SS 2005 BIOCHEMISCHE ARBEITSMETHODEN für Biologen ...

Farbstoffe, die eine Affinität zu bestimmten Enzymen haben, können ebenfalls als Ligand benutzt
werden. So bindet Blue Sepharose Cl-6B (Fa. Pharmacia, Freiburg; s. Abb. 1.7) Kinasen,
Dehydrogenasen und andere Enzyme, die Adenylyl-enthaltende Substanzen (z.B. NAD + ) benötigen.
Die Enzyme lagern sich an, weil der Farbstoff eine strukturelle Ähnlichkeit zu den Nukleotidcofaktoren
hat. Die Elution erfolgt zumeist mit freiem Cofaktor.
Abbildung 1.7: Trennung von Makromolekülen durch Affinitätschromatographie
1.5.2 Aufreinigung von ADH mittels Affinitätschromatographie
Geräte und Reagenzien:
Blue Sepharose Cl-6B (Pharmacia), Glassäule, Äkta Prime Fraktionssammler, Spektralphotometer
Benötigte Lösungen:
Startpuffer: Phosphatpuffer nach Sörensen 20mM, pH 6.4
5mM MgCl2
0,4mM EDTA
500 ml
Elutionspuffer: 60 mg NAD in 15 ml Startpuffer (5mM)
Für den in der Affinitätschromatographie verwendeten Startpuffer werden 75% des gewünschten
Endvolumens an Puffer in Form von 20 mM KH2PO4 vorgelegt und mit 20 mM Na2HPO4 der pH-Wert
von pH 6.4 eingestellt. (Nach Sörensen betragen die Volumenanteile idealerweise 73,6% und 26,4%.)
Diesem Phosphatpuffer werden dann 5 mM MgCl2 und 0,4 mM EDTA zugesetzt.
Vorbereitung:
1,8 g Blue Sepharose werden in 10 ml Startpuffer für 24 h äquilibriert und dann in die Säule gefüllt (ca.
10 cm Füllhöhe). Bei 10 Tropfen/min lässt man das Gel für ca. 30 min sedimentieren.
(Die Säulen werden von den Betreuern vorbereitet)
Durchführung:
Probenvolumen am Fraktionssammler auf 10 ml pro Reagenzglas einstellen. Der Enzymextrakt wird
auf die Säule gepumpt; maximal 300 mg Protein auftragen. Vom Säulendurchlauf eine Probe nehmen.
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