Spezies-spezifische und Zelltyp-spezifische Regulation von Toll-like ...

Material und MethodenLadepuffer (5x): 500 µl (50 mM) 1 M Tris/HCl pH 7.8500 µl (1%) SDS (20%)1 ml (50 mM) EDTA (0,5 M, pH 8.0)4 ml (40%) Glycerin10 mg (1%) BromphenolblauH 2 O ad 10 ml.Tabelle 3-1. DNA-Agarosegele1% Agarose 3% AgaroseTAE (1x) 50 ml 150 ml 150 mlAgarose 0,5 g 1,5 g 4,5 gEtBr 2,5 µl 7,5 µl 7,5 µlDie jeweilige in Tabelle 3-1 angegebene Agarosemenge wurde mit derentsprechenden Menge an 1x TAE versetzt und in der Mikrowelle zum Kochengebracht, bis die Agarose vollständig geschmolzen war. Ethidiumbromid (EtBr)wurde erst nach Abkühlen der Lösung auf ca. 50-60°C zugegeben und dann dasGel gegossen. Als Laufpuffer wurde 1x TAE-Puffer verwendet. Vier Teile DNA-Probe wurden mit einem Teil DNA-Ladepuffer versetzt und aufgetragen. Je nachGröße der Kammer erfolgte der Lauf bei 40-120 V für 0,5 - 2 Stunden.3.2.5.2 Gelextraktion von DNA-FragmentenDNA-Fragmente nach Restriktionsverdau oder PCR-Amplifikation wurden aufeinem Agarosegel aufgetrennt. Unter UV-Licht wurde die gewünschte Bande ausdem Gel ausgeschnitten und mit Hilfe des NucleoSpin® Extract II Kits (Macherey& Nagel) nach Anleitung des Herstellers die DNA extrahiert.3.2.5.3 RestriktionsverdauZum Schneiden von DNA mit Restriktionsenzymen wurden die Puffer- undEnzymkombinationen der Firma NEB und Roche verwendet. Grundzätzlichwurden 5 U Enzym/µg DNA in einem Endvolumen von 20 µl, bestehend aus H 2 O,10% enzymabhängiger Puffer und DNA, eingesetzt und bei 37°C für 1,5 Stundenverdaut.3.2.5.4 Klonierung von DNA-FragmentenIsolierte und durch Restriktionsverdau gewonnene DNA-Fragmente wurden überRestriktionsschnittstellen in entsprechend geschnittene Plasmide ligiert. Dabeiwurde die DNA im Verhältnis Insert/Vektor 3:1 eingesetzt und die Ligation mit dem26