SS 2005 BIOCHEMISCHE ARBEITSMETHODEN für Biologen ...

4. Transfer mit der Semidry Apparatur für 40 Minuten bei RT mit 5 mA/cm 2
5. Nach dem Transfer Membran entnehmen und die Position der Proben, sowie Markerbanden auf
der Membran markieren.
6. Membran in 1 x PBS spülen. Danach entweder trocknen und zwischen zwei Whatman Papiere
lagern oder sofort mit der Antikörper Inkubation beginnen.
3.4 Antikörpernachweis
1. Membran für 30 Minuten in Blocking-Puffer bei RT inkubieren.
2. Waschen der Membran bei RT mit
3 x kurz mit 1 x PBS-T
1 x 5 Minuten 1 x PBS-T
3. Anti-Alkohol-Dehyrogenase (polyclonal, rabbit) 1:1000 in TBS-T verdünnen, 1 h bei RT
inkubieren.
4. Waschen der Membran bei RT mit
3x kurz mit 1x PBS-T
1 x 5 Minuten 1xPBS-T
5. Anti-rabbit IgG mit AP gekoppelt 1:2000 in PBS-T verdünnen, 1 h bei RT inkubieren.
6. Waschen der Membran bei RT mit
3 x kurz mit 1x PBS-T
1 x 5 Minuten 1x PBS-T
1 x kurz mit Substratpuffer
1 x 5 Minuten mit Substratpuffer
7. Substrat NBT und BCIP 1:100 in Substratpuffer verdünnen (10 ml) und Blot so lange
inkubieren, bis Banden zu sehen sind (2-20 min)
8. Mit Wasser 1x kurz, 1x 5 Minuten gründlich spülen und zwischen Filterpapier trocknen
(Achtung: Wenn nicht ausreichend gespült wurde, kommt es beim Trocknen zu einer
häßlichen Nachfärbung!)
29