SS 2005 BIOCHEMISCHE ARBEITSMETHODEN für Biologen ...

3. Diskontinuierliche Gelelektrophorese und Western Blot
3.1 Allgemeines
Man schätzt, dass in Eukaryontenzellen etwa 20.000 verschiedene Strukturgene aktiv sein können,
deren Produkte zum größten Teil Polypeptidketten (Translationsprodukte) sind. Diese falten sich zu
aktiven Proteinen (Enzyme, Transportproteine, Strukturproteine, Peptidhormone, etc.), wobei
kovalente (postranslationale) Modifikationen (Disulfidbrückenbidlung, Peptidabspaltung, Anhängen
von Kleinmolekülen, z.B. Phosphorylierungen, Gykosylierungen) und nicht-kovalente Bindungen an
andere Moleküle (Kleinmoleküle, z.B. Häm, Proteine, Nukleinsäuren) stattfinden können. Man
unterscheidet: “Haushaltsproteine” = Proteine, die für das Leben jeder Zelle notwendig sind und die
deshalb in fast allen Zelltypen eines Organismus vorkommen (z.B. Enzyme der Glykolyse) und
zellspezifische Proteine, die für spezialisierte Zellfunktionen notwendig sind (z.B. Hämoglobin,
Muskelproteine, Peptidhormone).
Abbildung 3.1: Prinzip der diskontinierlichen Elektrophorese.
Zum spezifischen Nachweis eines bestimmten Proteins in einem Gemisch bedient man sich häufig
eines spezifischen Antikörpers der in einem als Western Blot bezeichneten Verfahren eingesetzt wird.
Hierzu wird das Proteingemisch zuerst auf einem diskontinuierlichen SDS Gel elektrophoretisch
aufgetrennt (Abb. 3.1). Im Sammelgel liegt ein pH von 6.8 vor, während im Trenngel ein basischer pH
von 8.8 vorliegt. Im Sammelgel entsteht ein hoher Spannungsabfall zwischen den langsamen, weil
überwiegend ungeladenen Glycinionen und den schnellen Chloridionen. Dadurch bewegen sich die
dazwischen befindlichen Proteine relativ schnell im elektrischen Feld. Wenn die Proteine das Trenngel
erreichen werden sie durch die geringere Porengröße abgebremst. Die Glycinionen überholen an
24