Spezies-spezifische und Zelltyp-spezifische Regulation von Toll-like ...

Material und MethodenNuclear Lysis Buffer (L2): 2,5 ml (50 mM) Tris/HCl (1M), pH 7.4 bei 20°C2,5 ml (1%) SDS (20%)833 µl (0,5%) Empigen (30%)1 ml (10 mM) EDTA (0,5 M, pH 8.0)H 2 O ad 50 ml.Unmittelbar vor Gebrauch zugegeben/ml L2:10 µl (1 mM) PMSF (100 mM in Isopropanol)1 µl (2 µg/µl) Aprotinin1 µl (1 µg/µl) PepstatinDilution Buffer (DB): 1 ml (20 mM) Tris/HCl (1M), pH 7.4 bei 20°C1 ml (100 mM) NaCl (5 M)200 µl (2 mM) EDTA (0,5 M, pH 8.0)2,5 ml (0,5%) TritonX-100 (10%)H 2 O ad 50 ml.Unmittelbar vor Gebrauch zugegeben/ml DB:1 µl (2 µg/µl) Aprotinin1 µl (1 µg/µl) PepstatinWash Buffer I (WBI): 1 ml (20 mM) Tris/HCl (1 M), pH 7.4 bei 20°C1,5 ml (150 mM) NaCl (5 M)250 µl (0,1%) SDS (20%)5 ml (1%) TritonX-100 (10%)200 µl (2 mM) EDTA (0,5 M, pH 8.0)H 2 O ad 50 ml.Wash Buffer II (WBII): 1 ml (20 mM) Tris/HCl (1 M), pH 7.4 bei 20°C5 ml (500 mM) NaCl (5 M)5 ml (1%) TritonX-100 (10%)200 µl (2 mM) EDTA (0,5 M, pH 8.0)H 2 O ad 50 ml.Wash Buffer III (WBIII): 0,5 ml (10 mM) Tris/HCl (1 M), pH 7.4 bei 20°C2,5 ml (250 mM) LiCl (5 M)5 ml (1%) NP-40 (10%)5 ml (1%) Deoxycholat (10%)100 µl (1 mM) EDTA (0,5 M, pH 8.0)H 2 O ad 50 ml.Elution Buffer (EB): 450 µl (0,1 M) NaHCO 3 (1 M)225 µl (1%) SDS (20%)H 2 O ad 4,5 ml.Sepharose CL4B:Protein A/G Sepharose50 µl pro Preclearing30 µl pro Präzipitation→ vorher 2x mit PBS gewaschen.Die Chromatin-Immunpräzipitation stellt eine Methode dar, um in vivo gebundenesKernprotein an definierte DNA-Bereiche nachzuweisen. Dazu wird DNA mit demdaran gebundenen Protein kovalent vernetzt, fragmentiert und mit entsprechendenAntikörpern immunpräzipitiert. Mit genspezifischen Primern wird schließlich dieAnreicherung gegenüber einem unspezifischen Antikörper durch quantitative PCRbestimmt.Pro Ansatz wurden 5 x 10 6 Zellen in 10 ml Kulturmedium in10 cm-Gewebekulturschalen ausgesät. Am nächsten Tag erfolgte die Fixierung38