SS 2005 BIOCHEMISCHE ARBEITSMETHODEN für Biologen ...

diesem Punkt die Proteine. Durch den pH-Shift im Trenngel sind die Glycinionen nun voll geladen und
die Feldstärke im Gel ist konstant. Durch die Veränderung der Wanderungsgeschwindigkeit der
Glycinionen werden die Proteine in einer scharfen Bande konzentriert, darauf beruht die hohe
Trennleistung dieser Elektrophorese-Methode.
Nach Beendigung des Laufs wird das aufgetrennte Gemisch auf eine Nitrozellulose-Membran mittels
Elektroblot übertragen (Abb. 3.2). Die Membran wird danach mit einem unspezfischen Protein (BSA, oder
Milchpulver) abgesättigt und dann mit einem spezifischen Antikörper inkubiert. Dabei bindet der
Antikörper an sein Antigen, das dann mit Hilfe einer Nachweisreaktion sichtbar gemacht wird. Ziel des
Versuchs ist es die Alkohol-Dehydrogenase mit einem spezifischen polyclonalen Antikörper im Western
Blot nachzuweisen.
Abbildung 3.2: Schematische Darstellung des Western-Blot Verfahrens.
3.2 Probenaufarbeitung
Ziel des Versuchs ist die Alkohol-Dehydrogenase aus Hefe-Rohextrakten und verschiedenen
Aufreinigungsschritten über SDS Elektrophorese in einer Coomassie-Färbung und im Western Blot
nachzuweisen. Der Proteingehalt der Proben, falls unbekannt, ist durch Proteinbestimmung zu ermitteln,
da in jede Spur die gleiche Proteinmenge geladen werden soll. Von jeder Probe werden jeweils 20 μl
Proteinlösung mit 5x SDS Ladepuffer (5 μl ) versetzt und bis zur Durchführung des Versuchs bei -20 o C
gelagert.
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