SS 2005 BIOCHEMISCHE ARBEITSMETHODEN für Biologen ...

7. Puffer für die obere Pufferkammer (100 mM NaOH)
1 g NaOH in 250 mL H2O dest. lösen und für 30 Minuten entgasen.
8. Puffer für die untere Pufferkammer (10 mM H3PO4)
1.36 mL H3PO4 in 2 L H2O dest. und für 30 Minuten entgasen.
4.2.2. 2. Dimension: SDS Gel
• Gel nach Vorschrift Western Blot (1.4) herstellen. Pro Kapillare wird ein SDS Gel benötigt.
• Sammelgel ohne Kamm gießen. Für den MG-Marker wird eine Tasche unter Zuhilfenahme eines
weiteren Spacers erzeugt. Sammelgel mit Isopropanol überschichten.
• Kapillargel aus der Kapillare auf ein Stück Parafilm drücken. Wird vom Assistenten durchgeführt.
• Gel mit Äquilibrierungspuffer beträufeln (Abzug).
• Mit Hilfe eines Spatels oder Parafilm wird das Gel auf das SDS Gel befördert
• 1 µL Marker in die Tasche geben.
• Erwärmter 1%iger Agarose-Probenpuffer vorsichtig mit einer Pasteurpiette auf das Gel träufeln
(Abzug).
• Nach dem Erkalten Kammer mit Laufpuffer füllen.
• Normale Laufparameter siehe Western Blot Vorschrift.
• Nach dem Lauf eine Silberfärbung vornehmen.
Lösungen für die 2. Dimension
1. Äqulibrierungspuffer
0.0625 M Tris HCl, pH 6.8 1.25 mL 0.5 M Tris/HCl, pH 6.8
2.3% (w/v) SDS 2.3 mL 10% (w/v) SDS
5% β-Mercaptoethanol 500 µL
10% Glycerin (w/v) 800 µL
Bromphenolblau 250 µL einer 0.05% (w/v) BPB stock Lösung
H2O dest.
Unter dem Abzug herstellen!!!!
4.9 mL
10 mL
2. 1% Agarose in SDS Probenpuffer
1 g Agarose in einfach konzentriertem SDS Proben Puffer aufkochen
H2Odest. 86.75 mL
0.5 M Tris-HCl, pH 6.8 3.125 mL
Glycerin 2.5 mL
10% (w/v) SDS 5.0 mL
1% Bromphenolblau 1.25 mL
Total 100 mL
Agarose ist fertig hergestellt und befindet sich im Wasserbad
5 µl β-Mercaptoethanol zu 1 ml Agaroselösung in einem Eppendorfgefäß zufügen und im
Wasserbad zwischenlagern.
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