SS 2005 BIOCHEMISCHE ARBEITSMETHODEN für Biologen ...
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1.2.2 Hitzedenaturierung von Fremdprotein<br />
• Zentrifugation in der Kühlzentrifuge bei > 28.000 g <strong>für</strong> etwa 30 Minuten<br />
• Überstand (Ü0) in einem bereits auf 55°C vorgeheizten Wasserbad (Schüttelwasserbad mit<br />
Einsatz <strong>für</strong> 250 mL Erlenmeyerkolben) schnell erwärmen und 15 Minuten bei dieser<br />
Temperatur belassen; unter fließendem Wasser abkühlen lassen<br />
• Zentrifugation >17.000 g <strong>für</strong> 30 Minuten bei 4°C / Sediment verwerfen<br />
• Überstand (Ü1) auf Eis kalt stellen und <strong>für</strong> Ammoniumsulfatfällung einsetzen<br />
(Nicht vergessen: Proben zur Bestimmung der Aktivität und Proteingehalt abnehmen)<br />
1.2.3 Fraktionierte Ammoniumsulfatfällung<br />
Das Löslichkeitsverhalten eines Proteins in einem Lösungsmittel wird durch die Interaktionen seiner<br />
geladenen Oberflächenreste mit den Molekülen des Lösungsmittels bestimmt. Diese Interaktionen<br />
können durch folgende Zusätze manipuliert werden, so dass die Proteine als Aggregate aus der Lösung<br />
ausfallen:<br />
• Zugabe anorganischer Salze • Zugabe organischer Lösungsmittel<br />
• Zugabe basischer Proteine • Zugabe von Polyethylenglycol<br />
• pH Änderung • Temperaturänderung<br />
Die am häufigsten angewandte Methode ist die fraktionierte Fällung durch die Zugabe von anorganischen<br />
Salzen, meist (NH4)2SO4. Das „Aussalzverhalten“ eines Proteins wird durch Anzahl und Fläche der<br />
hydrophoben Bereiche auf der Proteinoberfläche bestimmt (Seitenketten von Phe, Tyr, Trp, Leu, Ile, Met,<br />
Val). Wenn zur Hydratation eines Salzes immer mehr Wassermoleküle benötigt werden, kommt es zu<br />
häufigeren hydrophoben Wechselwirkungen der Proteine untereinander und zur Bildung von Aggregaten,<br />
die schließlich präzipitieren. Stark apolare Proteine präzipitieren daher bei geringerer Salzkonzentration<br />
als solche, deren Polarität groß ist. Durch Co-Präzipitation unterschiedlicher Proteine ist eine völlige<br />
Aufreinigung selten möglich. Eine Ausnahme ist die Salzfällung der Glycerinaldehydphosphat-<br />
Dehydrogenase (EC 1.2.1.12). Bei pH 6.0 ist das Enzym in 3.2 M (NH4)2SO4 löslich. Durch einen pH-<br />
Shift auf pH 7.5 oder höher kristallisiert das Enzym aus dem Rohextrakt aus.<br />
Benötigte Chemikalien:<br />
fein gemörsertes Ammoniumsulfat<br />
10mM Kaliumphosphat-Puffer, pH 8.0 1 l<br />
Zu 100 mL des erhaltenen Überstandes (Ü1) bei 4°C 21g festes, vorher fein gemörsertes<br />
Ammoniumsulfat (40% Sättigung) in kleinen Portionen (insges. auf ca. 20 min verteilen) unter Rühren<br />
zugeben. Die Lösung <strong>für</strong> 30 min. stehen lassen und anschließend mit ca. 30.000 x g = 16.000 rpm (<strong>SS</strong>34<br />
Rotor) <strong>für</strong> 20 Minuten abzentrifugieren. Das Pellet verwerfen und zum Überstand weitere 14,2 g<br />
Ammoniumsulfat in kleinen Portionen unter Rühren bei 4°C zugeben (55% Sättigung). Wiederum 30 min.<br />
stehen lassen und anschließend bei ca. 30.000 x g (<strong>SS</strong>34 Rotor) <strong>für</strong> 20 Minuten abzentrifugieren (nicht<br />
vergessen: Probe Ü2).<br />
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