SS 2005 BIOCHEMISCHE ARBEITSMETHODEN für Biologen ...

Pellet in 10mL 10 mM Phosphatpuffer aufnehmen (= Enzymextrakt E, Probe nehmen!) [um möglichst
geringe Verluste zu haben: zunächst das Pellet in einem Teil des Puffers suspendieren; mit einer
Plastikpasteurpipette mehrfach aufsaugen, um eine homogene Verteilung zu erreichen].
1.2.4 Ermittlung des Fraktionierungsbereiches für die Fällung der ADH durch
Ammoniumsulfat
Benötigte Chemikalien:
Rohextrakt aus dem Hitzeschritt (Ü1)
gesättigte Ammoniumsulfatlösung (AS) 66g/100ml
10mM Kaliumphosphat-Puffer pH 8.0 (PP)
100 ml
Durchführung:
Folgende Testreihe ist unter Nutzung von Eppendorf-Reaktionsgefäße als Inkubationsgefäße
anzusetzen:
Röhrchen Ü1 PP AS
(ml) (ml) (ml)
1 0.2 0.8 0
2 0.2 0.5 0.3
3 0.2 0.4 0.4
4 0.2 0.3 0.5
5 0.2 0.2 0.6
Nach einer Inkubationszeit von 30 min. im Eisbad wird die ADH-Aktivität in jedem Röhrchen durch
Entnahme von 10 µl bestimmt. Um Extinktionsänderungen von 0.1 bis 0.2 pro min. zu erzielen, ist eine
Verdünnung von 1:20 bis 1:100 notwendig. Danach werden die Gefäße 5 min. bei 10.000 x g zentrifugiert
und die Aktivität in gleicher Weise im Überstand bestimmt.
Auswertung:
Die Aktivität der ersten Messserie wird in Prozent (bezogen auf Gefäß 1) angegeben. Sie gibt Auskunft
über die Stabilität des Enzyms unter den Inkubationsbedingungen. Die Überstandsaktivität der zweiten
Messserie wird ebenfalls in Prozent, bezogen auf den jeweiligen Wert vor der Zentrifugation, ermittelt.
Hieraus wird der Anteil an ausgefällter ADH (wiederum in [%] angegeben) bestimmt, gegen die
Ammoniumsulfatkonzentration (angegeben in %-Sättigung) aufgetragen und das erhaltenen Resultat
interpretiert.
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