SS 2005 BIOCHEMISCHE ARBEITSMETHODEN für Biologen ...

Wasser von der Geloberfläche mit einem Whatman Filterpapier absaugen, dabei nicht die
Geloberfläche berühren. Sammelgellösung zwischen die Platten pipettieren; Kamm einsetzen
(Luftblasen vermeiden). Nach 30-45 Minuten ist das Gel polymerisiert. Kamm langsam aus dem Gel
ziehen. Die Geltaschen von restlichem unpolymerisierten Acrylamid durch Spülen mit Laufpuffer
befreien. Gel in die Kammer einbauen und 5-10-µl Proben auftragen. Jede Probe zweimal auftragen
(siehe Schema). Gellauf: 40 mA konstant. Lauf dauert etwa 45 min.
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Coomassie Färbung Western Blot
M= Marker Proteine (Molekulargewichtsstandard)
Ein Gel direkt färben mit Coomassie Blue. Das andere Gel wird für den Western Blot benötigt .
Stock Lösungen
1. Acrylamid/bis (30 % T, 2.6 % C)
87.6 g Acrylamid
2.4 g N’N’-bis-methylene-Acrylamid
auf 300 mL mit H2O dest. auffüllen. Filtrieren und bei 4 ˚C dunkel lagern. Achtung Acrylamid ist im
unpolymersierten Zustand ein Nervengift und ist cancerogen!!!
(Es wird eine gebrauchsfertige Acrylamidlösung bereitgestellt)
2. 1.5 M Tris-HCl, pH 8.8
18.15 g Tris
50 mL H2O dest.
Mit HCl auf pH 8.8 bringen, auf 100 mL auffüllen mit H2O dest. und bei 4 o C lagern.
3. 1 M Tris-HCl, pH 6.8
12g Tris
60 mL H2O dest.
Mit HCl auf pH 6.8 bringen, auf 100 mL auffüllen mit H2O dest. und bei 4 o C lagern.
4. 10% APS Lösung.
Dazu 1 g Ammoniumpersulfat/10 mL Aqua bist. ansetzen. Für 2 Wochen bei 4 o C lagern.
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