SS 2005 BIOCHEMISCHE ARBEITSMETHODEN für Biologen ...

2.4 Pipettierschema
Coaten
Blocken
Datum
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A 1µg/ml H H DF DF DF
B 500ng/ml Ü1 Ü1 W W W
C 250 Ü2 Ü2 F F F
D 125 Ü3 Ü3 F F F
E 62,5 E E DF DF DF
F 31,23 EE EE W W W
G 15,6 Blank1 Blank1 F F F
H 7,8 Blank2 Blank2 F F F
1. Antikörper
2. Antikörper
Substrat
Eichkurve (ADH) Inkubation
2.5 Durchführung
1. Coaten: Verdünnungen von allen Proben und der Eichkurve in Carbonatpuffer
herstellen; je 100µl/well (Vertiefung) pipettieren (Achtung!
Doppelbestimmungen)
Blank1 und Blank2 ist nur Carbonatpuffer
(zügig arbeiten!)
2. Inkubation: 1h, 37°C in feuchter Kammer
3. Waschen: 3x mit 1x PBS, 0,05% (v/v) Tween 20 (Programm 5)
4. Blocken: je 250µl/well Blocking buffer (auch Blanks)
5. Inkubation: 1h, 37°C in feuchter Kammer
6. Waschen: 3x mit 1x PBS, 0,05% (v/v) Tween 20 (Programm 5)
7. 1. Antikörper: je 100µl/well des 1:10.000 in blocking buffer verd. Antikörpers
Achtung! In Blank2 nur Blocking buffer einfüllen!
8. Inkubation: 1h, 37°C in feuchter Kammer
9. Waschen: 3x mit 1x PBS, 0,05% (v/v) Tween 20 (Programm 5)
10. 2. Antikörper: je 100µl/well des 1:20.000 in Blocking buffer verd. Antikörpers
auch in Blank1 und 2
11. Inkubation: 1h, 37°C in feuchter Kammer
12. Waschen: 3x mit 1x PBS, 0,05% (v/v) Tween 20 (Programm 5)
13. Substrat: je 100µl/well der frisch angesetzten Lösung (10 Teile A + 0,5 Teile B)
14. Inkubation: 10-30min, RT in feuchter Kammer, dunkel
15. Abstoppen: +je 100µl/well 10%ige Schwefelsäurelösung
16. Messung: 450/620nm am Elisareader (Thermo)
2.6 Auswertung
Mit Hilfe der Eichkurve können die Konzentrationen der einzelnen Proben ermittelt werden.
Die gefundenen Werte stellen nur die Menge, nicht aber die Funktionalität, hier Enzymaktivität, der
Alcohol-Dehydrogenase dar.
23