Spezies-spezifische und Zelltyp-spezifische Regulation von Toll-like ...

Material und MethodenEthanol (80%): 80 ml (80%) EthanolH 2 O DEPC ad 100 ml (bei 4°C).Polypropylen-RöhrchenChloroform/Phenol-beständigSolution D wurde frisch mit 7 µl/ml Mercaptoethanol versetzt. Bei adhärentenZellen wurde das Medium abgegossen und Solution D auf die Zellen gegeben(2 ml pro 150 mm-Schale). Das Lysat wurde mit einem Zellschaber abgekratzt, miteiner Spritze (0,9 x 40 mm) in ein steriles 14 ml Röhrchen überführt und 10x durchdie Spritze gedrückt. Nach dem Ansäuern des Lysats mit 2 M NaAcetat (0,1 ml pro1 ml Lysat) wurde es sofort weiterverarbeitet oder bei -20°C gelagert.Nichtadhärente Zellen wurden abzentrifugiert, direkt mit der entsprechendenMenge Solution D versetzt und sofort durch die Spritze gedrückt.Auf 1 ml Lysat wurde die gleiche Menge Phenol und 0,2 mlChloroform-Isoamylalkohol pipettiert und gut geschüttelt. Es sollte sich einemilchige Suspension bilden, andernfalls musste noch Chloroform zugegebenwerden. Die Suspension wurde 15 Minuten auf Eis gestellt, zentrifugiert (20 min,10.000 g, 4°C) und die obere wässrige Phase ohne Interphase abgenommen.Der Überstand wurde mit gleichem Volumen Isopropanol aufgefüllt, kräftiggeschüttelt und bei -20°C gefällt (mind. 1 Stunde, besser über Nacht). Nach demZentrifugieren (20 min, 10.000 g, 4°C) wurde der Überstand vorsichtigabgeschüttet und Restflüssigkeit aus dem Röhrchen ablaufen gelassen. DasPellet wurde erneut in Solution D (0,3 ml pro 1 ml Lysat) gelöst und in1,5 ml-Röhrchen (RNase-frei) überführt.Das gelöste RNA-Pellet wurde nochmal mit gleichem Volumen Isopropanolaufgefüllt, kräftig geschüttelt und bei -20°C gefällt (mind. 1 Stunde, besser überNacht). Nach dem Zentrifugieren (20 min, 10.000 g, 4°C) wurde der Überstandabgenommen und das Pellet zweimal mit eiskaltem Ethanol (80%) gewaschen.Die Lagerung erfolgte in Ethanol (100%) bei -80°C oder gelöst in H 2 O USB bei -20°C(Chomczynski, P. and Sacchi, N. 1987). Die RNA-Menge wurde mit demNanoDrop bestimmt (OD 260 von 1,0 entspricht ca. 40 µg/ml RNA und dasVerhältnis OD 260 :OD 280 war zwischen 1,8 und 2,0).Alternativ wurde RNA mit dem RNeasy Mini Kit (Qiagen) nach Anleitung desHerstellers präpariert.28