SS 2005 BIOCHEMISCHE ARBEITSMETHODEN für Biologen ...

Die katalytische Aktivität eines Enzyms wird nach Empfehlung der IUB in Katal [kat] angegeben. Sie ist
definiert als diejenige Enzymmenge, die unter den für das Enzym festgelegten Bedingungen bei 30 0 C den
Umsatz von 1 Mol Substrat pro Sekunde katalysiert (1 kat = 1 Mol Substrat • s -1 ). Veraltet, aber ein leider
noch häufig in der Literatur oder in Chemikalienkatalogen zu findender Begriff, ist das Unit (1 U = 1 μMol
Substrat • min -1 = 16.66 nkat). Der die Qualität einer Enzymaufreinigung beschreibende Wert ist die
spezifische Enzymaktivität [kat • g -1 Protein], da hier die Proteinkonzentration mit berücksichtigt wird.
Das Verhältnis der spezif. Aktivität einer Enzymfraktion nach einem Aufreinigungsschritt zur spezif.
Aktivität der Ausgangslösung bestimmt den Aufreinigungsfaktor des Aufreinigungsschrittes.
Aufreinigungsstufe Spezif. Aktivität
[nkat/mg]
Aufreinigungsfaktor Ausbeute
Rohaufschluß 0,68 1,0 100
Hitze/EtOH-Behandlung 1,17 1,7 54
Dialyse 1,87 2,7 54
Anionenaustauschchr. pH 6.5 17,0 25,0 12,4
Anionenaustauschchr. pH 7.5 132,0 194 9,2
Konzentrierung 153,0 225,0 3,6
Gelfiltration 273,0 401,0 2,3
Abbildung 1.2: Beispiel einer Aufreinigungstabelle
Die Ausbeuten einer Enzymaufreinigung werden über die volumetrische Aktivität [kat • ml -1 ] berechnet
(als Beispiel siehe Aufreinigungstabelle Abbildung 1.2). Wenn also in z.B. 300 ml Rohextrakt 6 nkat/ml
Aktivität vorhanden waren (→insgesamt 1800 nkat) und nach einem anschließenden Fällungsschritt das
Pellet in 50 mL Puffer mit einer vol. Aktivität von 26.3 nkat/ml aufgenommen wurde (→insgesamt 1315
nkat), so beträgt die Ausbeute nach der Fällung 73.05%.
Der Erfolg einer Enzymaufreinigung hängt stark mit den Stabilitätseigenschaften des Enzyms zusammen.
Extrazelluläre Enzyme sind naturgemäß stabiler als intrazelluläre und die wiederum stabiler als
membrangebundene Enzyme (extr. E > intr. E > membr. E). Dementsprechend versucht man von Beginn
an das zu bearbeitende Enzym vor inaktivierenden Einflüssen zu schützen und dessen „natürliche
Umgebung“, in der es aktiv ist, zu imitieren. Das heißt, man hält Enzymlösungen bei konstantem pH-Wert
solange wie möglich im Eisbad und gibt, je nach Enzym, Zusätze wie a) Zucker (0.05 -0.2 M), b) EDTA
(1.5 mM), c) Salze (in der Zelle liegt die Ionenstärke um 0.15 - 0.2 M), d) Mercaptoethanol oder Cystein
(5 - 20 mM) und/oder e) spezifische, stabilisierende Agenzien für bestimmte Enzyme wie Zn 2+ für
zinkabhängige Proteine oder Pyridoxalphosphat für pyridoxalphosphat-abhängige Enzyme hinzu.
5
[%]