/v) 800 µL
Bromphenolblau 250 µL einer 0.05% (w/v) BPB stock Lösung
H2O dest.
Unter dem Abzug herstellen!!!!
4.9 mL
10 mL
2. 1% Agarose in SDS Probenpuffer
1 g Agarose in einfach konzentriertem SDS Proben Puffer aufkochen
H2Odest. 86.75 mL
0.5 M Tris-HCl, pH 6.8 3.125 mL
Glycerin 2.5 mL
10% (w/v) SDS 5.0 mL
1% Bromphenolblau 1.25 mL
Total 100 mL
Agarose ist fertig hergestellt und befindet sich im Wasserbad
5 µl β-Mercaptoethanol zu 1 ml Agaroselösung in einem Eppendorfgefäß zufügen und im
Wasserbad zwischenlagern.
34

4.2.3 Silberfärbung
Alternativ zur Färbung mit Coomassie Blue können Proteine auch mit Hilfe der sehr sensitiven
Silberfärbung angefärbt werden. Dazu Gel in eine Schale legen. Nur mit Handschuhen unter dem
Abzug arbeiten. Auf Sauberkeit achten, da sonst ein Hintergrund entsteht. Formaldehyd steht im
Verdacht Krebs zu erzeugen, Farmerscher Abschwächer enthält Kaliumferrizyanid welches
Blausäure freisetzten kann!
• Nach dem Gellauf wird das Sammelgel mit Hilfe eines Spatels abgetrennt und verworfen.
• Das Trenngel in Fixierlösung I für 5 Minuten waschen (in Lösungsmittelabfall entsorgen)
• Das Gel kann in dieser Lösung auch für mehrere Tage verbleiben.
• 1 x 5 Minuten in Fixiererlösung II (in Lösungsmittelabfall entsorgen)
• 2 x Waschen mit 60°C warmen H2O dest.
• 1 x 30 sec. Farmerscher Abschwächer (in Schwermetallabfall unter Abzug entsorgen).
• 6 x waschen mit 60°C warmen H2O dest..
• 1 x 12 Minuten in Färbelösung (Silbernitrat, in Schjwermetallabfall entsorgen).
• 2 x waschen mit H2O dest..
• 1x kurz in Entwickler schwenken, dann in Entwickler inkubieren, bis Banden sichtbar werden
(Entwickler in Lösungsmittelabfall entsorgen)
• 1 x waschen mit H2O dest.
• Abstoppen mit Stopplösung
• Das Gel kann nun fotografiert und/oder getrocknet werden
Lösungen
1. Fixierer I
40% Methanol
10% Eisessig
2. Fixierer II
10% Ethanol
15% Essigsäure
3. Farmerscher Abschwächer
Lösung A: 50g Kaliumferrizyanid (rotes Blutlaugensalz) VORSICHT, kann Blausäure
freisetzten ->Abzug !!!!
ad 1 L H2O dest.
Lösung B: 100g Natriumthiosulfat
ad 1 L H2O dest.
Kurz vor Gebrauch Lösungen A und B zu gleichen Teilen mischen
4. Silbernitratlösung (AgNO3)
1 g AgNO3
ad 500 mL H2O dest.
5. Entwicklerlösung
14.5 g Na2CO3
500 µL 37%ige Formaldehyd-Lösung
ad 500 mL H2O dest
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6. Stopplösung
7% Essigsäure
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