SS 2005 BIOCHEMISCHE ARBEITSMETHODEN für Biologen ...

Wichtig: Um die Aufreinigung des Enzyms in den einzelnen Schritten über-
prüfen zu können, wird aus den im nachfolgenden schematischen
Versuchsablauf mit * markierten Fraktionen jeweils 1ml entnommen. Diese Proben
dienen zur Proteinbestimmung und zum Test auf ADH-Aktivität. Ferner ist es wichtig,
die Volumina der Fraktionen zu bestimmen und zu notieren!
1.2.1 Aufschluss der Hefezellen
Zur Aufreinigung intrazellulärer Enzyme müssen zuerst die Zellwände der Mikroorganismen bzw. der
pflanzlichen oder tierischen Zellen zerstört, zumindest jedoch permeabilisiert werden. Gleichzeitig sollte
die Aktivität des freigesetzten Enzyms erhalten bleiben. Einen Überblick über die in der Biochemie
verwendeten Methoden gibt Abbildung 1.4. Industriell kommen davon hauptsächlich zwei Methoden zum
Einsatz; die Nassvermahlung in schnelllaufenden Rührwerkskugelmühlen und der Aufschluss durch
drastische Druckdifferenzen in Hochdruckhomogenisatoren. Im Labor können alle hier vorgestellten
Methoden zum Einsatz kommen.
Zellaufschluß
Mechanische Methoden Nicht mechanische Methoden
Scherkräfte in Scherkräfte in
Festsubstanz Lösung
Druck,
Vermahlen
Rühren,
Druck,
Schall
Abbildung 1.4: Zellaufschlussmethoden
Lyse Trocknung
Physikalisch Biochemisch
Osmotischer
Schock,
Einfrieren-
Auftauen
Lysozym u.ä.
Enzyme,
Antibiotika,
Phagen,
Detergentien
Benötigte Lösung:
Zellaufschlusspuffer: 50 mM KH2PO4/K2HPO4, 3 mM EDTA, pH 8.0 2 l
Gefriertrocknung,
Lufttrocknung,
Entspannung,
Trocknung mit
Lösungsmitteln
-
Eine wässrige Lösung von Dihydrogenphosphat (H2PO4 ) hat einen sauren, eine Lösung von
2-
Hydrogenphosphat (HPO4 ) einen basischen pH-Wert. Phosphatpuffer werden durch das Mischen der
- 2-
wässrigen Salzlösungen von H2PO4 und HPO4 gleicher Molarität hergestellt.
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