Kein Folientitel - TCI @ Uni-Hannover.de

Elektrophoretische MethodenTeil I: GelelektrophoreseDr. Cornelia KasperUniversität HannoverInstitut für Technische ChemieCallinstr. . 330167 HannoverGermanyDr. Cornelia KasperTCI Institut fürTechnische Chemie

GliederungTheoretische GrundlagenGelmedienInstrumentierungElektrophoretische Grundlagen undDurchführungPräparative MethodenHochauflösende zweidimensionaleElektrophoreseDr. Cornelia KasperTCI Institut fürTechnische Chemie

ElektrophoreseUnter Elektrophorese versteht man die Wanderung vonTeilchen im elektrischen Feld.Eigenschaften der Teilchen (Ladung, Größe) bewirkeneine unterschiedliche elektrophoretische Beweglichkeit.Die Teilchen trennen sich dabei in einzelne Zonen auf.Dr. Cornelia KasperTCI Institut fürTechnische Chemie

Theoretischen GrundlagenIn einem elektrischen Feld wirken unterschiedliche Kräfte auf eingeladenes Teilchen:Beschleunigende Kraft:Reibungskraft:FeFtr= q ⋅ E mitq = z ⋅ e=fc⋅vq: Ladung E: elektrische Feldstärkefc: : Reibungskoeffizient v: WanderungsgeschwindigkeitStehen die Kräfte im Gleichgewicht, bewegen sich Teilchen miteiner konstanten Geschwindigkeit im elektrischen Feld.Dr. Cornelia KasperTCI Institut fürTechnische Chemie

Fe=Ffr→q⋅E=fc⋅vq⋅Ev==u⋅EfcDer Faktor u ist ein Proportionalitätsfaktor tsfaktor zwischenWanderungsgeschwindigkeit und Feldstärke.Er wird als Mobilität t bezeichnet und istsubstanzspezifisch.Dr. Cornelia KasperTCI Institut fürTechnische Chemie

Effekte auf das Teilchen im elektrischen FeldF e: BeschleunigungskraftF RET : RetardationskraftF REL : RelaxationskraftF r : ReibungskraftDr. Cornelia KasperAuf Grund beider Effekte nimmt dieMobilität bei zunehmender Ionenstärke ab.TCI Institut fürTechnische Chemie

RetardationseffektNach der Debye-HückelTheorie ist um das Zentralioneine Ionenatmosphäre entgegengesetzter Ladungaufgebaut. Sie bewirkt, das das Teilchen durch eineLösung wandert, die entgegengesetzt fließt. →RetardationseffektRelaxationseffektDurch Anlegen eines elektrischen Feldes wird dieIonenwolke hinter dem Zentralion her gezogen, das Ionwird abgebremst. → RelaxationDr. Cornelia KasperTCI Institut fürTechnische Chemie

Bei schwachen Basen und Säuren ist nicht dieMobilität des vollständig dissozierten Teilchens wichtig,sondern die effektive Mobilität ueff.Sie wird über den Dissoziationsgrad α mit derIonenmobilität verknüpft:ueff= ∑ α ⋅ uiα: DissoziationsgradDie Wanderungsgeschwindigkeit kann bei schwachenSäuren und Basen über pH-Werteinstellungenoptimiert werden.Dr. Cornelia KasperTCI Institut fürTechnische Chemie

PuffersystemeBei Durchführung einer Elektrophorese wandern nichtnur die Probenionen, , sondern auch die dissoziertenPufferionen.An beiden Elektroden müssen daher Pufferreservoirs mitausreichend Puffer vorhanden sein.Verwendet werden Säure/ Base- Systeme, z.B. Tris-Chlorid, Tris-BoridDr. Cornelia KasperTCI Institut fürTechnische Chemie

WärmeabfuhrDurch den Einsatz von Strom wirdbei einer elektrophoreseJoulsche Wärme entwickelt.Pro Volumeneinheitentwickelte Wärme W gilt:c = molare Konzentration desElektrolytenλ = ÄquivalenzleitfähigkeitF = Faraday- KonstanteE = elektrische Feldstärkeui = Mobilitätzi = AnzahlFür λ gilt:Wλ == E²⋅λ⋅cui⋅zi⋅FDr. Cornelia KasperTCI Institut fürTechnische Chemie

Die Wärmeabfuhr erfolgt über die Wände oder eine Seitedes SystemsEin Temperaturgradient entstehtBei trägerfreier Elektrophorese kommt es zurDurchmischungBei einer Kapillar- oder Gelelektrophorese solltengeringe Innendurchmesser bzw. dünne Schichtenverwendet werden, damit die Temperaturdifferenz geringgehalten werden kann.Die Materialien sollten eine gute Wärmeleitfähigkeithaben.Dr. Cornelia KasperTCI Institut fürTechnische Chemie

Elektrochemische DoppelschichtAuf der Oberfläche vieler Materialien ( Glas, Teflon,Papier, Agarose) ) bildet sich bei Kontakt mitElektrolytlösungen eine elektrochemische Doppelschicht.Grund : OberflächenladungenErläuterungen an einem Beispiel aus fused Silica –Kapillaren:Dr. Cornelia KasperTCI Institut fürTechnische Chemie

Aufbau und Potentialverlaufder elektrochemischenDoppelschicht•Bei der Dissoziation vonSilanolgruppen werden negativeLadungen an der Wand ausgebildet.• Diese werden durch positiveGegenladungen aus der Lösungkompensiert.•Die Abbildung zeigt einenPotentialabfall.•In der starren Schicht an derWandung ist der Abfall linear.•In diffusen Schicht in der Lösung liegtein exponentieller Abfall vor.Dr. Cornelia KasperTCI Institut fürTechnische Chemie

Elektroosmotischer Fluß (EOF)Durch die Doppelschicht bedingt wird bei Anlegen einerelektrischen Spannung das Lösungsmittel in einen Fluß (EOF) inRichtung der Kathode gebracht. Eine Strömung in der flüssigenPhase tritt auf.Grund: positiven Gegenladungen der Doppelschicht.Geschwindigkeit des EOF: abhängig vom ζ-PotentialvEOFε ⋅ζ⋅ E= 4 ⋅∏⋅ηε: Dielektrizitätskonstantetskonstanteζ: Zeta-PotentialE: elektrische Feldstärkeη: : ViskositätIn der Gelelektrophorese tritt die Elektroendosmose auf.Folgen: da der EOF der Richtung der Probenionenentgegengesetzt ist, sind Verzerrungen und Verdünnungen derZonen die Folge.Dr. Cornelia KasperTCI Institut fürTechnische Chemie

Elektroendosmose: Aufgrund fixierter Ladungen an der Matrixoberflächeentsteht im elektrischen Feld ein der Elektrophoreserichtungentgegengesetzter osmotischer Fluß.Dr. Cornelia KasperTCI Institut fürTechnische Chemie

GelmedienDr. Cornelia KasperTCI Institut fürTechnische Chemie

Agarose•Einfache Handhabung•Ungiftig•Werden eingesetzt zurTrennung hochmolekularerProteine über 500 kDa•Niedrige Siebwirkung fürkleine Proteine•Gele sind nicht klar•Sind nicht ElektroendosmosefreiDr. Cornelia KasperTCI Institut fürTechnische Chemie

PolyacrylamidVernetzungsmuster des Polyacrylamids (PA)Dr. Cornelia KasperTCI Institut fürTechnische Chemie

PolyacrylamidgelePA ist chemisch inert und stabil (Gele reißen nicht soleicht)Geringe ElektroendosmoseKlare Gele auf Grund Vernetzer N,N´-Methylenbisacrylamid.Porengröße der Gele ist von der Konzentration und demVernetzungsgrad abhängigEignen sich für viele FärbemethodenDr. Cornelia KasperTCI Institut fürTechnische Chemie

Nachteile:Monomer ist toxischProteine über 800 kDa können nichtgetrennt werdenDr. Cornelia KasperTCI Institut fürTechnische Chemie

Nachweis der getrennten Proteine:FärbemethodenDie Proteine werden direkt im Gel angefärbtCoomassie-BrilliantBlueEinfachste Methode, kurze FärbemethodeProteine werden blau angefärbtEmpfindlichkeit: 100 ng – 1 µg pro BandeSilberfärbungSilberionen werden von Proteinen gebunden und durchReduktion in Silber umgewandelt. Mechanismus ähnlichdem der FotografieEmpfindliche Methode, längere FärbezeitenEmpfindlichkeit: ng-Bereich pro BandeDr. Cornelia KasperTCI Institut fürTechnische Chemie

Beispiel eines Coomassie gefärbten Gels1 2 3Die Banden in den Taschen/Spuren 1-3 sindMarkerproteine.Dr. Cornelia KasperTCI Institut fürTechnische Chemie

Beispiel eines AgarosegelsDargestellt sind PCR-Produkte. Links befindet sich einStandard.Die Färbung erfolgte mit Ethidiumbromid und wird unterUV-Licht (254 nm) fotographiert.Dr. Cornelia KasperTCI Institut fürTechnische Chemie

InstrumentierungDr. Cornelia KasperTCI Institut fürTechnische Chemie

InstrumentierungGrundsätzlich finden horizontale und vertikale SystemeVerwendung.Vertikale Systeme: : Die Gele sind in Kassetten oder aufTrägermaterial (Glasplatten, Polycarbonatplatten)befestigt und von flüssigem Puffer umgeben. Die Probenwerden in Taschen am oberen Ende der Geleaufgegeben. Die Proben laufen von oben nach unten.Die schweren und großen Proteine befinden sich imoberen Teil des Gels.Die Wärmeabfuhr wird durch Kühlung mittels der Puffergeregelt.Dr. Cornelia KasperTCI Institut fürTechnische Chemie

Vertikale ElektrophoreseapparaturDr. Cornelia KasperTCI Institut fürTechnische Chemie

Horizontale Systeme: : Die Gele können auf einemTrägermaterial aufgetragen sein. Die Versorgung mitPufferionen erfolgt entweder durch Filterpapierstreifen,die in Flüssigpuffertanks hängen oder durch getränkteFilterpapierstreifen.Moderne Systeme verwenden Gelstreifen die mit denPufferionen versetzt sind. Das Verfahren ist als semidryanzusehen.Die Probe kann über einen aufliegenden Filterstreifenaufgebracht werden oder sie werden in eingegosseneTaschen pipettiert.Die entstehende Wärme muss abgeführt werden, daherhaben solche Systeme eine Wasserkühlung.Die Elektrophorese wird mit Spannungen von 200Vdurchgeführt werden.Dr. Cornelia KasperTCI Institut fürTechnische Chemie

Horizontales Elektrophorese SystemeB: statt Filterpapierstreifen werdenauch Gelstreifen mit Puffer verwendetDr. Cornelia KasperTCI Institut fürTechnische Chemie

Elektrophoretische Grundprinzipien undDurchführung von ElektrophoresenDr. Cornelia KasperTCI Institut fürTechnische Chemie

Elektrophoretische GrundprinzipienZonenelektrophorese: : Trennprinzip beruht aufunterschiedlichen Wanderungsgeschwindigkeiten dergeladenen Teilchen im Feld. Grundlage jederElektrophoreseIsotachophorese: : Die geladenen Teilchen wandern allemit der gleichen Geschwindigkeit im diskontinuierlichenSystem.IsoelektrischeFocussierung: : Trennung der Teilchennach dem isoelektrischen Punkt innerhalb eines pH-GradientenDr. Cornelia KasperTCI Institut fürTechnische Chemie

Elektrophorestische GrundprinzipienDr. Cornelia KasperTCI Institut fürTechnische Chemie

ZonenelektrophoreseGrundprinzip der ElektrophoreseTrennung eines Proteingemisches in ZonenDas Trennprinzip beruht auf den unterschiedlichenWanderungsgeschwindigkeiten (→Mobilit(Mobilität) t)Beeinflussung der Ladung durch Temperatur und pH-Wert des PuffersUnveränderlicher nderlicher pH-Wert des GelsBestimmung nach Molekulargewicht, Molekülgrlgröße e oderisoelektrischer PunktDr. Cornelia KasperTCI Institut fürTechnische Chemie

• Probenauftrag der gemischtenProteine• Auftrennung in ZonenDr. Cornelia KasperTCI Institut fürTechnische Chemie

PorengradientengeleDienen zur Ermittlung von Molekülgrößen einesProteins.Durch eine kontinuierliche Veränderung der Vernetzungeines Gels erhält man einen Gradienten.Die Proteine bleiben in der enger werdenden Poren desGels je nach Größe stecken.Dr. Cornelia KasperTCI Institut fürTechnische Chemie

Herstellung eines linearenPorengradientengelsZwei Polymerisationslösungen mitunterschiedlicherMonomerkonzentration werden mitHilfe eines Gradientenmischersvermischt. Dabei wird derhöherkonzentrierten LösungdieniederkonzentrierteLösungzugemischt.Um ein Vermischen in derGelkassette zu verhindern wird diekonzentrierte Lösung Glycerinüberschichtet.Dr. Cornelia KasperTCI Institut fürTechnische Chemie

Disk-ElektrophoreseDisk steht für diskontinuierlichGelmatrix ist in zwei Bereiche geteilt:weitporiges Sammelgel und engporigesTrenngelVorteil : die Aggregation der Proteine wirdverhindert, man erhält schärfere BandenKombination zweier Puffersysteme: Tris-ChloridChlorid/Tris-GlycinGlycin-SystemDr. Cornelia KasperTCI Institut fürTechnische Chemie

Sammelgel pH 6,8 und Trenngel pH 8,8Glycinhat auf Grund des pH-Wertes eineniedrige elektrophoretische Mobilität und fungiertals Folge-Ion, Chlorid hat eine hohe Mobilitätund dient als Leit-Ion.Die Mobilitäten der aufzutrennenden Proteineliegen zwischen denen der Leit- und Folge-Ionen.Dr. Cornelia KasperTCI Institut fürTechnische Chemie

Prinzip der diskontinuierlichen ElektrophoreseNach Anlegen des elektrischen Feldes setzt die Isotachophorese ein: alle Ionenwandern mit der gleichen Geschwindigkeit und bilden einen Proteinstapel inReihenfolge ihrer Mobilitäten.Dr. Cornelia KasperTCI Institut fürTechnische Chemie

Proteinstapel wandert langsam in RichtungAnode.Bei dem Übergang in das engporige Trenngelbildet sich eine Art „Stau“.Proteine erfahren einen Reibungswiderstand.Der Stapel löst sich im homogenen Puffer auf.Die einzelnen Komponenten trennen sich nunnach dem Zonenprinzip auf.Die Proteinenfolge ändert sich, da im Trenngeldie Molekülgröße einen großen Einfluß auf dieMobilität hat.Dr. Cornelia KasperTCI Institut fürTechnische Chemie

Saure NativelektrophoreseMethode zur Trennung von basischen Proteinen(z.B. Getreideproteine)Saures Puffersystem (z.B. HEPES –PufferpH5,5)Proteine sind positiv geladen und wandern zurKathodeDr. Cornelia KasperTCI Institut fürTechnische Chemie

SDS-PAGESDS steht für Sodium dodecyl sulfateAnionisches DetergenzÜberdeckt die Eigenladungen der Proteine →Entstehung von Micellen mit konstanter negativerLadung pro Masseneinheit1,4 g SDS pro g ProteinPAGE steht für Polyacrylamidgel-ElektrophoreseStandardmäßig wird eine diskontnuierlicheElektrophorese mit SDS-haltigenTris-HCLHCL/ Tris-GlycinPuffern nach Lämmli durchgeführt.Dr. Cornelia KasperTCI Institut fürTechnische Chemie

ProbenvorbereitungProben werden mit einem Puffer versetzt, der die nötigeMenge SDS im Überschuß enthältZusätzlich wird Mercaptoethanol frisch dazu gegeben→ Aufspaltung von Schwefelbrücken cken zwischen CysteinenDie Proben werden für f r 5 min auf 95°C C erhitzt→ es erfolgt eine Streckung des Moleküls, ls, Sekundär- undTertiärstrukturen rstrukturen werden aufgebrochenProben werden nach Erhitzen abzentrifugiert undkönnen auf das Gel pipettiert werden.Dr. Cornelia KasperTCI Institut fürTechnische Chemie

Vorteile der SDS-PAGEProteinaggregation wird verhindertSchnelle Trennungen, da die Micellen hohe LadungentragenTrennung erfolgt nur nach einem Parameter(Molekulargewicht)Es gehen auch sehr hydrophobe und denaturierteProteine in LösungNachteile der SDS-PAGEDenaturierung ist irreversibelSDS ist nicht kompartibel mit nicht-ionischenionischenDetergenzienDr. Cornelia KasperTCI Institut fürTechnische Chemie

SDS-PAGESpur 3 enthält einMarkergemischRechts Angabe derMolmassen derMarkerproteine in kDaDr. Cornelia KasperTCI Institut fürTechnische Chemie

Beispiel eines silbergefärbten SDS-Gels1 2In den Spuren 1 und 2 sind MarkerproteineDr. Cornelia KasperTCI Institut fürTechnische Chemie

Isoelektrische Focussierung (IEF)Protein wandert im elektrischen Feld durch einen pH-GradientenAn dem Punkt, an dem die Nettoladung gleich Null istbefindet sich sein isoelektrischer PunktNettoladung eines Protein = Summe aller negativen undpositiven Ladungen an den AminosäuregruppenIEF ist im Gegensatz zu den anderenelektrophoretischen Methoden eine Endpunktmethode→ die Proteine können knicht mehr weiter wandernDr. Cornelia KasperTCI Institut fürTechnische Chemie

A: Nettoladungskurven zweier Proteine A und BB: Fokussierung der Probenproteine A und B im FeldDr. Cornelia KasperTCI Institut fürTechnische Chemie

Bestimmt man die Nettoladungen der Proteine beiunterschiedlichen pH-Werten erhält man einecharakteristische Kurve.Der Schnittpunkt der Kurve mit der x-Achse xgibt denisoelektrischen Punkt des Proteins an.Als Trennmedien dienen auch hier Agarosegele und PA-Gele.In den Gelen muß der Gradient stabil sein und einegleichmäßige Leitfähigkeit vorweisenZwei Konzepte finden Verwendung:pH-Gradientenaus freien Trägerampholyten undimmobilisierte pH-GradientenDr. Cornelia KasperTCI Institut fürTechnische Chemie

TrägerampholyteIdeale Trägerampholyte weisen folgende Eigenschaftenaus:Hohe Pufferkapazität und Löslichkeit am pIGleichmäßige LeitfähigkeitFrei von biologischen EffektenNiedriges MolekulargewichtTrägerampholyte bestehen aus mehreren hundertunterschiedlichen aliphatischen Oligoamino-Oligocarbonsäuren mit unterschiedlichen pI-WertenWerten.Dr. Cornelia KasperTCI Institut fürTechnische Chemie

Konzentrationen der Ampholyte muß gleich im Gel sein,sonst treten Lücken im pH Spektrum auf.2% Ampholyte im GelNach anlegen des elektrischen Feldes richten sich diegeladenen Teilchen aus und bilden den GradientenDie Trägerampholyte mit dem niedrigsten pI wandern bisan das anodische Ende des Gels, die Ampholyte mitdem höchsten pI wandern an das kathodische Ende.Der Gradient kann nach langer Focussionszeit anfangenzu driften (Kathodendrift). Banden werden unscharf,basische Proteine gehen verloren.Vorteil: Trägerampholyte wirken als Zwitterionen und haltenProteine in LösungDr. Cornelia KasperTCI Institut fürTechnische Chemie

Immobilisierte pH-Gradienten(IPG)IPG sind in die Gelmatrix einpolymerisiertEingesetzt werden dazu bifunktionelle ImmobilineH2C=CH-C=O C=O (–NHR)(Immobiline sind Acrylamidderivate und somit schwacheSäuren oder schwache Basen.Definition der Immobiline erfolgt über ihre pK-WerteMan benötigt zwei unterschiedliche Immobiline.Der zupuffernde pH-Wert ergibt sich aus demMischungsverhältnis.Dr. Cornelia KasperTCI Institut fürTechnische Chemie

Immobilisierte puffernde Gruppen ineinem Polyacrylamidnetzwerk.Dr. Cornelia KasperTCI Institut fürTechnische Chemie

Herstellung immobilisierter pH-GradientenMischen von unterschiedlichen Polymerisationslösungenmit GradientenmischerLösungen enthalten Acrylamidmonomere zurPolymerisation einer Matrix auf einer Trägerfolie.Die Immobiline werden kovalent an dasPolyacrylnetzwerk gebunden.Nach der Polymerisation müssen die Katalysatoren mitWasser aus der Matrix entfernt werden.Gel wird getrocknet und kann bei -20C gelagert werden.Vor Gebrauch wird das Gel in Additiva (Harnstoff,Dithiothreitol, Detergenzien) ) wieder gequollen.Dr. Cornelia KasperTCI Institut fürTechnische Chemie

Vorteile:Endpunktmethode mit hoher AuflösungIP läßt sich dirket ablesenKombination mit SDS-ElektrophoreseElektrophorese→ 2D-ElektrophoreseNachteile:Aufwendigere Färbtechniken Fals bei derZonenelektrophoreseAufwendiges HerstellungsverfahrenAggregierende Proteine (Membranproteine) können knicht indas Gel einwandernLange TrennzeitenDr. Cornelia KasperTCI Institut fürTechnische Chemie

Isoelektrische Focussierung:A: IEF im Bereich pH 4,35-4,55 B: IEF im Bereich pH 4-10Dr. Cornelia KasperTCI Institut fürTechnische Chemie

TitrationkurvenanalyseBestimmung von Nettoladungskurven von ProteinenDurchführung:IEF ohne Probe wird auf einem Trägerampholytgeldurchgeführt→ Bildung des pH-GradientenGel wird um 90° gedrehtProbe wird in eine Gelrinne pipettiertNach Anlegen eines elektrischen Feldes wandern dieProteine in Abhängigkeit ihres pH-Wertes mitunterschiedlichen Mobilitäten.Bildung von Titrationskurven mit Schnittpunkt des pI desProteins an der GelrinneDr. Cornelia KasperTCI Institut fürTechnische Chemie

A: Probenaufgabe auf ein vorfocussiertes GelB: Nettoladungskurven nach Anlegen des elektrischenFeldesDr. Cornelia KasperTCI Institut fürTechnische Chemie

Präparative elektrophorestische VerfahrenElektroelution aus GelenPräparative ZonenelektrophoresePräparative isoelektrische FocussierungDr. Cornelia KasperTCI Institut fürTechnische Chemie

Elektroelution aus GelenDient zur Gewinnung von Proteinen aus PA-Gelen zurweiteren AnalyseMethode A: Protein aus einem ausgeschnittenenGelstückchen wird in einer Vertikalelektrophorsekammerin eine Dialysemembran transportiert.Methode B: Das Protein wird mittels Puffer ohneDialysemembran in einer Miniapparatur in einReaktiongefäß hineineluiert.Dr. Cornelia KasperTCI Institut fürTechnische Chemie

Dr. Cornelia KasperTCI Institut fürTechnische Chemie

Präparative ZonenelektrophoreseReinigungsmethodefürmg-Mengen ProteinElektrophoreseundTrennung in einzelneZonen wird mitPolyacrylamidgelenineinemGlasrohrdurchgeführt.AnkommendeZonenwerdendurchkontnuierlichenPufferstrom abgeführt.Dr. Cornelia KasperTCI Institut fürTechnische Chemie

Präparative IEFAufreinigungsmethode für größere Mengen ProteinKein Gel mit immobilisierten pH-GradientenMehrkammer-Focussierungsapparaturmit gepuffertenisoelektrischen PolyacrylamidmembranenZur Probenauftrennung gibt man ein Proteingemisch ineine KammerDie Proteine wandern nach Anlegen eines Feldes in diebenachbarten Kammern gemäß ihren isoelektrischenWertenDas aufgereinigte Protein kann der Kammer entnommenwerdenDr. Cornelia KasperTCI Institut fürTechnische Chemie

Dr. Cornelia KasperTCI Institut fürTechnische Chemie

Hochauflösende zweidimensionaleElektrophoreseSehr großes AuflösungsvermögenAuftrennung der Proteine erfolgt nach zwei Kriterien:isoelektrischer Punkt und MolmasseProteine mit gleicher Molmasse oder gleichem pI-Wertkönnen durch die zweite Dimension aufgetrennt werden.Trenntechnik zur qualitativen und quantitativenUntersuchung der Proteinexpression von Zellen,Geweben und Organismen (Proteomics(Proteomics)mikropräparative Reinigung von Proteinen auskomplexen Proteingemischen für deren nachfolgendeCharakterisierung und IdentifizierungDr. Cornelia KasperTCI Institut fürTechnische Chemie

Prinzip1.DimensionDurchführen einer isoelektrischen Fokussierung: dieProteine ordnen sich gemäß ihrem pI-Wertauf demTrägerampholyten oder IPG Streifen an2. Dimensionder Trägerampholyt/ Gelstreifen wird um 90% gedrehtauf das SDS-Gel gelegt:die Proteine werden gemäß ihrer Masse getrenntDr. Cornelia KasperTCI Institut fürTechnische Chemie

Einsatz vonTrägerampholyten oderIPG-Streifenin der ersten DimensionDr. Cornelia KasperTCI Institut fürTechnische Chemie

2D-Elektrophorese mit Trägerampholyten hat Nachteile:Mangelnde Reproduzierbarkeit der 2D-GeleUnterschiedliche Focussierungsmuster ( Grund:unterschiedliche Herstellungschargen)KathodendriftMängel konnten mit Einsatz der immobilisierten pH-Gradient beseitigt werden.Dr. Cornelia KasperTCI Institut fürTechnische Chemie

Hochauflösende 2D-Elektrophorese mit TrägerampholytenDr. Cornelia KasperTCI Institut fürTechnische Chemie

2-D-Elektrophorese( mit immobilisierten pH-Gradienten)1.Dimension:•Rehydrierender IPG-Streifenmit Probe•Durchführen der IEF, Trennungnach IP•Umpuffern mit DTT undanschließend mit IAA2.Dimension:•Auflegen des IPG-StreifensStreifens,quer zur Laufrichtung derProteine•Auftrennen nach Molmasse•Fixierung und FärbungDr. Cornelia KasperTCI Institut fürTechnische Chemie

Abbildung eines 2-D-SDS2SDS-PAGE einer Mäuseleberprobe ( Görg A.,Biochem.Soc. . Trans., 21 (1993)Dr. Cornelia KasperTCI Institut fürTechnische Chemie

2D-Gel einer Probe mit StandardproteinenDr. Cornelia KasperTCI Institut fürTechnische Chemie