SS 2005 BIOCHEMISCHE ARBEITSMETHODEN für Biologen ...

2. ELISA (enzyme linked immunosorbent assay)
2.1 Allgemeines
Der ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) ist eine weitverbreitete, sehr empfindliche Methode,
um einzelne Proteine nachzuweisen. Dabei nutzt man die hohe Spezifität der Bindung von Antikörpern
an ihr Antigen. Diese sogenannte Antigen-Antikörper-Reaktion wird für den ELISA genutzt und erlaubt
die Identifizierung des Zielproteins auch in komplexen Proteingemischen. Soll ein bestimmtes Protein
durch ELISA nachgewiesen werden, müssen entsprechende Antikörper verfügbar sein. Diese können
entweder durch Immunisierung von Versuchstieren oder gentechnologisch gewonnen werden und
sind inzwischen in großer Auswahl kommerziell erhältlich.
Der ELISA basiert auf der Immobilisierung der Proteine des zu untersuchenden Gemisches auf einer
Trägeroberfläche und anschließendem Nachweis des gebundenen Zielproteins durch einen
Antikörper. Dieser kann entweder direkt an ein Enzym gekoppelt sein oder durch einen enzymgekoppelten
Zweitantikörper detektiert werden. Eine durch das konjugierte Enzym katalysierte
Farbreaktion kann photometrisch gemessen werden und erlaubt die Konzentrationsbestimmung des
Zielproteins anhand einer Eichkurve.
Eine spezielle Form des ELISA ist der Sandwich-ELISA. Dabei wird das gesuchte Protein durch einen
immobilisierten „Fänger-Antikörper“ spezifisch aus einem Proteingemisch herausgefischt. Ein weiterer,
gegen das Protein gerichteter (1.) Antikörper, der aus einer anderen Spezies als der Fänger-
Antikörper stammt, wird auf den gewaschenen Antigen-Antikörper-Komplex gebracht. Schließlich folgt
ein mit Enzym-konjugierter (2.) Antikörper, der gegen den zuletzt aufgebrachten (1.) Antikörper
gerichtet ist. Nach einem weiteren Waschschritt führt ein zugegebenes Substrat zum sichtbaren
Farbumschlag. Eine photometrische Messung folgt dem Abstoppen der Reaktion und anhand der
mitgeführten Eichkurve kann eine Konzentrationsbestimmung erfolgen.
In dem nachfolgenden ELISA muss auf ein „Fänger-Antikörper“ verzichtet werden, da es nur
Antikörper gegen Alcohol-Dehydrogenase aus Kaninchen gibt. Ein klassischer Sandwich-ELISA ist
nicht möglich. Die Proteine bzw. komplexen Proteinmischungen werden direkt an das Trägermedium
gebunden, mit dem Nachteil, dass kein Einfluss auf die Art der gebundenen Proteine genommen
werden kann.
21