SS 2005 BIOCHEMISCHE ARBEITSMETHODEN für Biologen ...
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Allgemein werden nachfolgende Schritte zur Aktivierung von Anionenaustauschern durchgeführt:<br />
• Säulenmaterial in 15 Volumina 0,5N HCl aufrühren (bezogen auf Trockengewicht (g/v)) und 30<br />
Minuten rühren lassen<br />
• Überstand mit Hilfe einer Glasfritte absaugen und Säulenmaterial mit Wasser waschen bis pH 4<br />
erreicht ist<br />
• Säulenmaterial in 0,5N NaOH weitere 30 Minuten stehenlassen<br />
• nachfolgend waschen bis der Durchlauf nahezu neutral ist<br />
Zur wiederholten Benutzung d.h. Regenerierung des Säulenmaterials kann (in der Säule) mit dem<br />
dreifachen Säulenvolumen 2M NaCl (mikrofiltriert und entgast) gewaschen werden. Anschließend wird<br />
das Natriumchlorid durch Waschen mit Wasser wieder entfernt (Nachweis mit Silbernitrat: durch Zugabe<br />
einer Spatelspitze Silbernitrat zu einer kleinen Menge Waschwasser fällt bei Anwesenheit von Chlorid<br />
AgCl2 aus).<br />
Die in diesem Praktikum zu verwendende DEAE Sepharose liegt entweder aktiviert in alkoholischer<br />
Lösung oder regeneriert in NaCl-Lösung vor. Somit muss man vor Gebrauch sorgfältig mit dest.<br />
Wasser waschen, um das Ethanol bzw. Salz zu entfernen.<br />
Packen der Säule: (wird von Betreuer durchgeführt)<br />
Die vorbereitete DEAE Sepharose wird bei zunächst geöffnetem Auslauf homogen in eine Glassäule<br />
gepackt, bis ein Säulenvolumen von ca. 20 ml erreicht ist anschließend wird mit 2 -3 Säulenvolumina<br />
Puffer A äquilibriert (Flußrate: 1.5 bis 3 ml / Minute). Ca. 75 ml.<br />
Säulenlauf:<br />
Der Enzymextrakt wird auf die Säule gepumpt; maximal 300 mg Protein auftragen. Eluat in einem<br />
Sammelgefäß auffangen (=Fraktion "Vorlauf“). Nach Probenauftragung 2-3 x waschen mit einem<br />
Säulenvolumen des Säulenpuffers A (= Fraktion "Durchlauf"). Anschließend Eluat in Fraktionen<br />
weitersammeln. Elution unter einem<br />
linearen Phosphatgradienten mit 60 mL Puffer A (Startpuffer) und 60mL Puffer B (Endeluent); mit<br />
ca. 60 -100 mL reinem Puffer B nacheluieren.<br />
Aktivitätstests und Proteinbestimmung erfolgen wie in Kap. 1.5 und Kap. 1.6 beschrieben.<br />
Bedingungen:<br />
Säulenfüllung: DEAE-Sepharose<br />
Fraktionsgröße: 5 mL<br />
Enzymauftrags- und Elutionsgeschwindigkeit.: 2mL/min<br />
nach Probenauftrag: linearer Gradient mit 60mL Puffer A<br />
60mL Puffer B<br />
anschließend restliches Protein mit 100% Puffer B entfernen<br />
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