SS 2005 BIOCHEMISCHE ARBEITSMETHODEN für Biologen ...

2.2 Lösungen
1. Coating buffer
0,1M Carbonatpuffer 4,29g Na2CO3 x 10 H2O
2,93g Na2HCO3 auf pH 9.6; ad 1L H2O
2. Blocking buffer
2% (w/v) Magermilchpulver 1g ad 50ml 1x PBS
3. Wash buffer
1xPBS, 0,05% (v/v) Tween 20
4. Proben
Eichkurve: Alcohol-Dehydrogenase (Yeast) 1mg/ml
1.Konzentration: 1µg/ml -> geometrische Verdünnungsreihe ->
8. Konzentration: ~7,8ng/ml
Proben: H, Ü0, Ü1, Ü2, E, EE -> 1:1.000, 1:10.000
Ü3 -> 1:10, 1:100
Durchfluss (DF), Wash(W), Eluate (F) -> 1.1.000, 1:10.000, 1:100.000
Verdünnungen in Carbonatpuffer herstellen
5. 1. Antikörper
Anti-Alcohol Dehydrogenase (Yeast) [Rabbit] (Fa. Rockland 100-4143)
1:10.000 in Blocking buffer
6. 2. Antikörper
Anti-rabbit IgG (whole molecule) HRP (Fa. Sigma A-0545)
1:20.000 in Blocking buffer
7. TMB
Lösung A
9,73g Kaliumcitrat (30mmol/l EK)
mit ca. 10g (gelöst in ~100ml H20) Zitronensäure auf pH 4,1; ad 1L H2O
Lösung B
240mg Tetramethylbenzidin (Roth 6350.2)
+ 10ml Aceton
+ 90ml Ethanol
+ 907µl 30% H2O2 (80mmol/l EK)
beide Lösungen werden gestellt
8. Stopplösung
10% (v/v) Schwefelsäure
2.3 Materialien / Geräte
1. Mikrotiterplatte: Greiner high (Art. 655081)
2. Inkubationskammer: Plastikbox mit feuchten Tüchern ausgelegt
3. Elisa-washer: Columbuswasher (Fa. TECAN)
4. Elisa-reader: Sunrise (Fa. TECAN)
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