Spezies-spezifische und Zelltyp-spezifische Regulation von Toll-like ...

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5.6 Zusammenfassung der Regulationsmechanismen von TLR4 inMaus und Mensch ..................................................................................1205.7 Regulation des TLR5 Gens in Maus und Mensch................................1215.8 Regulation des TLR9 Gens in Maus und Mensch................................1226. Ausblick................................................................................. 1267. Zusammenfassung ............................................................... 1278. Literaturverzeichnis.............................................................. 1299. Abkürzungsverzeichnis........................................................... 139v
AbbildungsverzeichnisAbbildung 1-1. Urzeitliches Immunabwehrsystem bei Insekten und Wirbeltieren ............................. 2Abbildung 1-2. TLRs und ihre identifizierten Agonisten..................................................................... 3Abbildung 1-3. TLR Signalkaskade.................................................................................................... 5Abbildung 1-4. Regulation der T H -Zelldifferenzierung durch TLRs auf APCs.................................... 7Abbildung 1-5. Ets-Bindedomäne .................................................................................................... 11Abbildung 4-1. Analyse der mRNA des humanen bzw. murinen TLR4 ........................................... 51Abbildung 4-2. Interleukin 4-abhängige mRNA Expression von TLR2 und TLR4 ........................... 53Abbildung 4-3. Regulation der TLR4 mRNA nach Stimulation mit Zytokinen und LPS in IEC ........ 54Abbildung 4-4. Übersichtsdarstellung der TLR4 Promotoren in Mensch und Maus........................ 56Abbildung 4-5. TSS-Analyse des TLR4 Promotors bei Mensch und Maus ..................................... 57Abbildung 4-6. Alignment des TLR4 Promotors von Mensch, Schimpanse, Rind, Hund, Ratteund Maus ................................................................................................................. 59Abbildung 4-7. Reporteranalysen des murinen und humanen TLR4 Promotors in RAW264.7....... 61Abbildung 4-8. Reporteranalyse von chimären TLR4 Konstrukten in RAW264.7 Makrophagen .... 63Abbildung 4-9. Exogene TSS-Analysen der TLR4 Reporterkonstrukte mittels 5'-RACE-PCR ....... 65Abbildung 4-10. DMS In vivo Footprint des humanen TLR4 Promotors in Monozytenund Makrophagen .................................................................................................. 67Abbildung 4-11. DMS in vivo Footprint des TLR4 Promotors in der monozytären Zelllinie THP1 .. 68Abbildung 4-12. In vivo Footprint des murinen Tlr4 Promotors in BMM .......................................... 69Abbildung 4-13. DMS In vivo Footprint des Tlr4 Promotors in unterschiedlichen Zelltypen........... 70Abbildung 4-14. Bindung von PU.1 am Tlr4 Promotor..................................................................... 72Abbildung 4-15. Quantitative Real-time Tlr4 Expression in Icsbp K.o. Mäusen .............................. 73Abbildung 4-16. Real-time quantitative Tlr3 Expression in Icsbp K.o. Mäusen ............................... 74Abbildung 4-17. Luziferase-Aktivität des alternativen Tlr4 Promotors in RAW264.7 und NIH3T3 .. 76Abbildung 4-18. Luziferase-Assay des alternativen, distalen Promotors......................................... 76Abbildung 4-19. EMSA der AP1/E-Box (A/E) mit NIH3T3 Kernextrakt............................................ 78Abbildung 4-20. Supershift der AP1/E-Box (A/E) mit RAW264.7 Kernextrakt................................. 80Abbildung 4-21. Kotransfektions-Reporteranalysen in RAW264.7 und NIH3T3 Zellen................... 82Abbildung 4-22. ChIP Analyse des murinen Tlr4 Promotors ........................................................... 84Abbildung 4-23. ChIP-Analysen der Histonmodifikationen am Tlr4 Promotor................................. 86Abbildung 4-24. PUER Vektorkonstrukt........................................................................................... 88Abbildung 4-25. RT-Analyse der Tlr4 Expression in PUER Zellen .................................................. 88Abbildung 4-26. Kinetik der TSS des Tlr4 Promotors nach PU.1 Aktivierung in PUER Zellen........ 89Abbildung 4-27. ChIP-Kinetik der PUER Zellen nach OHT-Aktivierung .......................................... 91Abbildung 4-28. TSS-Analyse PU.1-regulierter Gene in PUER Zellen............................................ 92Abbildung 4-29. Luziferase-Assay zur Bestimmung der Translationseffizienz................................ 93Abbildung 4-30. Out-of-frame ATG-Mutationen im murinen Tlr4 Reporterkonstrukt ....................... 95Abbildung 4-31. Effekte der out-of-frame ATGs in Mensch und Maus ............................................ 96Abbildung 4-32. TLR4 Spleißvarianten in den TCR Mäusen im Vergleich zu Mensch und Maus... 97Abbildung 4-33. TLR4 TSS-Analysen der myeloischen und nicht-myeloischen Zellen derTCR-Mäuse............................................................................................................ 98Abbildung 4-34. Quantitativer Vergleich der TLR4 mRNA in myeloischen und nicht-myeloischenZellen...................................................................................................................... 99Abbildung 4-35. 5’-RACE-PCR mit erhöhter Zyklenzahl zum Nachweis von TLR4 ...................... 100Abbildung 4-36. TLR5 Promotor Alignment von Mensch und Maus.............................................. 101Abbildung 4-37. TLR5 mRNA Expression in Mensch und Maus ................................................... 102Abbildung 4-38. Sequenz-Alignment der TLR9 Promotoren von Mensch, Schimpanse, Hundund Maus ............................................................................................................. 103Abbildung 4-39. EMSA des kombinierten IRF/Ets-Motivs im murinen Tlr9 und Tlr4 Promotor ..... 104Abbildung 4-40. Tlr9 mRNA Expression in Wildtyp und Icsbp K.o. Mäusen.................................. 105Abbildung 5-1. Regulation des TLR4 in myeloischen und nicht-myeloischen Zellen von Mausund Mensch............................................................................................................ 121vi
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Material und MethodenElektrophorese
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Ergebnisse4. Ergebnisse4.1 Toll-lik
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ErgebnisseC57B/6, Balb/c und SvJ129
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Ergebnisseinduzierenden Molekülen
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ErgebnisseAbbildung 4-4. Übersicht
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Ergebnissesogenannte distale Promot
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Ergebnisse4.2.3 Identifizierung wic
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ErgebnisseTLR4 Transkription in bei
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ErgebnisseDie verschiedenen Konstru
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Ergebnissedie DNA-Bruchstücke mitt
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ErgebnisseAbbildung 4-11. DMS in vi
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ErgebnisseAbbildung 4-13. DMS In vi
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ErgebnisseAbbildung 4-14. Bindung v
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ErgebnisseBis auf einen leichten R
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ErgebnisseAbbildung 4-17. Luziferas
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ErgebnisseTabelle 4-1. Kompetitor-S
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ErgebnisseAbbildung 4-21. Kotransfe
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Ergebnisse4.4.3 Transkriptionsfakto
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Ergebnisse4.4.4 Abhängigkeit der T
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ErgebnisseDa die TLR4 5’-UTR+LUC
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Diskussionohne eine funktionelle An
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Ausblick6. AusblickDie Charakterisi
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Zusammenfassunghumanen Zellen beide
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LiteraturverzeichnisBoyd,K.E. and F
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LiteraturverzeichnisHornef,M.W., Fr
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LiteraturverzeichnisMullis,K., Falo
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LiteraturverzeichnisSchumann,R.R.,
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LiteraturverzeichnisZhang,D., Zhang
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AbkürzungsverzeichnisILInterleukin
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DanksagungDanksagungFür die Ermög
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