SS 2005 BIOCHEMISCHE ARBEITSMETHODEN für Biologen ...

Das IV hat sieben unterschiedliche Anschlüsse (Ports), die sich über drei unterschiedliche
Ventilstellungen miteinander verbinden lassen. In der Position LOAD liefert die Systempumpe den
Flüssigkeitsstrom über Port 7 direkt an Port 1 und von dort auf die Säule. In dieser Position lässt sich
über eine Spritze ein chromatographisch zu trennende Probe in die Vorlageschleife (Sample loop)
spritzen. Diese ist ein einfaches Schlauchstück von definiertem Volumen, über das die Probe vor ihrer
Auftrennung im System gelagert werden kann. In der Position INJECT wird der Strom vom Port 7
zunächst über die Probenschleife umgeleitet und deren Inhalt über Port 1 auf die Säule geleitet, um
dort aufgetrennt zu werden. In der dritten Position WASTE gelangt der Flüssigkeitsstrom über Port 7
nicht zum zur Säule führenden Port 1, sondern wird in ein Abfallgefäß umgeleitet.
Auf der Säule (Column) erfolgt die chromatographische Trennung der Probe. Hinter der Säule sitzen
Messzellen, die z.B. die Leitfähigkeit der von der Säule kommenden Flüssigkeit erfassen. Eine UV-
Messzelle erfasst die Absorption bei einer Wellenlänge von 280nm – bei dieser Wellenlänge
absorbieren bekanntlich Proteine. Die Messzellen leiten ihre Messdaten an Schreiber bzw. Computer
zur Protokollierung weiter.
Je nach Bedeutung des von der Säule kommenden Stroms kann die Flüssigkeit in Fraktionen
aufgefangen werden oder in einem (Abfall-)Gefäß gesammelt werden. Dies wird durch das
Fraktionsventil (Flow diversion valve) gesteuert.
Ausgefeilte FPLC-System haben weitere Messzellen, lassen sich über Computer ansteuern und
programmieren, können u.U. mehrere Säulen gleichzeitig oder in Serie ansteuern u.v.m. Die hier
dargestellten Grundzüge sind aber in allen Anlagen wiederzufinden.
1.4 Anionenaustauschchromatographie (DEAE Sepharose)
Wichtig: Alle Puffer für die Säulenchromatographie müssen vor Gebrauch mikrofiltriert
und entgast werden.
1.4.1 Allgemeines
Ionenaustauscher bestehen aus einem unlöslichen Trägermaterial (Matrix), das positiv oder negativ
geladene Gruppen in kovalenter Bindung enthält. Die Ladungen dieser Austauschergruppen werden
durch frei bewegliche Gegenionen kompensiert, welche gegen Ionen gleichen Ladungssinns
reversibel austauschbar sind. Je nach Art des Gegenions unterscheidet man zwischen Anionen und
Kationenaustauscher.
Proteine sind amphotere Polyelektrolyte und lassen sich daher sowohl an Anionen als auch an
Kationenaustauscher reversibel binden. Im pH-Bereich unterhalb seines isoelektrischen Punktes
(pH