SS 2005 BIOCHEMISCHE ARBEITSMETHODEN für Biologen ...

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7. Puffer für die obere Pufferkammer (100 mM NaOH) 1 g NaOH in 250 mL H2O dest. lösen und für 30 Minuten entgasen. 8. Puffer für die untere Pufferkammer (10 mM H3PO4) 1.36 mL H3PO4 in 2 L H2O dest. und für 30 Minuten entgasen. 4.2.2. 2. Dimension: SDS Gel • Gel nach Vorschrift Western Blot (1.4) herstellen. Pro Kapillare wird ein SDS Gel benötigt. • Sammelgel ohne Kamm gießen. Für den MG-Marker wird eine Tasche unter Zuhilfenahme eines weiteren Spacers erzeugt. Sammelgel mit Isopropanol überschichten. • Kapillargel aus der Kapillare auf ein Stück Parafilm drücken. Wird vom Assistenten durchgeführt. • Gel mit Äquilibrierungspuffer beträufeln (Abzug). • Mit Hilfe eines Spatels oder Parafilm wird das Gel auf das SDS Gel befördert • 1 µL Marker in die Tasche geben. • Erwärmter 1%iger Agarose-Probenpuffer vorsichtig mit einer Pasteurpiette auf das Gel träufeln (Abzug). • Nach dem Erkalten Kammer mit Laufpuffer füllen. • Normale Laufparameter siehe Western Blot Vorschrift. • Nach dem Lauf eine Silberfärbung vornehmen. Lösungen für die 2. Dimension 1. Äqulibrierungspuffer 0.0625 M Tris HCl, pH 6.8 1.25 mL 0.5 M Tris/HCl, pH 6.8 2.3% (w/v) SDS 2.3 mL 10% (w/v) SDS 5% β-Mercaptoethanol 500 µL 10% Glycerin (w/v) 800 µL Bromphenolblau 250 µL einer 0.05% (w/v) BPB stock Lösung H2O dest. Unter dem Abzug herstellen!!!! 4.9 mL 10 mL 2. 1% Agarose in SDS Probenpuffer 1 g Agarose in einfach konzentriertem SDS Proben Puffer aufkochen H2Odest. 86.75 mL 0.5 M Tris-HCl, pH 6.8 3.125 mL Glycerin 2.5 mL 10% (w/v) SDS 5.0 mL 1% Bromphenolblau 1.25 mL Total 100 mL Agarose ist fertig hergestellt und befindet sich im Wasserbad 5 µl β-Mercaptoethanol zu 1 ml Agaroselösung in einem Eppendorfgefäß zufügen und im Wasserbad zwischenlagern. 34
4.2.3 Silberfärbung Alternativ zur Färbung mit Coomassie Blue können Proteine auch mit Hilfe der sehr sensitiven Silberfärbung angefärbt werden. Dazu Gel in eine Schale legen. Nur mit Handschuhen unter dem Abzug arbeiten. Auf Sauberkeit achten, da sonst ein Hintergrund entsteht. Formaldehyd steht im Verdacht Krebs zu erzeugen, Farmerscher Abschwächer enthält Kaliumferrizyanid welches Blausäure freisetzten kann! • Nach dem Gellauf wird das Sammelgel mit Hilfe eines Spatels abgetrennt und verworfen. • Das Trenngel in Fixierlösung I für 5 Minuten waschen (in Lösungsmittelabfall entsorgen) • Das Gel kann in dieser Lösung auch für mehrere Tage verbleiben. • 1 x 5 Minuten in Fixiererlösung II (in Lösungsmittelabfall entsorgen) • 2 x Waschen mit 60°C warmen H2O dest. • 1 x 30 sec. Farmerscher Abschwächer (in Schwermetallabfall unter Abzug entsorgen). • 6 x waschen mit 60°C warmen H2O dest.. • 1 x 12 Minuten in Färbelösung (Silbernitrat, in Schjwermetallabfall entsorgen). • 2 x waschen mit H2O dest.. • 1x kurz in Entwickler schwenken, dann in Entwickler inkubieren, bis Banden sichtbar werden (Entwickler in Lösungsmittelabfall entsorgen) • 1 x waschen mit H2O dest. • Abstoppen mit Stopplösung • Das Gel kann nun fotografiert und/oder getrocknet werden Lösungen 1. Fixierer I 40% Methanol 10% Eisessig 2. Fixierer II 10% Ethanol 15% Essigsäure 3. Farmerscher Abschwächer Lösung A: 50g Kaliumferrizyanid (rotes Blutlaugensalz) VORSICHT, kann Blausäure freisetzten ->Abzug !!!! ad 1 L H2O dest. Lösung B: 100g Natriumthiosulfat ad 1 L H2O dest. Kurz vor Gebrauch Lösungen A und B zu gleichen Teilen mischen 4. Silbernitratlösung (AgNO3) 1 g AgNO3 ad 500 mL H2O dest. 5. Entwicklerlösung 14.5 g Na2CO3 500 µL 37%ige Formaldehyd-Lösung ad 500 mL H2O dest 35
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