SS 2005 BIOCHEMISCHE ARBEITSMETHODEN für Biologen ...

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1. Isolierung von Alkohol-Dehydrogenase aus Bäckerhefe 1.1 Allgemeines In diesem Teil des Praktikums soll das Enzym Alkohol-Dehydrogenase aus Bäckerhefe (Saccharomyces sp.) aufgereinigt werden. Da das Enzym relativ temperaturstabil ist, läßt es sich unter „Praktikums- bedingungen“ recht unproblematisch bearbeiten. Die Alkohol-Dehydrogenase gehört laut EC-System (enzyme classification of the International Union of Biochemistry; IUB) der ersten Klasse, den Oxidoreduktasen, an. Die ADH ist bei Hefen ein weitverbreitetes Enzym. Es ist in der Lage, Alkohole in Aldehyde bzw. Ketone umzuwandeln. Diese Oxidation ist Coenzym abhängig. Der bei der Oxidation des Alkohols freiwerdende Wasserstoff wird auf NAD + übertragen: R2CHOH + NAD + R2C=O + NADH + H + Die Aktivität wird optisch bestimmt. Im NADH ist der aromatische Charakter des Pyrimidinrings aufgehoben; dadurch ändert sich das Absorptionsverhalten. NADH besitzt ein zweites Absorptionsmaximum bei 340nm. Die Zunahme der Absorption pro Zeiteinheit für den Übergang von NAD + zu NADH ist ein direktes Maß für die Reaktionsgeschwindigkeit. Abbildung 1.1: Absorption der oxid. und red. Nicotinamidnucleotide NAD bzw. NADP im UV- Bereich. 4
Die katalytische Aktivität eines Enzyms wird nach Empfehlung der IUB in Katal [kat] angegeben. Sie ist definiert als diejenige Enzymmenge, die unter den für das Enzym festgelegten Bedingungen bei 30 0 C den Umsatz von 1 Mol Substrat pro Sekunde katalysiert (1 kat = 1 Mol Substrat • s -1 ). Veraltet, aber ein leider noch häufig in der Literatur oder in Chemikalienkatalogen zu findender Begriff, ist das Unit (1 U = 1 μMol Substrat • min -1 = 16.66 nkat). Der die Qualität einer Enzymaufreinigung beschreibende Wert ist die spezifische Enzymaktivität [kat • g -1 Protein], da hier die Proteinkonzentration mit berücksichtigt wird. Das Verhältnis der spezif. Aktivität einer Enzymfraktion nach einem Aufreinigungsschritt zur spezif. Aktivität der Ausgangslösung bestimmt den Aufreinigungsfaktor des Aufreinigungsschrittes. Aufreinigungsstufe Spezif. Aktivität [nkat/mg] Aufreinigungsfaktor Ausbeute Rohaufschluß 0,68 1,0 100 Hitze/EtOH-Behandlung 1,17 1,7 54 Dialyse 1,87 2,7 54 Anionenaustauschchr. pH 6.5 17,0 25,0 12,4 Anionenaustauschchr. pH 7.5 132,0 194 9,2 Konzentrierung 153,0 225,0 3,6 Gelfiltration 273,0 401,0 2,3 Abbildung 1.2: Beispiel einer Aufreinigungstabelle Die Ausbeuten einer Enzymaufreinigung werden über die volumetrische Aktivität [kat • ml -1 ] berechnet (als Beispiel siehe Aufreinigungstabelle Abbildung 1.2). Wenn also in z.B. 300 ml Rohextrakt 6 nkat/ml Aktivität vorhanden waren (→insgesamt 1800 nkat) und nach einem anschließenden Fällungsschritt das Pellet in 50 mL Puffer mit einer vol. Aktivität von 26.3 nkat/ml aufgenommen wurde (→insgesamt 1315 nkat), so beträgt die Ausbeute nach der Fällung 73.05%. Der Erfolg einer Enzymaufreinigung hängt stark mit den Stabilitätseigenschaften des Enzyms zusammen. Extrazelluläre Enzyme sind naturgemäß stabiler als intrazelluläre und die wiederum stabiler als membrangebundene Enzyme (extr. E > intr. E > membr. E). Dementsprechend versucht man von Beginn an das zu bearbeitende Enzym vor inaktivierenden Einflüssen zu schützen und dessen „natürliche Umgebung“, in der es aktiv ist, zu imitieren. Das heißt, man hält Enzymlösungen bei konstantem pH-Wert solange wie möglich im Eisbad und gibt, je nach Enzym, Zusätze wie a) Zucker (0.05 -0.2 M), b) EDTA (1.5 mM), c) Salze (in der Zelle liegt die Ionenstärke um 0.15 - 0.2 M), d) Mercaptoethanol oder Cystein (5 - 20 mM) und/oder e) spezifische, stabilisierende Agenzien für bestimmte Enzyme wie Zn 2+ für zinkabhängige Proteine oder Pyridoxalphosphat für pyridoxalphosphat-abhängige Enzyme hinzu. 5 [%]
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