Klonierung und Charakterisierung von reifungsassoziierten ...

Klonierung und Charakterisierung
von reifungsassoziierten,
makrophagenspezifischen Proteinen
Dissertation zur Erlangung des
Doktorgrades der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.)
der Naturwissenschaftlichen Fakultät IV
- Chemie und Pharmazie -
der Universität Regensburg
vorgelegt von
Michael Rehli
aus Regensburg
1996

Promotionsgesuch wurde eingereicht am: 17. Mai 1996
Die Arbeit wurde angeleitet von Prof. Dr. Andreesen
Prüfungsausschuß:
Vorsitzender: Prof. Dr. Buschauer
1. Gutachter: Prof. Dr. Schönenberger
2. Gutachter: Prof. Dr. Reinhard Andreesen
3. Prüfer: Prof. Dr. Schneuwly
Tag der mündlichen Prüfung: 15. Juli 1996

Die vorliegende Arbeit entstand in der Zeit von Februar 1993 bis April 1996 in der
Abteilung für Hämatologie und Internistische Onkologie des Klinikums der Universität
Regensburg. Die Arbeit wurde im Rahmen eines Forschungsprojektes von der DFG
gefördert und war thematisch in das Graduiertenkolleg „Therapieforschung
Onkologie" eingebunden.
Teile dieser Arbeit wurden veröffentlicht bzw. sind zur Veröffentlichung eingereicht:
Rehli, M., Krause, S.W., Kreutz, M., Andreesen, R. (1995). Carboxypeptidase M is
identical to MAX.1 antigen and its expression is associated with monocyte to
macrophage differentiation. J. Biol. Chem. 270, 15644-15649.
Rehli, M., Krause, S.W., Schwarzfischer, L., Kreutz, M., Andreesen, R. (1995).
Molecular cloning of a novel macrophage maturation associated transcript encoding
a protein with several potential transmembrane domains. Biochem. Biophys. Res
Com. 217, 661-667.
Krause, S.W., Rehli, M., Paulauskis, J., Schwarzfischer, L., Kreutz, M., Andreesen,
R., (1996). Cloning of maturation-associated cDNAs of in vitro differentiated
macrophages by differential-screening. J. Leuk. Biol. (angenommen).

Prof. Dr. Reinhard Andreesen danke ich für seine Unterstützung, für die Möglichkeit eigene
Ideen zu verwirklichen und für den Freiraum zur Entfaltung meiner Persönlichkeit.
Bei Prof. Dr. Schönenberger möchte ich mich für die Betreuung und Begutachtung der Arbeit
bedanken.
Mein Dank gilt ebenfalls Herrn Prof. Dr. Hofstädter für sein Engagement als Sprecher des
Graduiertenkollegs. Seine großzügige Unterstützung ermöglichte den Gedankenaustausch
mit anderen Wissenschaftlern auf Kongressen oder bei Laborbesuchen.
Mein besonderer Dank gehört Dr. Stefan Krause, der mich mit viel Interesse und guten
Ratschlägen und Anregungen bei dieser Arbeit begleitet hat.
Dr. Marina Kreutz danke ich für ihre Anteilnahme am Verlauf meiner Arbeit, für ihr offenes
Ohr und ihren engagierten Einsatz für alle Mitarbeiter des Labors.
PD Dr. Werner Falk danke ich besonders für die vielen praktischen Tips und seine stetige
Bereitschaft, mit mir über fachlichen Probleme zu diskutieren. Außerdem danke ich ihm und
Prof. Dr. Daniela Männel für die Durchführung des Journal Clubs. Ich habe viel dabei gelernt.
Allen Mitarbeitern der Arbeitsgruppe möchte ich für die Hilfe bei Problemen, die
Diskussionsbereitschaft und das außerordentlich gute Arbeitsklima danken. Mein Dank also
an Ute Ackermann, Christoph Ammon, Jana Fritsche, Abdo Konur, Guido Meierhoff, Alice
Peuker, Annegret Rehm, Heike Schindler und Harald Wagner. Ganz besonders möchte ich
mich an dieser Stelle bei Lucia Schwarzfischer-Pfeilschifter für ihre sorgfältige und
selbstständige Mitarbeit, ihr Interesse und ihre Geduld bedanken. Auch Sven Heinz gilt mein
besonderer Dank für sein Interesse und seinen Einsatz bei der Aufreinigung von Proteinen.
Bei Herrn Prof. Dr. Erdös und Prof. Dr. Randal Skidgel bedanke ich mich für die freundliche
Aufnahme während meines Laborbesuchs in Chicago im März 1995, für ihre
Kooperationsbereitschaft und ihr Vertrauen.
Ferner gilt mein Dank vielen Kolleginnen und Kollegen aus anderen Arbeitsgruppen, die mir
mit guten Ratschlägen weiterhalfen oder sich auch einfach mal für einen Kaffee oder einen
netten Plausch Zeit nahmen: Anja Bosserhoff und Karin Jakob aus der Dermatologie, Günter
Bruckschlegel und Thorsten Cornelius aus der Inneren Medizin II, Robert Hofmeister und Dr.
Gerhard Rogler aus der Gastroenterologie, Dr. Thomas Dobner und Stefan Gabler aus der
Mikrobiologie, PD Dr. Cara Aslanidis und Udo Schlosser aus der Klinischen Chemie, und PD
Dr. Reinhard Büttner aus der Pathologie.
Schließlich danke ich meinen Eltern, ohne deren Unterstützung weder Studium noch
Dissertation möglich gewesen wären.
Regensburg, im April 1996 Michael Rehli

für Martina

INHALTSVERZEICHNIS
Inhaltsverzeichnis
1 EINLEITUNG.........................................................................................................................................1
1.1 MAKROPHAGEN IM SYSTEM DER MONONUKLEÄREN PHAGOZYTEN...........................................................1
1.1.1 Ontogenese - Von der myeloischen Stammzelle zum reifen Makrophagen ..............................1
1.1.2 Biologische Funktionen...............................................................................................................3
1.1.2.1 Phagozytose und Zytotoxizität ............................................................................................................4
1.1.2.2 Antigenpräsentation ............................................................................................................................4
1.1.2.3 Sekretion löslicher Faktoren................................................................................................................5
1.1.3 Charakterisierung von Zellen des mononukleären Phagozytensystems....................................5
1.1.3.1 Morphologie ........................................................................................................................................6
1.1.3.2 Transkriptionelle Veränderungen während der Differenzierung ..........................................................6
1.1.3.3 Funktionalität und Differenzierungsgrad..............................................................................................8
1.1.3.4 Expression von Oberflächenantigenen................................................................................................9
1.1.3.5 Die monoklonalen Antikörper MAX.1, 3 und 11 als phänotypische Marker für reife Makrophagen .....9
1.1.4 Modellsysteme für die Makrophagendifferenzierung............................................................... 11
1.1.4.1 In-vitro-Differenzierung von humanen Blutmonozyten.......................................................................11
1.1.4.2 Differenzierung von myeloiden Leukämiezellinien.............................................................................12
2 ZIELSETZUNG................................................................................................................................... 14
3 MATERIAL UND METHODEN .......................................................................................................... 15
3.1 MATERIALIEN UND GERÄTE ................................................................................................................ 15
3.1.1 Geräte ...................................................................................................................................... 15
3.1.2 Verbrauchsmaterialien und Plastikartikel................................................................................. 15
3.1.3 Chemikalien ............................................................................................................................. 16
3.1.4 Antikörper und Kopplungsreagenzien...................................................................................... 16
3.1.5 Enzyme, Inhibitoren und molekularbiologische Kits ................................................................ 16
3.1.6 Molekulargewichtsstandards.................................................................................................... 17
3.1.7 Vektoren................................................................................................................................... 17
3.1.8 Primersequenzen..................................................................................................................... 17
3.1.9 Bakterien und Zellinien ............................................................................................................ 18
3.2 ZELLBIOLOGISCHE METHODEN........................................................................................................... 18
3.2.1 Kultur der Zellinien ................................................................................................................... 18
3.2.1.1 Kulturbedingungen und Passagierung ..............................................................................................18
3.2.1.2 Zellzahl- und Vitalitätsbestimmung....................................................................................................19
3.2.1.3 Einfrieren und Auftauen von Zellen ...................................................................................................19
3.2.1.4 Nachweis von Mykoplasmen.............................................................................................................19
3.2.2 Monozytenisolierung durch Gegenstromelutriation ................................................................. 20
3.2.3 Kultivierung von Monozyten..................................................................................................... 21
3.2.4 Gewinnung von humanen Thrombozyten................................................................................ 21
3.3 IMMUNOLOGISCHE METHODEN............................................................................................................ 22
3.3.1 Reinigung von Antikörpern aus Hybridomüberständen ........................................................... 22
3.3.1.1 Reinigung von Antikörpern über thiophile Agarose ...........................................................................22
3.3.1.2 Reinigung von Antikörpern über Protein G Sepharose......................................................................23

Inhaltsverzeichnis
3.3.2 Phänotypische Charakterisierung von Zellen .......................................................................... 23
3.3.2.1 Zell-ELISA.........................................................................................................................................24
3.3.2.2 Durchflußzytometrie - Färbung für Oberflächenantigene ..................................................................25
3.4 PROTEINCHEMISCHE METHODEN ........................................................................................................ 26
3.4.1 Solubilisierung von zellulären Proteinen.................................................................................. 26
3.4.1.1 Präparation von Zellmembranen zur Messung membrangebundener Enzymaktivität.......................26
3.4.1.2 Präparation von Zelloberflächenproteine durch Nonidet P-40 Lyse ..................................................26
3.4.2 Bestimmung der Proteinkonzentration mit BCA ...................................................................... 27
3.4.3 Präparative Methoden zur Proteinfällung ................................................................................ 28
3.4.3.1 Chloroformextraktion von Proteinen..................................................................................................28
3.4.3.2 Ammoniumsulfat-Fällung (für Hybridomüberstände) .........................................................................28
3.4.4 Isolierung von Proteinen über Antikörperbindung ................................................................... 29
3.4.4.1 Immunaffinitätschromatographie .......................................................................................................29
3.4.4.2 Immunpräzipitation von Oberflächenantigenen .................................................................................30
3.4.5 Chemische oder enzymatische Veränderungen an Proteinen ................................................ 30
3.4.5.1 Biotinylierung von Oberflächenproteinen...........................................................................................30
3.4.5.2 Abspaltung von Proteinen über Phosphoinosit-spezifische Phospholipase C ...................................31
3.4.5.3 Enzymatische Deglykosylierungen....................................................................................................31
3.4.5.3.1 Neuraminidase- und β-Galactosidase-Verdau...........................................................................31
3.4.5.3.2 Freisetzung von N-Glykanen durch N-Glykosidase F................................................................31
3.4.6 Elektrophoretische Auftrennung von Proteinen durch SDS-PAGE ......................................... 32
3.4.7 Western-Blotting (Semi-dry-Technik)....................................................................................... 33
3.4.8 Nachweis und Charakterisierung von Proteinen ..................................................................... 34
3.4.8.1 Färbung von Proteinen in Gelen .......................................................................................................34
3.4.8.1.1 Coomassiefärbung ....................................................................................................................34
3.4.8.1.2 Silberfärbung .............................................................................................................................35
3.4.8.2 Immunofärbung von Proteinblots ......................................................................................................36
3.4.8.3 ECL-Färbung von biotinylierten Proteinen.........................................................................................36
3.4.8.4 Mikrosequenzanalyse........................................................................................................................37
3.4.9 Enzymassay für Carboxypeptidase M ..................................................................................... 37
3.5 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN................................................................................................ 38
3.5.1 Kultivierung von Bakterien ....................................................................................................... 39
3.5.2 Plasmidvektoren....................................................................................................................... 39
3.5.2.1 Plasmid MiniPrep (alkalische Lyse)...................................................................................................39
3.5.2.2 Präparation von kompetenten E.Coli.................................................................................................40
3.5.2.3 Transformation von E.Coli.................................................................................................................41
3.5.3 Präparation, Enzymatische Manipulationen, Analyse und Sequenzierung von DNA ............. 41
3.5.3.1 Gelelektrophoresen...........................................................................................................................41
3.5.3.1.1 Agarose-Gel für DNA.................................................................................................................41
3.5.3.1.2 alkalisches Agarosegel für einzelsträngige DNA .......................................................................42
3.5.3.2 Präparation von DNA Fragmenten ....................................................................................................42
3.5.3.3 Klonierung von DNA-Fragmenten .....................................................................................................43
3.5.3.4 Kontrollierte, stufenweise Verkürzung von Plasmidkonstrukten ("Nested Deletion").........................43
3.5.3.5 Sequenzierung von Plasmid DNA und computergestützte Sequenzanalysen...................................44
3.5.3.6 Markierung von cDNA-Fragmenten und Oligonukleotiden ................................................................44
3.5.4 Präparation und Analyse von RNA .......................................................................................... 44
3.5.4.1 RNA Extraktion mit Guanidin-Phenol-Chloroform .............................................................................44
3.5.4.2 DNA-Verdau in RNA-Präperationen..................................................................................................46
3.5.4.3 Isolation vom poly(A)-RNA................................................................................................................46
3.5.4.4 1% Agarose-Gel für RNA ..................................................................................................................47
3.5.4.5 Northern-Blotting - RNA-Transfer......................................................................................................48
3.5.4.6 Hybridisierung von Northern Blots.....................................................................................................48

Inhaltsverzeichnis
3.5.4.7 Primer Extension...............................................................................................................................49
3.5.5 Phagenscreening zur Klonierung von cDNA Sequenzen........................................................ 50
3.5.5.1 Infektion mit Lambda ZAP II und Plattieren der Bakterien.................................................................50
3.5.5.2 Präparation der Filterabdrücke..........................................................................................................51
3.5.5.3 Hybridisierung mit radioaktiv markierten Sonden ..............................................................................51
3.5.6 Polymerase Ketten Reaktion (PCR) ........................................................................................ 52
3.5.6.1 Differential Display ............................................................................................................................53
3.5.6.2 RACE ("rapid amplification of cDNA ends") - PCR............................................................................53
3.5.6.3 Bedingungen für weitere verwendete PCR-Amplifikationen ..............................................................53
4 ERGEBNISSE .................................................................................................................................... 55
4.1 CHARAKTERISIERUNG UND IDENTIFIZIERUNG VON CARBOXYPEPTIDASE M AUF MAKROPHAGEN............. 55
4.1.1 Biotinylierung als Alternative zur radioaktiven Markierung ...................................................... 55
4.1.2 Biochemische Charakterisierung der von den Antikörpern MAX.1 und MAX.11 erkannten
Antigene ................................................................................................................................... 56
4.1.3 Reinigung und Identifizierung des MAX.1/11-Antigens ........................................................... 59
4.1.4 Expression und enzymatische Aktivität der Carboxypeptidase M während der
Makrophagenreifung ................................................................................................................ 60
4.1.5 7A2-Antigen ............................................................................................................................. 62
4.1.6 Molekularbiologische Vorarbeiten zur Klonierung des humanen CPM-Gens ......................... 63
4.1.6.1 Charakterisierung des 5´-Endes der CPM-mRNA.............................................................................63
4.1.6.2 Charakterisierung und Klonierung des 3´-Endes der CPM-mRNA ....................................................64
4.2 CHARAKTERISIERUNG VON WEITEREN OBERFLÄCHENANTIGENEN......................................................... 65
4.2.1 MAX.3-Antigen ......................................................................................................................... 65
4.2.1.1 Biochemische Charakterisierung des vom Antikörper MAX.3 erkannten Antigens............................65
4.2.1.2 Affinitätschromatographische Aufreinigung .......................................................................................66
4.2.2 8H8-Antigen - Identität mit Komplementrezeptor CR4 ............................................................ 68
4.3 KLONIERUNG VON REIFUNGSASSOZIIERT EXPRIMIERTEN GENEN ÜBER DIFFERENTIELLES SCREENING ... 70
4.3.1 Differenzielles Screening - Monozyten versus Makrophagen ................................................. 70
4.3.2 Sequenzanalysen und Northern Blot Analysen ....................................................................... 70
4.3.3 Charakterisierung der reifungsabhängigen Expression von HC-gp39 .................................... 74
4.3.3.1 Expression von HC-gp39 bei Kurzzeitstimulationen..........................................................................75
4.3.3.2 Expression von HC-gp39 in dendritenähnlichen Zellen.....................................................................75
4.3.4 Molekularbiologische Charakterisierung des humanen HC-gp39 -Gens - Bestimmung der
HC-gp39 mRNA Initiationsstelle .............................................................................................. 76
4.4 KLONIERUNG UND CHARAKTERISIERUNG EINES REIFUNGSASSOZIIERT EXPRIMIERTEN GENS ÜBER
DIFFERENTIELLES DISPLAY ............................................................................................................... 79
4.4.1 Klonierung und Sequenzierung eines reifungsassoziierten Transkripts ................................. 79
4.4.2 Charakterisierung des reifungsassoziierten Transkripts dd3f ................................................. 81
5 DISKUSSION ..................................................................................................................................... 86
5.1 CHARAKTERISIERUNG VON REIFUNGSASSOZIIERTEN OBERFLÄCHENANTIGENEN AUF MAKROPHAGEN .... 86
5.1.1 Identifizierung von Carboxypeptidase M auf Makrophagen .................................................... 86
5.1.1.1 Carboxypeptidase M (und D) auf Makrophagen - Mögliche Funktionen und Substrate....................91
5.1.1.2 Biologisch aktive Peptide - Regulationsmechanismen und die Rolle der basischen
Carboxypeptidasen ...........................................................................................................................93

Inhaltsverzeichnis
5.1.1.2.1 Makrophagen und der Metabolismus von neuroendokrinen Peptidhormonen und
Neurotransmittern......................................................................................................................94
5.1.1.2.2 Makrophagen und der Metabolismus von Kininen.....................................................................95
5.1.1.2.3 Makrophagen und der Metabolismus von Anaphylatoxinen ......................................................98
5.1.1.2.4 Makrophagen und der Metabolismus von L-Arginin ..................................................................98
5.1.2 Molekularbiologische Charakterisierung von Carboxypeptidase M auf Makrophagen ......... 100
5.1.3 Charakterisierung weiterer reifungsassoziierter Oberflächenantigene ................................. 101
5.1.3.1 Identifizierung eines weiteren Antikörpers gegen Carboxypeptidase M und eines Antikörpers
gegen den Komplementrezeptor CR4..............................................................................................101
5.1.3.2 Charakterisierung des vom Antikörper MAX.3 detektierten Antigens ..............................................102
5.2 MOLEKULARBIOLOGISCHE IDENTIFIZIERUNG VON REIFUNGSASSOZIIERT EXPRIMIERTEN GENEN ........... 104
5.2.1 Identifizierung von genetischen Markern der Makrophagenreifung durch Differentielles
Screening ............................................................................................................................... 104
5.2.2 Klonierung eines reifungsassoziiert exprimierten Gens über Differentielles Display ............ 107
6 ZUSAMMENFASSUNG ................................................................................................................... 109
7 LITERATUR ..................................................................................................................................... 111
8 ANHANG.......................................................................................................................................... 121
LEBENSLAUF................................................................................................................................. 121

ABKÜRZUNGEN
AA Acrylamid
ACE „angiotensin converting enzyme“
ADP Adenosindiphosphat
AEI Antigen Expressionsindex
AMP Ampizillin
AP Ammoniumpersulfat
APN Aminopeptidase N
ATP Adenosintriphosphat
BCA Bicinchoninsäure
BCIP 5-Brom-4-chlorindolylphosphat p-
Toluidinsalz
BIS N, N´-Methylenbisacrylamid
bp Basenpaare
BSA Rinderserumalbumin
CD „cluster of differentiation“
cDNA „copy DNA“
CFU-GM „Colony forming Unit Granulocyte-
Macrophage“
CFU-Mix „Colony forming Unit Mix“
ConA Concalvalin A
CPB Carboxypeptidase B
CPD Carboxypeptidase D
CPE Carboxypeptidase E
CPH Carboxypeptidase H
CPM Carboxypeptidase M
DAB Diaminobenzidintetrahydrochlorid
Dansyl 5-Dimethylaminonaphtalin-1sulphonyl-Rest
DAPI 4´,6-Diamidin-2-phenylindoldihydrochlorid
DEAE Diaminoacetyl
DEPC Diethylpyrocarbonat
DMSO Dimethylsulfoxid
DNA Desoxyribonukeinsäure
dNTP Desoxynukleotid Triphosphat
DPPIV Dipeptidyl Peptidase
DTT Dithiotreitol
ECL „enhanced chemiluminescence“
EDTA Ethylendiamintetraacetat
EGF „epidermal growth factor“
ELISA „enzyme linked immunosorbent
assay“
EtBr Ethidiumbromid
FACS „fluorescence-activated cell sorting“
FCS Fötales Kälberserum
FITC Fluoreszeinisothiozyanat
GAR Ziege-anti-Kaninchen (anti-Serum)
GM-CSF Granulozyten/Makrophagen
Kolonie-stimulierender Faktor
gp Glykoprotein
HANKS „Balanced Salt Solution“ (nach
Hank)
HC-gp39 „human cartilage glycoprotein“
Hepes N-2-Hydroxyethylpiperazin-Nethansulfonsäure
Abkürzungen
HNET Hochsalz NET-Puffer
HRP Meerrettichperoxidase
IFN Interferon
Ig Immunglobulin
IL Interleukin
kDa Kilodalton
LBP LPS bindendes Protein
LPS Lipopolysaccharid
M-CSF Makrophagen Koloniestimulierender
Faktor
MAK Makrophagen
MB Monoblast
MCF „mean channel fluorescence“
MEM „Modified Eagle’s Medium“
(Zellkulturmedium)
MHC Haupthistokompatibilitätskomplex
MNC mononukleäre Zellen
MO Monozyten
MOPS 3-(N-Morpholino)propansulphonsäure
mRNA „messenger RNA“
MSA mittlere spezifische Aktivität
MW Molekulargewicht
NAG Natrium-Albumin-Gelatine Puffer
NEP Neutrale Endopeptidase
NET Natriumchlorid-EDTA-Tris-Puffer
NGF N-Glykosidase F
NHSS-Biotin D-Biotinoyl-ε-aminocapronsäure-
N-hydroxysulfosuccinimidester
Natriumsalz
NKH Natrium-Kalium-Hepes Puffer
NP-40 Nonidet P40
OD optische Dichte
OPD Ortho-Phenyldiamindihydrochlorid
PAGE Polyacrylamidgelelektrophorese
PaP Peroxidase-anti-Peroxidase
PBS Phosphat gepufferte
Kochsalzlösung
PCR Polymerase Kettenreaktion
PDA Piperazindiacrylamid
PDGF „platelet derived growth factor“
PEG Polyethylenglykol
pfu „plaque forming unit“
PI-PLC Phosphoinosit-spezifische
Phospholipase C
PM Promonozyt
PMA Phorbolmyristylacetat
PMSF Phenylmethylsulfonsäure
PP Probenpuffer
PVDF Polyvinyldifluorid
RACE „rapid amplification of cDNA ends"
RAM Kaninchen-anti-Maus (anti-Serum)
RPMI Roswell Park Memorial Institut
(RPMI 1640: Zellkulturmedium)
rRNA ribosomale RNA

RT Raumtemperatur
RT-PCR Reverse Transkriptase PCR
SAR Schwein-anti-Kaninchen (anti-
Serum)
SDS Natriumdodecylsulfat
SEC size exclusion chromatography
(Größenausschlußchromatographie)
TAE Tris-Essigsäurepuffer
Taq Thermophilus aquaticus (DNA-
Polymerase
TBS Tris gepufferte Kochsalzlösung
Abkürzungen
TEMED N,N,N’,N’-Tetramethylethylendiamin
TGF „transforming growth factor“
TNF-α Tumor Nekrose Faktor-alpha
TP Tripuffer
Tris Tris(hydroxymethyl)-Aminoethan
tRNA „transfer RNA“
TSS Tris/Kochsalz-Lösung
Upm Umdrehungen pro Minute
WGL Weizenkeim Agglutinin
Xaa Aminosäure (nicht bestimmt)

1 EINLEITUNG
Einleitung
1.1 Makrophagen im System der mononukleären Phagozyten
Makrophagen stellen (zusammen mit ihren Vorläufern) entwicklungsgeschichtlich das
älteste körpereigene Abwehrsystem dar und sind über den gesamten Körper verteilt.
Ernst Haeckel beschrieb bereits 1868 diese großen mononukleären phagozytischen
Zellen und Elie Metchnikoff gab ihnen im Jahre 1880 ihren Namen (Karnovsky,
1981). Metchnikoff spekulierte schon damals, daß Makrophagen eine große Rolle bei
der Immunabwehr spielen müßten.
Zusammen mit Endothelzellen, Fibroblasten, Granulozyten und Retikulumzellen
wurden sie 1924 von Aschoff in das Retikuloendotheliale System (RES) eingeordnet
(Aschoff, 1924). Das RES enthielt allerdings Zellen, die nicht der Makrophagenlinie
zugeordnet werden konnten. Aufgrund des gemeinsamen Ursprungs der
unterschiedlichen Makrophagentypen und ihrem ähnlichen funktionellen Repertoire
wurde der Begriff RES 1969 durch „mononukleäres Phagozytensystem" ersetzt.
Dieses System umfasst Makrophagen, Monozyten und ihre Vorläuferzellen (van
Furth et al., 1972).
1.1.1 Ontogenese - Von der myeloischen Stammzelle zum reifen
Makrophagen
Die Zellen des mononuklären Phagozytensystems leiten sich, wie alle Blutzellen, von
pluripotenten Stammzellen ab. Aus diesen Stammzellen entwickeln sich im
Knochenmark myeloische Vorläuferzellen bis hin zu Monozyten.
Die erste bekannte Differenzierungsstufe der myeloischen Linie ist eine mit
Granulozyten, Megakaryozyten und Erythrozyten gemeinsamen Stammzelle (CFU-
Mix). Aus ihr entsteht eine Vorläuferzelle, die noch die Fähigkeit besitzt, in
Granulozyten zu differenzieren (CFU-GM). Aus dieser Stammzelle geht der
Monoblast hervor, eine weitere Vorläuferzelle mit hoher Selbsterneuerungskapazität.
Diese ersten Abschnitte der Differenzierung werden wahrscheinlich hauptsächlich
durch die Kolonie-stimulierende Faktoren (CSF) Interleukin-3 (IL-3), Granulozyten-
Makrophagen CSF (GM-CSF) und Makrophagen CSF (M-CSF) reguliert (Metcalf,
1991). IL-6 scheint die Differenzierung von Stammzellen in Richtung Granulozyten-
1

myeloische
Stammzelle
(CFU-Mix)
Monoblast
Promonozyt
Knochenmark peripheres
Blut
CFU-GM
Monozyt
Gewebe
Einleitung
Makropagen Linie zu unterstützen (Jansen et al., 1992), auch Tumor Nekrose Faktor
α scheint auf einer späteren Stufe die Entwicklung von mononukleären Phagozyten
zu fördern (Horiguchi et al., 1989; Srivastava et al., 1991; Witsell und Schook, 1992).
Aus Monoblasten entwickeln sich, über eine weitere Zwischenstufe, dem sog.
Promonozyten, die Monozyten, die das Knochenmark verlassen und in den
Blutkreislauf eindringen. Im Menschen zirkulieren sie dort mit einer Halbwertszeit von
ca. 3 Tagen (Abbildung 1-1).
Auf noch unbekannte Signale hin adhärieren die Monozyten auf dem Endothel der
Blutgefäße und wandern in die verschiedenen Gewebe und Körperhöhlen aus. Dort
entwickeln sich die verschiedenen Makrophagentypen (Abbildung 1-1, Tabelle 1-1)
mit ihrem unterschiedlichen Funktionsspektrum (Dougherty et al., 1985; Gordon et al,
1992; Rutherford et al 1993).
Makrophage
Abbildung 1-1 Verschiedenen Entwicklungsstufen der myeloiden Linie.
Vereinfachende schematische Darstellung der für die Myelopoese
wichtigen Differenzierungsorte und die dort anzutreffenden Zelltypen
der myeloiden Linie.
Welche Faktoren letztendlich für die Vielfalt an Makrophagentypen im Körper
verantwortlich sind, ist nicht geklärt.
Verschiedene Monozytensubpopulationen sind z.B. anhand ihrer Größe, ihres
Phänotyps und ihrer Zytokinsekretion unterschieden worden. Solche
Subpopulationen könnten eine Voraussetzung für die Heterogenität innerhalb der
Makrophagen sein (Arenson et al., 1980; Zembala et al., 1984; Passlick et al., 1989).
2

Gewebe Makrophagentyp
Einleitung
Ebenso wahrscheinlich ist der Einfluß vom Mikromilieu der einzelnen Gewebe und
von gewebespezifischen Faktoren (Rutherford et al. 1993).
Im Verlaufe krankhafter Vorgänge im Körper kann sich ein verändertes Mikromilieu
entwickeln, oder es können Faktoren freigesetzt werden, die zur Entstehung von
speziellen pathophysiologischen Differenzierungsformen führen. Beispiele hierfür
sind z.B. die Schaumzellen in arteriosklerotischen Plaques (Ross, 1993) oder Tumorassoziierte
Makrophagen (Mantovani et al., 1992), denen jeweils auch eine
besondere Bedeutung in der Progression des jeweiligen Krankheitsbildes zukommen
kann.
Gastrointestinaltrakt Mukosamakrophagen
Knochen Osteoklasten
Leber Kupffersche Sternzellen
Körperhöhlen Exudatmakrophagen (Pleura-, Peritonealmakrophagen)
Bindegewebe Histiozyten
Synovia Typ A Zellen
Gehirn Mikroglia Zellen
Lunge Alveolarmakrophagen
Knochenmark Knochenmarksmakrophagen
Plazenta Hofbauer Zellen
Tumorgewebe Tumor-assoziierte Makrophagen
Entzündliches Gewebe Reaktive Makrophagen
Granulom Mehrkernige Makrophagen
Tabelle 1-1 Verschiedene Gewebe und ihre Makrophagentypen
1.1.2 Biologische Funktionen
Makrophagen, wie auch ihre Vorläufer die Blutmonozyten, sind sowohl an der
spezifischen, als auch an der unspezifischen Immunantwort beteiligt. Zu ihrem
Funktionsspektrum gehören Phagozytose, Mikrobizidie, Antigenpräsentation, die
Sekretion biologisch aktiver Moleküle und Zytotoxizität gegenüber entarteten Zellen.
Daneben spielen sie bei der Wundheilung und Gewebeerneuerung eine wichtige
Rolle (van Furth, 1982; Rappolee et al., 1988).
3

1.1.2.1 Phagozytose und Zytotoxizität
Einleitung
Eine Kernfunktion bei der unspezifischen Immunantwort ist die Phagozytose, die
Aufnahme und intrazelluläre Zerstörung von Krankheitserregern und alternden
Zellen. Körperfremdes und verändertes körpereigenes Material werden
„unspezifisch" gebunden, eingeschlossen, als Phagosom internalisiert und nach
Verschmelzung des Phagosoms mit einem Lysosom durch darin enthaltene
hydrolytische Enzyme verdaut. Unterstützend für die Bindung und Internalisierung
wirkt die Maskierung des Materials durch sog. Opsonine (Immunglobuline,
Komplementfaktor C3b), die wiederum von entsprechenden Rezeptoren auf der
Makrophagenoberfläche erkannt werden (Johnston and Zucker-Franklin, 1988).
Virusinfizierte Zellen, Tumorzellen oder Parasiten, die sich aufgrund ihrer Größe nicht
phagozytieren lassen, werden extrazellulär abgetötet. Diese Zytotoxizität kann
entweder antikörperabhängig oder ohne Beteiligung von Antikörpern ablaufen, wobei
die im zweiten Fall erkannten Strukturen noch nicht bekannt sind (Fanger et al.,
1989; Andreesen et al. 1983a). Die Bindung von Makrophagen an eine Zielzelle
bewirkt die Freisetzung von zytolytischen Faktoren, Enzymen und
Sauerstoffradikalen, was schließlich zu einer Lyse der Zielzelle führt (Bonta and Ben-
Efraim, 1993).
1.1.2.2 Antigenpräsentation
Die Phagozytose spielt außerdem eine wichtige Rolle bei der Induktion einer
spezifischen Immunantwort. Das aufgenommene und in kleine Fragmente zerlegte
Material wird zusammen mit Klasse II Molekülen des Haupthistokompatibilitätskomplexes
(MHC) auf der Zelloberfläche präsentiert. Durch Erkennung und Bindung
des T-Zell-Rezeptors von T-Zellen an den MHC-Antigen-Komplex werden
T-Zellsubpopulationen aktiviert und die spezifische Immunantwort initialisiert. Die
akzessorische Funktion der Monozyten und Makrophagen wird unterstützt durch die
Sekretion von Zytokinen wie z.B. IL-1 und IL-6 (Auger und Ross, 1992).
4

1.1.2.3 Sekretion löslicher Faktoren
Einleitung
Makrophagen gehören zu den sekretorisch aktivsten Zellen des menschlichen
Körpers. Sie sind sowohl im ruhenden als auch im aktivierten Zustand in der Lage,
eine Fülle von unterschiedlichsten, zum Teil antagonistisch wirkenden Substanzen zu
sezernieren und können damit in alle Stadien der Entzündung eingreifen. Neben
Zytokinen (IL-1α/β, IL-6, Tumor-Nekrose-Faktor-α (TNF-α), "transforming growth
factor"-β (TGF-β), Interferon-α (IFN-α), "platelet derived growth factor" (PDGF), GM-
CSF, M-CSF, Granulozyten-CSF (G-CSF)) können Makrophagen Enzyme (z.B.
Elastase, Kollagenase, Arginase), Enzyminhibitoren (z.B. α1-Antitrypsin, α2-
Makroglobulin), extrazelluläre Matrixproteine (z.B. Fibronektin, Osteopontin),
Arachidonsäure-Metabolite (z.B. Prostaglandine, Leukotriene), Komplementfaktoren,
reaktive Sauerstoffverbindungen (Superoxid, H2O2) und eine Reihe anderer
Substanzen freisetzen (Nathan, 1987).
1.1.3 Charakterisierung von Zellen des mononukleären
Phagozytensystems
Die Untersuchung des Reifungsprozesses in normalen und pathophysiologischen
Situationen erfordert eine genaue Charakterisierung der Zellen des mononukleären
Phagozytensystems. Man weiß inzwischen, daß Blutmonozyten und
Gewebemakrophagen sich in ihrem Funktionsspektrum unterscheiden. Auch treten
im Laufe der Reifung deutliche morphologische und phänotypische Veränderungen
auf.
Grundlage für die meisten differenzierungsabhängigen Veränderungen sind
Vorgänge, die sich auf der Ebene der Transkription abspielen. Ausgelöst durch einen
Differenzierungsstimulus wird die Expression von bestimmten Genen reguliert, was
dann normalerweise auch in einer veränderten Expression der Genprodukte (z.B.
eines Enzyms, Zytokins, Rezeptors,...) resultiert. Diese Prozesse führen dann zu
Veränderungen der Zellmorphologie, des Phänotyps, des funktionellen Spektrums
und der metabolischen Aktivität der Zelle.
5

1.1.3.1 Morphologie
Einleitung
Während der Reifung vom Monozyten zum Makrophagen wächst die Zelle auf ein bis
zu zehnfaches der ursprünglichen Größe an und das Kern/Zytoplasma-Verhältnis
nimmt ab (s. Abbildung 1-2). Außerdem bilden Makrophagen im Gegensatz zu
Monozyten typische Ausläufer (Pseudopodien), die zur Fortbewegung und zur
Phagozytose genützt werden (Lohmann-Matthes, 1981).
B
Abbildung 1-2 Morphologie frisch isolierter Monozyten (A) und in vitro differenzierter
Makrophagen (B) im Vergleich. A. Dargestellt sind frisch isolierte
mononukleäre Zellen. Die Monozyten (weißer Pfeil) sind durch den
typisch hufeisenförmigen Kern von den Lymphozyten (schwarzer
Pfeil) unterscheidbar. B. In vitro differenzierte Makrophagen mit
deutlich vergrößertem Zytoplasma. Die Makrophagen wurden für 7
Tage unter Zusatz von Humanserum kultiviert. (Die Zellen wurden mit
May-Grünwald/Giemsa gefärbt, Vergrößerung 1:600.) (Aus
Andreesen et al., 1983a).
1.1.3.2 Transkriptionelle Veränderungen während der
Differenzierung
Die Entwicklung der molekularbiologischen Arbeitstechniken der letzten zwei
Jahrzehnte machte es möglich, die Differenzierungsprozesse auch auf der Ebene der
mRNA-Expression zu untersuchen und die an der Transkriptionsregulation beteiligten
Transkriptionsfaktoren zu studieren.
A
6

Einleitung
Die Differenzierung von hämatopoetischen Stammzellen zu reifen Makrophagen
wurde in dieser Hinsicht vor allem an verschiedenen myeloiden Leukämiezellinien
untersucht, die frühe Vorläuferstadien der myeloiden Linie repräsentieren. Anhand
dieser Differenzierungsmodelle konnten einige Transkriptionsfaktoren charakterisiert
werden, die im Differenzierungsprozess der mononukleären Phagozyten eine Rolle
spielen. Vorläuferzellen, die prinzipiell noch in Granulozyten oder Monozyten
ausreifen könnten, werden durch den Transkriptionsfaktor Egr-1 an der
Differenzierung in Granulozyten gehindert (Nguyen et al., 1993; Krishnaraju et al,
1995). Auch der Transkriptionsfaktor PU.1, der lediglich von B-Zellen und Zellen der
mononukleären Phagozytenlinie exprimiert wird, scheint auf dieser Entwicklungsstufe
von Bedeutung zu sein. PU.1 reguliert z.B. die Expression des Rezeptors für M-CSF
(CSF-1) (Klemsz et al., 1993; Ross et al, 1994; Zhang et al, 1994). Zusätzlich wurde
auch eine Rolle der beiden Transkriptionsfaktoren NF-IL6 und AP-1 diskutiert. NF-IL6
wird bei der Differenzierung in Richtung monozytärer Linie verstärkt exprimiert, bei
der Granulopoese jedoch nicht induziert (Natsuka et al., 1992). Ein ähnliches
Verhalten wurde für die Expression von c-fos und jun B beschrieben, auch die
Bindungsaktivität des aus diesen beiden Untereinheiten zusammengesetzten
Transkriptionsfaktors AP-1 scheint bei der Differenzierung in Richtung monozytärer
Linie verstärkt zu sein (Mollinedo et al., 1993).
Transkriptionsfaktoren, die speziell die Differenzierung vom Blutmonozyten zum
reifen Gewebsmakrophagen regulieren, sind bis jetzt noch nicht bekannt.
Es konnten allerdings eine Reihe von Genen identifiziert werden, die im Laufe dieses
Differenzierungsprozesses unterschiedlich exprimiert werden. Anhand solcher
Markergene lassen sich verschiedene Differenzierungsstadien der mononukleären
Phagozyten voneinander abgrenzen. Apolipoprotein E (Zannis et al., 1985), α2-
Makroglobulin, Ferritin (Ganter et al. 1989) oder c-sis Protoonkogen (Sariban and
Kufe, 1988) sind Beispiele für Gene, deren Expression im Laufe der Differenzierung
hochreguliert wird. Für andere Gene, wie z. B. α1-Antitrypsin (Ganter et al. 1989)
oder den M-CSF-Rezeptor (Horiguchi et al., 1986) wurde eine verringerte Expression
während der Differenzierung vom Monozyten zum Makrophagen beschrieben.
7

1.1.3.3 Funktionalität und Differenzierungsgrad
Einleitung
Neben der Morphologie und dem Expressionsmuster verschiedener Gene sind auch
die meisten Funktionen von Zellen des mononukleären Phagozytensystems vom
Aktivierungs- und Differenzierungszustand der Zellen abhängig. Monozyten und reife
Makrophagen besitzen entsprechend ihrer unterschiedlichen Einsatzorte im Körper
ein unterschiedliches funktionelles Repertoire.
Funktion Monozyt Makrophage
Zytotoxizität + +++
Phagozytose + +++
Antigenpräsentation ++ +
Sekretion von: IL-1β +++ (+)
PGE2 +++ +
IL-6 +++ ++
TNF-α + +++
M-CSF + +++
GM-CSF + +++
Neopterin + +++
Enzymaktivitäten: Lysozym + +++
TRAP - +++
Peroxidase +++ -
Tabelle 1-2 Übersicht über differenzierungsabhängige funktionelle Unterschiede
in Monozyten/Makrophagen.
Makrophagen sind z.B. stärker zytotoxisch als Monozyten (Andreesen et al., 1988a;
Munn and Cheung, 1989) und bessere Phagozyten (Jungi und Hafner, 1986),
während die Fähigkeit der Antigenpräsentation im Laufe der Differenzierung abnimmt
(Peters et al., 1987; Ettensohn et al., 1989; Schlesier et al., 1994). Die Peroxidase-
Aktivität nimmt während der Differenzierung ab, die Aktivität der Tartrat-resistenten
sauren Phosphatase (TRAP) steigt dagegen an (Musson, 1983; Andreesen et al.,
1983a). Der Makrophage sezerniert mehr Lysozym (Andreesen et al., 1983b),
Neopterin (Andreesen et al., 1990a) und Apolipoprotein E (Zannis et al., 1985).
Makrophagen besitzen im Vergleich zu Monozyten die Fähigkeit, größere Mengen an
TNF-α oder Kolonie-stimulierenden Faktoren zu produzieren, dafür sezernieren sie
8

Einleitung
im Gegensatz zu Monozyten kein IL-1β und weniger IL-6 (Wevers und Herzyk, 1989;
Scheibenbogen et al., 1990; Scheibenbogen and Andreesen, 1991; Krause et al.,
1992).
1.1.3.4 Expression von Oberflächenantigenen
Antikörper gegen Oberflächenantigene haben sich als wertvolles Werkzeug zur
phänotypischen Charakterisierung hämatopoetischer Zellen erwiesen. Nicht nur
unterschiedliche Linien innerhalb der Blutzellen, auch verschiedene
Differenzierungsgrade lassen sich anhand der Expression bestimmter
Oberflächenantigene unterscheiden.
Tabelle 1-3 zeigt eine Aufstellung von wichtigen und zum Teil differenzierungsassoziierten
Oberflächenantigenen auf Zellen des mononukleären
Phagozytensystems.
Die meisten der aufgeführten Oberflächenantigene lassen sich auch auf anderen
Zelltypen nachweisen, sind also nicht linienspezifisch. CD 14 ist eines der wenigen
linienspezifischen Differenzierungsantigene innerhalb der hämatopoetischen Zellen,
das ausschließlich von Zellen der myeloiden Linie, in Bezug auf Monozyten und
Makrophagen jedoch nicht reifungsassoziiert exprimiert wird. Es wird häufig zur
Identifizierung von Monozyten und Makrophagen verwendet. Beispiele für
weitgehend linienspezifische und reifungsassoziierte Oberflächenantigene sind die
Proteine, die von den Antikörpern der MAX-Serie erkannt werden (Andreesen et al.,
1986).
1.1.3.5 Die monoklonalen Antikörper MAX.1, 3 und 11 als
phänotypische Marker für reife Makrophagen
Drei der von Andreesen et al. bereits 1986 beschriebenen Antikörper der MAX-Serie,
die monoklonalen Antikörper MAX.1, 3 und 11, sind wegen ihrer weitgehenden
Linienspezifität innerhalb der Blutzellen und der reifungsassoziierten Expression ihrer
Antigene auf Makrophagen besonders interessant. In allen drei Fällen ist das
9

Antigen CD Differnzierungsstadium
M G M P M M
I M B M O A
X K
Einleitung
MHC-Klasse II Andreesen et al., 1990b
Stammzell-Marker CD 34 Buhring et al., 1989
gp 67 CD 33 * Peiper et al., 1989
Buhring et al., 1989
LFA-1 (α-Kette) CD 11a Prieto et al., 1994
Komplement Rezeptor Typ 3 (α-Kette) CD 11b Prieto et al., 1994
Komplement Rezeptor Typ 4 (α-Kette) CD 11c Prieto et al., 1994
Aminopeptidase N CD 13 Griffin et al., 1981, 1983
LBP/LPS-Rezeptor (gp55) CD 14 Todd et al. 1981
Lewis x CD 15 * Prieto et al., 1994
Fc-Rezeptor III (gp50-65) CD 16 * Clarkson and Ory, 1988
Andreesen et al., 1990b
VLA-3 (α-Kette) CD 49c * Prieto et al., 1994
VLA-4 (α-Kette) CD 49d * Prieto et al., 1994
VLA-6 (α-Kette) CD 49f Prieto et al., 1994
Vitronektin-Rezeptor
(α-Kette)
Interzelluläres Adhäsions-molekül - 1
(ICAM-1)
CD 51 * Andreesen et al., 1990b
Krissansen et al., 1990
CD 54 * Prieto et al., 1994
L-Selektin CD 62L * Prieto et al., 1994
Transferrin-Rezeptor CD 71 Andreesen et al., 1990b
CD 82 Lebel-Binay et al. 1994
α2-Makroglobulin-Rezeptor Munck-Petersen et al., 1987
Interzelluläres Adhäsions-molekül - 2
(ICAM-2)
CD 102 * Prieto et al., 1994
Endoglin CD 105 * Lastres et al., 1992
Mannose-Rezeptor - Ezekowitz and Stahl, 1988
Adenosin A1-Rezeptor - Salmon et al., 1993
PAM-1 (peptidylglycine alpha-amidating
monooxygenase)
- Poli et al. 1993
M130 - Law et al., 1993
gp 86 (25F9-Antigen) * Zwadlo et al., 1985
gp 58-64 (MAX.1) - * Andreesen et al., 1986
gp 58-64 (MAX.11) - * Andreesen et al., 1986
gp 60-80 (MAX.3) - Andreesen et al., 1986
B148.4 - * Anegon et al., 1993
Tabelle 1-3 Übersicht über Oberflächenantigene auf myeloiden Zellen. (MIX:
CFU-Mix, GM: CFU-GM, MB: Monoblast, PM: Promonozyt, MO:
Monozyt, MAK: Makrophage; dunkelgraue Felder: deutliche
Expression,hellgraue Felder: schwächere Expression,(*): sehr
geringe Expression) (Nach Klein, 1991).
10

Einleitung
Antigen auf Monozyten nicht oder nur sehr gering vorhanden. Im Laufe der
Differenzierung in vitro ist ein deutlicher Anstieg der Expression beobachtbar
(Andreesen et al., 1986, 1988b). MAX.1 und besonders MAX.11 markiert in vivo alle
Arten von Makrophagen aus serösen Körperhöhlen (Alveolarmakrophagen, Pleuraund
Peritonealmakrophagen) und Flüssigkeiten (Makrophagen aus Synovia oder
Muttermilch) (Andreesen et al., 1988b). Auch gewebsständige Makrophagen konnten
in geringerem Ausmaße mit den Antikörpern gefärbt werden (Köller, 1989). Neben
Makrophagen wurden auch Mesangiumzellen der Niere, dendritische
Retikulumzellen in Lymphknoten, subepitheliale Strukturen im Darm und
zytotrophoblastische und synzytiale Zellen der Plazenta gefärbt (Andreesen et al.,
1988b). Der Antikörper MAX.3 färbt keine anderen Strukturen, außer in einigen
Fällen Endothelzellen. MAX.3 zeigt allerdings innerhalb der Blutzellen eine
Kreuzreaktivität mit Megakaryozyten und Thrombozyten (Andreesen et al., 1986).
Auch unterschied er sich von MAX.1/11 leicht im Färbeverhalten von verschiedenen
Makrophagentypen. So wurden z.B. keine Alveolarmakrophagen oder Makrophagen
aus Muttermilch durch den Antikörper markiert (Andreesen et al., 1988b).
Die von den Antikörpern markierten Antigene waren unbekannt - ihre
Charakterisierung und Identifizierung waren u.a. Ziele der vorliegenden Arbeit.
1.1.4 Modellsysteme für die Makrophagendifferenzierung
Gereinigte humane Makrophagen sind nur selten verfügbar, funktionelle Aspekte und
Differenzierungsvorgänge im mononukleären Phagozytensystem sind am Menschen
nur schwer zu untersuchen. Deshalb ist es für viele Untersuchungen nötig auf
geeignete Modellsysteme zurückzugreifen (Andreesen and Kreutz, 1994).
1.1.4.1 In-vitro-Differenzierung von humanen Blutmonozyten
Die in vitro Differenzierung von frisch isolierten, humanen Blutmonozyten dürfte ein
gutes Modell für den Reifungsprozess von ins Gewebe auswandernden Monozyten
darstellen. Dieser Differenzierungsprozess läßt sich durch eine Vielzahl von
Parametern (Differenzierungsstimulus, Kultursubstrat, Reinheit der Zellen,...)
modulieren, unterschiedliche Kulturbedingungen können also unterschiedliche
Makrophagentypen erzeugen.
11

Einleitung
Monozyten reifen bei einer Kulturdauer von 7 Tagen in der Anwesenheit von
humanem Serum in Makrophagen aus, die in vielen Aspekten, z.B. Morphologie und
funktionellem Repertoire, ruhenden Gewebsmakrophagen oder reaktiven Histiozyten
entsprechen (Andreesen et al., Musson et al., 1983). Innerhalb der Arbeitsgruppe
Andreesen wurden inzwischen einige Faktoren charakterisiert, die für das Überleben
(M-CSF) und die Reifung vom Monozyten zum Makrophagen von Bedeutung sein
können, wie z.B. Albumin, Immunglobuline und 1,25-Dihydroxyvitamin D3 (Brugger et
al. 1991; Kreutz et al., 1990, 1992).
Unter bestimmten Kulturbedingungen (IL-4, GM-CSF) können Monozyten sogar,
abseits vom typischen Makrophagen-Differenzierungsweg, in Zellen
ausdifferenzieren, die sich durch besonders gute Antigenpräsentation auszeichnen
und in ihren Eigenschaften dendritischen Zellen ähnlich sind (Xu et al., 1995; Romani
et al., 1994).
Schumann et al. (1989) konnten zeigen, daß Morphologie und Antigenexpression bei
der Wahl unterschiedlicher Kultursubstrate variieren können - die Adhärenz spielt
also zusätzlich zu induzierenden Substanzen ein große Rolle im Reifungsprozess.
Auch kontaminierende Lymphozyten können die Differenzierung modulieren (Zaiss et
al., 1991; Lopez et al., 1993).
Die aufgeführten Beobachtungen machen deutlich, welche Flexibilität den Zellen des
mononukleären Phagozytensystems zu eigen ist und wie wichtig eine funktionelle
und phänotypische Charakterisierung für das Verständnis dieses Zellsystems in
normalen und pathophysiologischen Situationen ist.
1.1.4.2 Differenzierung von myeloiden Leukämiezellinien
In den letzten Jahren wurden einige myeloide Leukämiezellinien etabliert, die durch
Zugabe von verschiedenen Substanzen (z.B. Phorbolester, Vitamin D3,...) in
Monozyten/Makrophagen-ähnliche Zellen ausdifferenzieren (s. Tabelle 1-4). Dieser
Differenzierungsprozess führt zu einer veränderten, monozyten/makrophagenartigen
Morphologie und erhöhter Adhärenz, zusätzlich werden die Expression bestimmter
Differenzierungsantigene (z.B. CD 14) und Funktionen wie z.B. Phagozytose oder
Lysozym-Sekretion induziert.
12

Zellinie Differenzierungsstadium induzierendes
Agens
HL-60 promyeloid PMA
VitD3
U937 histiozytär PMA
VitD3
IFN-γ
THP-1 monoblastär-promonozytär PMA
IFN-γ, Retinsäure
MonoMac6 promonozytär-monozytär IFN-γ
TNF-α
Literatur
Einleitung
Cassileth et al., 1981
Bar-Shavit et al., 1983
Liu and Wu, 1992
Dodd et al., 1983
Ralph et al., 1983
Auwerx et al., 1988
Nakamura et a., 1986
Ziegler-Heitbrock et al., 1988
Weber et al., 1993
Tabelle 1-4 Beispiele für gut charakterisierte myeloide Leukämiezellinien und
Substanzen, die eine Differenzierung in Monozyten-/Makrophagenähnliche
Zellen induzieren.
Die meisten dieser Zellinien repräsentieren frühe Vorläuferstadien der myeloiden
Linie, eine Differenzierung führt bei ihnen eher zur Entwicklung von monozytären
Eigenschaften. Die aufwendige Reinigung von Blutmonozyten und bei solchen
Primärzellen auftretende spenderabhängige Varianzen können durch diese Zellinien
zwar umgangen werden, ein Einfluß der Transformation und der kontinuierlichen
Proliferation auf den induzierten Differenzierungsprozess kann allerdings nie
ausgeschlossen werden.
13

2 ZIELSETZUNG
Zielsetzung
Im Rahmen dieser Doktorarbeit sollte über die Klonierung und Charakterisierung von
Proteinen, die nur von reifen Makrophagen nicht aber von Monozyten exprimiert
werden, das Wissen über die Makrophagendifferenzierung verbessert werden.
Im Vordergrund stand die biochemische Charakterisierung, Aufreinigung und
Klonierung von Zelloberflächenantigenen, die von den monoklonalen Antikörpern
MAX.1/11, MAX.3 sowie einigen neu produzierten Antikörpern reifungsassoziiert auf
Makrophagen erkannt werden.
Diese Antigene sollten mit verschiedenen proteinbiochemischen Methoden
charakterisiert und anschließend chromatographisch aufgereinigt werden. Die
Analyse der Aminosäuresequenz der aufgereinigten Proteine, eventuell (bei Nterminaler
Blockierung) nach tryptischem Verdau und anschließender HPLC-
Auftrennung der Peptidfragmente, sollte das weitere Vorgehen bestimmen. Im Falle
von unbekannten Aminosäuresequenzen sollten die entsprechende Gene aus einer
bereits vorhandenen cDNA-Bank kloniert und möglichst auch funktionell
charakterisiert werden.
Desweiteren sollte mit Hilfe molekularbiologischer Screening-Methoden nach
reifungsassoziiert exprimierten Genen gesucht werden. Klonierte, reifungsassoziierte
Gene sollten sequenziert und mit Hilfe von Computeranalysen auf Sequenzhomologien
zu bekannten Genen untersucht werden. Das weitere Vorgehen sollte
von den bis dahin erarbeiteten Ergebnissen abhängen. Bei unbekannten Genen
sollte das Expressionsmuster (Gewebeverteilung, Expression in anderen hämatopoetischen
Zellen) und eine mögliche funktionelle Bedeutung untersucht werden.
14

3 MATERIAL UND METHODEN
3.1 Materialien und Geräte
3.1.1 Geräte
Material und Methoden
Autoklav Technomara, Fernwald
Beta-Counter Canberra-Packard, Frankfurt
Blutzellseparator CS 3000 Baxter Healthcare, Derrfield, USA
Brutschränke Heraeus, Hanau
Chromatographie Anlage Pharmacia, Freiburg
Densitometer Molecular Dynamics, Krefeld
Elektrophoreseapparaturen Biometra, Göttingen; BioRad, München
ELISA-Reader MWG-Biotech, Ebersberg; Dynatech, Denkendorf
ELISA-Waschgerät Dynatech, Denkendorf
Elutriator J6-MC Beckman, München
FACScan Becton-Dickenson, San Jose, USA
Fluoreszenz-Spektrophotometer Hitachi, Tokyo, Japan
Hybridisierungsofen Biometra, Göttingen
Mikroskope Leitz, Heidelberg
Netzgeräte Biometra, Göttingen; Bachofer, Reutlingen
PCR-Thermocycler Perkin Elmer, Überlingen
pH-Meter Knick, Berlin
Photokamera Polaroid, Cambridge, USA
Pumpe, Masterflex 70 1600 Cole-Parmer, Chicago, USA
Schweißgerät (Fermant 400) Josten & Kettenbaum, Bensberg
Sequenziergerät ABI, Weiterstadt
Speed Vac Christ, Osterode
Spektrophotometer Perkin Elmer, Überlingen
Sterilbänke Heraeus, Hanau
Thermomixer Eppendorf, Hamburg
Tischzentrifugen Heraeus, Hanau; Eppendorf, Hamburg
Ultrazentrifuge Beckman, München
Video-Dokumentationssystem Intas, Göttingen
Wasseraufbereitungsanlage Millipore, Eschborn
3.1.2 Verbrauchsmaterialien und Plastikartikel
Zellkulturflaschen Costar, Cambridge, USA
Zellkulturplatten (6, 24, 96 Vertiefungen),
Zellkulturschalen Falcon, Heidelberg
ELISA-Platten (für MO-Kultivierung) Greiner, Nürtingen
Einmalpipetten Costar, Cambridge, USA
Zentrifugenröhrchen (15, 50, 225 ml) Falcon, Heidelberg
Reaktionsgefäße Eppendorf, Hamburg
Poystyrolröhrchen für Durchflußzytometer Falcon, Heidelberg
Röntgenfilme X-Omat AR5 Kodak, Rochester, USA
15

Kryoröhrchen Nunc, Naperville
Sterilfilter Millipore, Eschborn
Nylon Transfermembranen MSI, Westboro, USA
Nitrozellulosemembranen Schleicher & Schuell, Dassel
3.1.3 Chemikalien
Material und Methoden
Alle verwendeten Feinchemikalien waren, wenn nicht anders vermerkt, von Sigma
(Deisenhofen) oder Merck (Darmstadt). Von Amersham (Braunschweig) wurden
sämtliche verwendeten Radiochemikalien bezogen. Das synthetische Peptid Dansyl-
Ala-Arg wurde von der Firma BioTeZ (Berlin) hergestellt, Oligonukleotide wurden von
den Firmen MWG Biotech (Ebersberg) und TIB Molbiol (Berlin) synthetisiert. Die
verwendeten Materialien für Chromatographie waren, wenn nicht anders vermerkt,
von Pharmacia (Freiburg)
3.1.4 Antikörper und Kopplungsreagenzien
monoklonale.
LeuM5 (Anti CD11c) Dianova, Hamburg
My4 (Anti CD14) Coulter, Krefeld
MAX-Antikörper F. Emmrich, Leipzig
7A2, 8H8 eigene Arbeitsgruppe
TaqStart-Antibody Clontech
polyklonale:
Schweineserum Dako, Hamburg
Kaninchen-Anti-Maus Dako, Hamburg
Ziege-Anti-Maus, Peroxidase-gekoppelt Dianova, Hamburg
Ziege-Anti-Maus, FITC-gekoppelt Dianova, Hamburg
Schwein-Anti-Kaninchen Dako, Hamburg
Kaninchen-Peroxidase-Anti Peroxidase Dako, Hamburg
Streptavidin-Peroxidase Dianova, Hamburg
Streptavidin-Alkalische Phosphatase Dianova, Hamburg
NHSS-Biotin Serva, Heidelberg
3.1.5 Enzyme, Inhibitoren und molekularbiologische Kits
5´-End Labeling Kit Amersham, Braunschweig
Aprotinin Boehringer Mannheim
DNAse I (RNAse-frei) Boehringer Mannheim
Expand PCR Systeme Boehringer Mannheim
Glykosidasen Boehringer Mannheim
Leupeptin Boehringer Mannheim
Marathon cDNA Amplification Kit Clontech, Palo Alto, USA
pCRII-Cloning Kit Invitrogen, San Diego, CA, USA
Phosphatidylinosit-Phospholipase C Boehringer Mannheim
Plasmid Mini Kit Qiagen, Hilden
PMSF Sigma, Deisenhofen
16

Material und Methoden
Proteinase K Promega, Madison, Wi, USA
Random Primed DNA Labeling Kit Boehringer Mannheim
Restriktionsenzyme Boehringer Mannheim
Reverse Transkriptase SuperSkript II Gibco BRL, Eggenstein
RNAmap GenHunter Corporation, Brooklin, MA, USA
RNAse Boehringer Mannheim
RNAse-Inhibitor Boehringer Mannheim, Pharmacia
T4-DNA-Ligase Boehringer Mannheim
Taq DNA-Polymerase Boehringer Mannheim
Tunicamycin A1 Calbiochem, Bad Soden
3.1.6 Molekulargewichtsstandards
Verwendete DNA-Längenstandards:
Lambda DNA Hind III-Verdau (Gibco BRL, Eggenstein):
23130 9416 6557 4361 2322 2027 564 125 (bp)
ΦX-174 RF DNA Hae III-Verdau (Gibco BRL, Eggenstein):
1353 1078 872 603 310 (bp)
Lambda DNA Hind III- /ΦX-174 RF DNA Hinc III- Verdau (Phamacia):
23130 9416 6557 4361 2322 2027 1057 770 612 564 495 392
345 341 335 297 291 210 162 125 (bp)
Molekulargewichtstandards für Proteine:
Broad Molecular Weight Standard (HLMW, BioRad, ):
200,0 116,25 97,4 66,2 45,0 31,0 21,5 14,4 6,5 (kDa)
HLMW, biotinyliert (BioRad, )
200,0 116,25 97,4 66,2 45,0 31,0 21,5 14,4 6,5 (kDa)
3.1.7 Vektoren
Bakteriophagen:
Lambda ZAP II Statagene
Plasmide:
pBlueskript SK Stratagene
pCRII Invitrogen, San Diego, CA, USA
pcDNAI Invitrogen, San Diego, CA, USA
3.1.8 Primersequenzen
Sequenzierprimer:
M13 (-20) forward 5´-TTG TAA AAC GAC GGC CAG TG-3´
M13 reverse 5´-GGA AAC AGC TAT GAC CAT GAT-3´
SK 5´-TCT AGA ACT AGT GGA TC-3´
T3 5´-ATT AAC CCT CAC TAA AG-3´
T7 5´-AAT ACG ACT CAC TAT AG-3´
dd3f-SEQ1 5´-ATT CTA TCA CAC ATG TGA AA-3´
dd3f-SEQ2 5´-ACA GTT AGC AGC ATG TTC A-3´
dd3f-SEQ3 5´-GGT CCA AGT TCA CGA AGA T-3´
dd3f-SEQ4 5´-TTC AGA GTA AGA GGT TGG-3´
dd3f-SEQ5 5´-TTG GTT GGT GTT ATC ACT GGG TAC CTT GCC T-3´
17

Material und Methoden
Oligonucleotide und PCR-Primer:
18S spezifisches Oligonukleotid 5´-ACG GTA TCT GAT CGT CTT CGA ACC-3´
T3 (27mer) 5´-CAA GCT CGA AAT TAA CCC TCA CTA AAG-3´
CPMsense 5´-TTT CAA CTA CCA CCG CCA GGA AGG-3´
CPMantisense 5´-ATG TGC AAA AGA CTC ACT AAA AAT AA-3´
CPM P1 5´-GCT ACC AAA GGC AGC AAC AGC CCT AG-3´
CPM P3 5´-CTC CCG CCC AAC AGT CTC ATC TCC ATG CAT-3´
CPM P4 5´-CCA TTA TCA AAT GGG TAA CTG GCC ACG AGG-3´
HCgpRACE 5´-CTT GAG TGT GTT GAG CAT GCC GTA GAG CGT-3´
HCgpIN 5´-GAG CAG CAC CAG GAC CAC AAA GCC TGT TTG-3´
HCgpOUT 5´-GTA GCA GAC CAG TTT GTA TGC AGA GCA GCA CTG-3´
3.1.9 Bakterien und Zellinien
E.coli-Stämme:
XL1-blue recA1, endA1, gyrA46, thi-1, hsdR17, supE44, relAl, lac,
[F´, proAB lacI q Z∆M15, Tn10 (Tet r )]
INVaF´ recA1, endA1, hsdR17(r -κ m +κ ), supE44, λ-, thi-1, gyrA, relAl,
Φ80 lacZ∆M15∆(lacZYA-argF), deoR + , F´
Eukaryontische Zellinien:
K-562 humane chronisch myeloische Leukämiezellinie (DSM ACC10)
HL-60 humane akute myeloische Leukämiezellinie (DSM ACC3)
U937 humane histiozytisches Lymphomzellinie (DSM ACC5)
THP-1 humane monozytische Leukämiezellinie (DSM ACC16)
3.2 Zellbiologische Methoden
3.2.1 Kultur der Zellinien
3.2.1.1 Kulturbedingungen und Passagierung
Die verwendeten Zellinien wurden, wenn nicht anders angegeben, in RPMI 1640 mit
folgenden Zusätzen kultiviert: L-Glutamin (2mM), 2 ml Vitamine,
Penicillin/Streptomycin (100 U/ml), Natriumpyruvat (1mM), 2-Mercapthoethanol (50
µM). Alle Zusätze waren von Gibco, Eggenstein. Dem Medium wurde 10% fötales
Kälberserum zugesetzt und die Zellen bei 37°C, 5% Kohlendioxidgehalt und 95%
relativer Luftfeuchtigkeit in einem Inkubator (Heraeus, Hanau) kultiviert. Die Seren
wurden vor Gebrauch bei 56°C für 30 min inaktiviert. Nach Erreichen der Konfluenz
wurden die Zellen zur Passage mit PBS gewaschen und 5 bis 10 min mit 0,05%
Trypsin/ 0,02% EDTA bei 37°C inkubiert, in Medium mit Serum aufgenommen und
1:5 bis 1:10 verdünnt in neue Zellkulturflaschen verteilt.
18

3.2.1.2 Zellzahl- und Vitalitätsbestimmung
benötigte Materialien:
Trypanblaulösung: 0,2 % (w/v) Trypanblau
in 0,9%iger NaCl-Lösung
Neubauer Zählkammer
Material und Methoden
Die Zellzahl und die Vitalität der Zellen wurde mikroskopisch mit Hilfe des
Trypanblau-Ausschlußtests bestimmt. Dazu wurde die Zellsuspension mit der
Trypanblaulösung verdünnt und in einer Neubauer-Zählkammer die Zellen innerhalb
eines Großquadrates (= 16 Kleinquadrate) ausgezählt.
Berechnung der Zellzahl: z [Zellen/ml] = Z x V x 10 4
Z = Zahl der ungefärbten Zellen in einem Großquadrat (1 mm 2 );
V = Verdünnungsfaktor
3.2.1.3 Einfrieren und Auftauen von Zellen
Einfriermedium: 50% RPMI 1640
40% FCS
10% DMSO (Dimethylsulfoxid)
Zellen wurden vor Erreichen der Konfluenz geerntet und in 1 ml eiskaltem
Einfriermedium aufsuspendiert. Die Zellen wurden in Kryoröhrchen überführt und in
Styroporbehältern für 24 h bei -70°C gelagert. Die dauerhafte Lagerung der Zellen
erfolgte in Flüssigstickstoff.
Zum Auftauen wurden die Zellen direkt aus dem Stickstoff in ein 37°C warmes
Wasserbad überführt und sofort nach dem Auftauen in warmes, serumhaltiges
Medium aufgenommen. Nach Absinken der Zellen wurde das Medium gewechselt.
3.2.1.4 Nachweis von Mykoplasmen
Alle Zellinien wurden in regelmäßigen Abständen auf Mykoplasmenkontamination
untersucht. Der Nachweis wurde über eine zytologische Beobachtung mit Hilfe einer
DNA-Färbung mit dem Fluoreszenzfarbstoff 4’,6-Diamidin-2-phenylindoldihydrochlorid
(DAPI) geführt. Die Durchführung erfolgte gemäß Herstellerangaben
(Mykoplasmen-Detektions-Kit, Biochrom, Berlin).
19

3.2.2 Monozytenisolierung durch Gegenstromelutriation
Benötigte Lösungen und Chemikalien:
Ficoll-Paque (Pharmacia; Freiburg)
PBS
PBS/6% H2O2
HANKS „Balanced Salt Solution“ mit 6 % autologem Blutplasma
Material und Methoden
Freiwilligen, gesunden Spendern wurde mittels einer Leukapherese ein Leukozytenangereichertes
Blutkonzentrat abgenommen (Graw et al. 1971). Die mononukleären
Zellen (MNC) wurden durch eine Dichtegradienten-Zentrifugation über Ficoll-Paque
aus dem Konzentrat isoliert und dreimal mit PBS gewaschen (Johnson et al. 1977).
Die Isolierung von MO aus dem MNC-Gemisch erfolgte anschließend über eine
Gegenstrom-Zentrifugation (Elutriation) (Sanderson et al. 1977).
Fraktion Durchflußrate
Pumpe
(ml/min)
Hauptanteil an Zellen in der
Fraktion
1a 52 Thrombozyten
1b 57 kleine ⎫
2a 64 ⎩ Lymphozyten
2b 74 ⎧ (T- und B-Zellen)
2c 92 große ⎭
3 111 Monozyten
Tabelle 3-1 Zusammenfassende Darstellung der Einstellungsparameter für die
Elutriation und der in den Fraktionen abgesammelten Zellen.
Die Elutriation erfolgt mit einer Beckman-Zentrifuge (J6-MC) in einer 50 ml Kammer.
Die Anlage wurde mit einer 6%igen Wasserstoffperoxidlösung sterilisiert und zweimal
für je 20 min mit PBS gespült.
Bei konstanter Zentrifugationsgeschwindigkeit von 2500 Upm bei 4°C wurde die
Pumpe geeicht und bei einer Durchflußrate von 52 ml/min mit den mononukleären
Zellen beschickt. Der Zulauf von HANKS wurde kontinuierlich fortgesetzt und die
Durchflußrate stufenweise gesteigert. Nacheinander wurden Fraktionen
abgesammelt (s. Tabelle 3-1) und die Monozyten als größte Zellen innerhalb der
MNC-Population, in der letzten Fraktion 3 abgesammelt. Der Anteil an CD14positiven
Zellen (Monozyten) in dieser Fraktion wurde immunhistochemisch oder
durch Durchflußzytometrie bestimmt. Die Reinheit der Monozyten-Fraktion lag bei 85
- 95%.
20

Material und Methoden
Die Monozyten wurden bei 1200 Upm (≅ 300 g) abzentrifugiert, in Medium
aufgenommen und die Zellzahl bestimmt. Die Ausbeute an Monozyten war
spenderabhängig und lag zwischen 10-30% bezogen auf die Gesamtzahl der in der
Elutriation eingesetzten MNC.
3.2.3 Kultivierung von Monozyten
Um Monozyten zu verschiedenen Zeitpunkten der Differenzierung in Makrophagen
zu erhalten, wurden diese in hydrophoben Teflonbeuteln kultiviert. Sie wurden mit
einer Zelldichte von 1 x 10 6 Zellen/ml in RPMI 1640 mit niedrigem Endotoxingehalt
und 2% AB-Serum unter Standardkulturbedingungen gehalten. Nach der jeweiligen
Kulturperiode wurde die Morphologie der Zellen im Beutel unter dem Mikroskop
begutachtet. Zum Ablösen der Zellen wurden sie für 45 min in den Kühlschrank
gelegt. Die abgelösten Zellen wurden geerntet, die Zellzahl bestimmt und für
weitergehende Experimente eingesetzt (Andreesen et al. 1983b).
War die Ablösung von vitalen Monozyten/Makrophagen für weitere Experimente nicht
notwendig, wurden die Zellen von vorneherein in große Plastikschalen ausgesät (für
RNA-Präperationen), oder in 96-well-Platten (unbeschichtete ELISA-Platten, Greiner,
Nürtingen) pipettiert (1 x 10 5 /Vertiefung in 200 µl Medium, für Zell-ELISA).
Zur Generierung von dendritenähnlichen Zellen wurden Monozyten wurden mit einer
Zelldichte von 1 x 10 6 Zellen/ml in RPMI 1640 mit folgenden Zusätzen kultiviert: FCS
(10%), rGM-CSF (100 U/ml), rIL-4 (50 U/ml); IFN-γ (50 U/ml) und LPS (100 pg/ml).
Nach 2 bzw. 5 Tagen wurde Medium nachgegeben (je 10 ml bei 25 ml Startkultur),
nach 10 Tagen wurden die Zellen geerntet. Ein Großteil der Zellen befindet sich in
Suspension und zeigt ein typisch verzweigt-polymorphes Aussehen (Xu et al. 1995).
3.2.4 Gewinnung von humanen Thrombozyten
Humane Thrombozyten wurden als �Abfallprodukt" der oben beschriebenen
Gegenstromelutriation gewonnen. Sie fielen aufgrund ihrer geringen Größe bei
niedrigem Gegenstrom als erste Fraktion an und waren nur geringfügig durch kleine
Lymphozyten verunreinigt (weniger als 1 0 /00). Die Thrombozytenfraktion wurde zur
Entfernung von Serumproteinen dreimal mit PBS gewaschen (800g, 10´, 4°C).
21

3.3 Immunologische Methoden
Material und Methoden
3.3.1 Reinigung von Antikörpern aus Hybridomüberständen
3.3.1.1 Reinigung von Antikörpern über thiophile Agarose
benötigte Materialien und Reagenzien:
Waschpuffer: A. 158.6 g (1.2 M) (NH4)2SO4
4.1 g (50 mM) Natriumacetat (CH3COONa) / HCl pH 5.2
ad 1000 ml mit aqua bidest
B. 118.9 g (0.9 M) (NH4)2SO4
4.1 g (50 mM) Natriumacetat (CH3COONa) / HCl pH 5.2
ad 1000 ml mit aqua bidest
C. 79.3 g (0.6 M) (NH4)2SO4
4.1 g (50 mM) Natriumacetat (CH3COONa) / HCl pH 5.2
ad 1000 ml mit aqua bidest
Elutionspuffer: 6.06 g (0.05 M) Tris / HCl pH 9.0
ad 1000 ml mit aqua bidest
Regenerationslösung: 0.4 g (10 mM) NaOH
254 ml (20%) Isopropanol
ad 1000 ml mit aqua bidest
Säulenmaterial: 50 ml AFFI-T TM thiophile Agarose von
KemEnTech
(Bindungskapazität ca. 750ml Hybridomüberstand)
Diese Methode eignet sich zur Reinigung von IgG1, IgG2a und IgM aus
Hybridomüberständen.
Es wurden 750 ml Hybridomüberstand zentrifugiert (mind 15000 g, 30´) und der
Überstand auf 1.2 M (NH4)2SO4 und pH 5.2 (HOAc oder HCl) einstellt (ca.125 g
(NH4)2SO4)). Die Säule (50 ml thiophile Agarose) wurde mit Waschpuffer A
äquilibriert, der Zellkulturüberstand auf die Säule gegeben (Flußrate ca. 5 ml/min)
und mit Waschpuffer A gewaschen bis bei A 280nm die Baseline erreicht ist. Die
Fraktionen nach der Zugabe von Waschpuffer B, Waschpuffer C und Elutionspuffer
wurden abgesammelt und über SDS-PAGE auf ihren Antikörpergehalt getestet. Die
Fraktionen mit gereinigten Antikörper wurde gegen PBS dialysiert und bei 4°C
gelagert (Porath and Hutchens, 1986).
Wenn eine weitere Anreicherung nötig war, wurde die Antikörperlösung über Protein
A/G ankonzentriert.
22

Material und Methoden
3.3.1.2 Reinigung von Antikörpern über Protein G Sepharose
benötigte Materialien und Reagenzien:
Waschpuffer: PBS
Elutionspuffer: 750 mg (0.1 M) Glycin / HCl pH 2.7
ad 100 ml mit aqua bidest
Regenerationslösung: 22.5 g (3 M) KCl
ad 100 ml mit aqua bidest
Neutralisationspuffer: 18 g (1.5 M) Tris / HCl pH 8.8
ad 100 ml mit aqua bidest
Säulenmaterial: 1 ml Protein G Sepharose 4 Fast Flow
(Bindungskapazität ca. 6 mg Maus-MAb)
Nach dem Äquilibrieren der Säule mit PBS wurde die Antikörperlösung (aus
Ammoniumsulfat-Fällung oder der Aufreinigung über thiophile Agarose) auf die Säule
aufgetragen. Die Säule wurde mit PBS gewaschen (A 280nm : Baseline). Nach dem
Auftragen des Elutionspuffers wurde der Antikörperpeak unter Vorlage von
1 /5 Volumen Neutralisationspuffer abgesammelt und die Reinheit und Konzentration
des Antikörpers über SDS-PAGE und anschließende Coomassie-Färbung
abgeschätzt. Der gereinigte Antikörper wurde gegen PBS dialysiert und bei 4°C
gelagert (Ey et al., 1978).
3.3.2 Phänotypische Charakterisierung von Zellen
allgemein verwendete Puffer:
Hepes-Stammlösung:
(pH 7,4 bzw. pH 8,0): 23,83 g (1 M) Hepes/NaOH
ad 100 ml Millipore-Wasser,
filtrieren und portionsweise einfrieren
NKH-Puffer : 0,4 g (5,4 mM) KCl
8,0 g (134 mM) NaCl
2 ml (20 mM) Hepes-Stammlsg. (pH 7,4)
ad 1000 ml mit Millipore-Wasser
NAG-Puffer: 0,4 ml (40 mM) Hepes (pH 8,0)
100 µl (0,22%) BSA (22%)
0,1 ml (0,1%) NaN3 (10%)
0,5 ml (0,25%) Gelantine (5%)
1-2 Tropfen Phenolrot
ad 10 ml mit NKH-Puffer
23

3.3.2.1 Zell-ELISA
Benötigte Lösungen:
Fixierlösung: (0,05%) Glutaraldehyd
(1%) Glukose
ad 100 ml mit aqua bidest
Gelatine-Lösung (5%) Gelatine
(0,1%) NaN3
auf pH 7,4 einstellen
Material und Methoden
Blockierungspuffer: 1 ml (10%) Schweineserum (DAKO, Hamburg)
ad 10 ml mit NAG-Puffer
Kopplungspuffer: (140 mM) NaCl
(1,47 mM) K2HPO4
(20 mM) Na2HPO4/NaOH pH 7,9
(2,7 mM) KCl
(0,05%) Tween 20
(0,1%) Gelatine-Lösung
(15%) Glycerol
ad 500 ml mit aqua bidest
Zitronensäurepuffer: (1,17 M) Zitronensäure/ Na2HPO4 (0,25 M) pH 5.0
ad 500 ml mit aqua bidest
Sekundär-Antikörper-(Kaninchen gegen Maus, RaM-) Stammlösung:
20 µl (2%) RAM
50 µl (5%) humanes AB-Serum
ad 1 ml mit NAG-Puffer (über Nacht bei 4°C aufbewahren)
RaM-Gebrauchslösung: 5 ml (10%) RAM-Stammlösung
5 ml (10%) Schweine-Serum (DAKO, Hamburg)
ad 50 ml mit NAG-Puffer
Peroxidase-gekoppelter Ziege-anti-Kaninchen (GaR) Antikörper:
125 µl (0,025%) Peroxidase-konjugierter GaR
ad 5 ml in Kopplungs-Puffer (kurz vor Gebrauch frisch
angesetzt)
Substrat-Lösung (3,3 mM) 1,2-Phenylendiamin-dihydrochlorid
(OPD Fluka, Buchs, Schweiz,)
(0,012%) 30%-iges H2O2
ad 50 ml mit Zitronensäurepuffer
Schwefelsäure (1 M) 5,3 ml konz. Schwefelsäure
ad 100 ml aqua bidest
Nach Absaugen des Kulturmediums aus den 96-well-Platten wurde die
Restflüssigkeit abgeklopft und die adhärenten Zellen für 10 min auf Eis mit je 50µl
Fixierlösung inkubiert. Die Platten wurden anschließend dreimal mit NKH-Puffer
gewaschen und zur Absättigung unspezifischer Bindungen mit 50µl
Blockierungspuffer pro Loch für 15 min bei RT inkubiert. Anschließend erfolgte die
Inkubation mit den primären Antikörpern in den angegebenen Verdünnungen in
NAG-Puffer. Nach 30 min wurde dreimal mit Waschpuffer gewaschen, 50µl RaM-
Gebrauchslösung pro Vertiefung zugegeben und 15 min bei RT inkubiert. Nach
erneutem dreimaligem Waschen wurde für 30 min mit Peroxidase-gekoppeltem
24

Material und Methoden
Antikörper (Ziege gegen Kaninchen Ig, GaR) inkubiert und abschließend viermal
gewaschen. Pro Vertiefung wurden 100µl OPD-Substrat zugegeben und für genau
12 min im Dunkeln bei 37°C inkubiert. Die Farbumsetzungsreaktion wurde durch
Zugabe von 50 µl 1M H2SO4 pro Vertiefung abgestoppt und die OD486 nm bestimmt.
In jedem Einzelexperiment wurde für ein gegebenes Antigen der Mittelwert aus drei
Extinktionswerten berechnet und in Verhältnis zur OD eines nicht
differenzierungsabhängigen Antigens (β-2-Mikroglobulin bzw. CD11c; = 100%)
gesetzt und als Antigen-Expressionsindex (= AEI) ausgedrückt. Von allen Ansätzen
wurde vorher der Null-Wert (d.h. OD-Wert ohne Primär-Antikörper) subtrahiert
Andreesen et al., 1988c).
3.3.2.2 Durchflußzytometrie - Färbung für Oberflächenantigene
benötigte Lösungen:
FACS-Waschpuffer: 5 ml (600 mg/l) Sandoglobulin-Lösung (60 mg/ml)
5 ml (0,1 %) Natriumazid-Stammlösung (10%)
ad 500 ml mit PBS
Fixierlösung : 1 g (1%) Paraformaldehyd
ad 100 ml mit aqua bidest, auf 60°C erhitzen, einige Tropfen
0,1 M NaOH-Lösung zugeben, bis Trübung verschwunden
0,5 bis 1 . 10 6 Zellen wurden zweimal mit FACS-Waschpuffer gewaschen, auf die
Röhrchen verteilt und abzentrifugiert (1800 Upm, 5´, 4°C). Als Kontrollen wurden nur
Zellen (kein Antikörper), ein Ansatz mit Isotypkontrollantikörper (IgG gesamt; 1:200
verdünnt), und My4 (CD14) für myeloische Zellen als Positivkontrolle mitgeführt.
Je 50 µl der verschiedenen Antikörper wurden auf das Zellpellet gegeben und 30 - 45
min im Kühlschrank inkubiert. Die Zellen wurden zweimal mit je 500 µl FACS-
Waschpuffer gewaschen und der Sekundärantikörper (50 µl Ziege-Anti-Maus-FITC,
1:50 mit NAG verdünnt) zugeben. Nach einer Inkubationszeit von 30-45 min bei 4°C
im Dunkeln wurden die Zellen wieder zweimal mit je 500 µl FACS-Waschpuffer
gewaschen und anschließend mit 500 µl Fixierlösung versetzt und 30´bei 4°C
inkubiert. Die markierten Zellen wurden entweder sofort oder am nächsten Tag im
FACScan (Beckton-Dickinson) analysiert. Die Zellpopulationen wurden anhand ihrer
Vorwärtsstreuung und der seitlichen Streuung gegated, und die gesetzten Gates
durch die Expression bestimmter Antigene kontrolliert, im Falle von monozytären
Zellen durch eine vorhandene CD14-Expression.
25

3.4 Proteinchemische Methoden
3.4.1 Solubilisierung von zellulären Proteinen
3.4.1.1 Präparation von Zellmembranen zur Messung
membrangebundener Enzymaktivität
benötigte Reagenzien:
PBS/PMSF: 500µl (1 mM) PMSF-Stammlösung (100 mM)
ad 50 ml mit PBS
NaCl/PBS 5.84 g (2 M) NaCl
ad 50 ml mit PBS
PBS/NP-40 1 ml (0.2 %) NP-40 (10%)
ad 50 ml mit PBS
Material und Methoden
Die Zellen wurden mehrmals mit PBS gewaschen, in möglichst wenig PBS/PMSF
resuspendiert und auf Eis mit Glashomogenisator aufgeschlossen. Große
Zellfragmente und Kerne wurden bei 1500 g (10´, 4°C) abzentrifugiert. Nach einer
weiteren Zentrifugation bei 8000 g (15`, 4°C) wurde der Überstand in der
Ultrazentrifuge bei 100000 g bei 4°C für 1 h zentrifugiert. Das Membranpellet wurde
in 1 ml NaCl/PBS resuspendiert und nochmal bei 100000 g für 1h zentrifugiert. Nach
dem vollständigen Abnehmen des Überstands wurden die gewaschenen
Membranfragmente in 0.5 - 1 ml PBS/NP-40 resuspendiert und ungelöstes Material
bei 8000 g abzentrifugiert (nach Skidgel, 1991).
3.4.1.2 Präparation von Zelloberflächenproteine durch Nonidet P-40
Lyse
benötigte Lösungen:
TBS-Stammlösung (2x): 4.8 g (40 mM) Tris / HCl pH 8.0
18 g (0.3 M) NaCl
0.74 g (2 mM) EDTA
50 mg (0.05 %) NaN3
ad 1000 ml mit aqua bidest
Proteasehemmer:
A. PMSF-Stammlösung: 1.74 g (100mM) PMSF
ad 100 ml mit Isopropanol
B. Aprotinin-Stammlösung: 10 mg/ml in aqua bidest
(50 µl - Portionen bei - 20°C lagern)
C. Leupeptin-Stammlösung: 0.5 mg/ml in aqua bidest
(100 µl - Portionen bei - 20°C lagern)
26

Material und Methoden
Tabelle 3-2
Zusammensetzung
von Waschpuffer
und Lysepuffer
Zur Extraktion zellulärer Oberflächenantigene wurden die Zellen geerntet und dreimal
mit PBS gewaschen. Die gewaschenen Zellen wurden in je 500 µl TBS-Waschpuffer
auf 0.5-1 x 10 7 Zellen resuspendiert und mit dergleichen Menge Lysepuffer versetzt.
Bei der Verwendung von Thrombozyten wurden pro Ansatz ca. 50µl entsprechende
Zellpellets lysiert. Die Suspensionen wurden kurz geschüttelt und für 30-45 min auf
Eis gesetzt. Zelltrümmer und größere Membranfragmente wurden abzentrifugiert
(15000 Upm, 15 min, 4°C), der Überstand enthielt die solubilisierten
Membranproteine.
3.4.2 Bestimmung der Proteinkonzentration mit BCA
benötigte Reagenzien:
Waschpuffer Lysepuffer
TBS (2x): 5 ml
PMSF 100 µl (1 mM)
Aprotinin 2 µl (2 µg/ml)
Leupeptin 10 µl (0.5 µg/ml)
NP-40 (10 %) 1 ml (1 %)
ad 10 ml mit aqua bidest
A. BCA-Lösung (Sigma)
B. CuSO 4 ⋅ 5 H 2 O (4% (w/v)) (Sigma)
C. 50 Teile A + 1 Teil B
(bei RT bis zu einer Woche stabil)
D. Proteinstandards zwischen 0.5 - 120 µg/100 µl
(im gleichen Puffer, wie die zu vermessende Probe gelöst)
Die BCA - Methode zur quantitativen Bestimmung der Proteinkonzentration in
Lösungen wurde entweder bei 37°C (2 - 120 µg/100 µl) oder empfindlicher bei 60°C
(0.5 - 25 µg/100 µl) durchgeführt. 10 - 50 µl Probe wurden mit 1 ml Reagenz C
versetzt (Doppelte Ansätze für Proben und Standards). Die Inkubation erfolgte für
30 min. Die Extinktion (OD) des lilagefärbten BCA-Komplexes wurde bei 562 nm
gemessen. Die Proteinkonzentrationen wurden anhand der Standardgeraden
berechnet (Smith et al. 1985).
27

3.4.3 Präparative Methoden zur Proteinfällung
3.4.3.1 Chloroformextraktion von Proteinen
Material und Methoden
Zu 1 ml (0.1 ml) proteinhaltiger Lösung wurden 4 ml (0.4 ml) Methanol gegeben, das
Gemisch geschüttelt, zentrifugiert (30 s bei 8000 - 9000g) und wieder durchmischt.
Nach der Zugabe von 1 ml (0.1 ml) Chloroform wurde erneut geschüttelt und
zentrifugiert (30 s bei 8000 - 9000g). Die Lösung wurde mit 3 ml (0.3 ml) H2O
versetzt, kräftig geschüttelt und zur Phasentrennung 2 min bei 8000 - 9000g
zentrifugiert. Die obere Methanol - Wasser - Phase wurde vorsichtig abgenommen
und verworfen. Zur übrigen Interphase der präzipitierten Proteine und der
Chloroformphase wurden 3 ml (0.3 ml) Methanol gegeben, nochmal kräftig
geschüttelt und 4 min bei 8000 - 9000g zentrifugiert. Der Überstand wurde
abgenommen, das Pellet getrocknet und bei - 20°C gelagert (nach Wessel und
Flügge, 1984).
Zur elektrophoretischen Auftrennung wurde das Proteinpellet in SDS-Probenpuffer
gelöst.
3.4.3.2 Ammoniumsulfat-Fällung (für Hybridomüberstände)
benötigte Lösungen (für 1000 ml Hybridomüberstand):
SAS: 380 g Ammoniumsulfat
500 ml H2O
(Erhitzen bis knapp unter Siedetemperatur,
über Nacht bei RT stehen lassen)
PBS: 24 g NaCl
0.6 g KCl
4.32 g Na2HPO4
0.72 g KH2PO4
mit HCl auf pH 7.4 einstellen
ad 3000 ml mit H2O
Zellen und Zelltrümmer wurden bei 11000 - 20000 g (4°C) abzentrifugiert. Zu 1000 ml
Überstand wurden portionsweise (über eine Stunde verteilt) unter langsamen Rühren
820 ml SAS zugeben und über Nacht bei 4°C langsam gerührt. Gefälltes Protein
wurde bei 11000 - 20000xg (4°C) abzentrifugiert und das Proteinpellet in 15 ml PBS
gelöst.
Das Ammoniumsulfat wurde durch Dialyse bei 4°C gegen PBS entfernt, wobei der
Puffer im Laufe von 48 h 4-5 mal gewechselt wurde (Andrew and Titus, 1991).
28

3.4.4 Isolierung von Proteinen über Antikörperbindung
3.4.4.1 Immunaffinitätschromatographie
Pufferzusammensetzungen: (pH-Werte bei 4°C einstellen)
Waschpuffer: 6.0 g (0.1 M) Tris/HCl pH 8.0
4.5 g (0.14 M) NaCl
2.5 ml (0.5 %) NP-40
50 ml (0.5 %) Na-Deoxycholat (5 %)
ad 500 ml mit aqua bidest.
Trispuffer (pH 8.0 / pH 9.0): 3 g (0.05 M) Tris/HCl pH 8.0 / pH 9.0
15 g (0.5 M) NaCl
0.5 ml (0.1 %) NP-40 (10 %)
ad 500 ml mit aqua bidest.
Material und Methoden
Elutionspuffer basisch: 0.67 ml (0.05 M) Triethanolamin (1.12 mg/ml) pH 11.5
0.9 g (0.15 M) NaCl
0.1 ml (0.1 %) NP-40 (10 %)
ad 100 ml mit aqua bidest.
Elutionspuffer sauer: 375 mg (0.05 M) Glycin/HCl pH 2.5
0.9 g (0.15 M) NaCl
0.1 ml (0.1 %) NP-40 (10 %)
ad 100 ml mit aqua bidest.
Neutralisationspuffer sauer: 60.5 g (1 M) Tris/HCl pH 6.7
ad 500 ml mit aqua bidest.
Neutralisationspuffer basisch: 18 g (1.5 M) Tris / HCl pH 8.8
ad 100 ml mit aqua bidest
TSA: 120 mg (2 mM) Tris/HCl pH 8.0
4.5 g (0.14 M) NaCl
0.1 % NaN3
ad 500 ml mit aqua bidest.
Nach der Lyse der Zellen und einer Zentrifugation bei mind. 12000 g, wurden die
Affinitätssäulen bei niedriger Flußrate (fünf Säulenvolumen/h) über eine Vorsäule
(Sepharose) mit Makrophagen- oder Thrombozytenlysat beladen. Nach dem
Auftragen des Lysats wurde die Vorsäule abgetrennt und die Säule mit je fünf
Säulenvolumen Waschpuffer, fünf Säulenvolumen Trispuffer (pH 8.0), und fünf
Säulenvolumen Trispuffer (pH 9.0) gespült. Die Elution des MAX.11 Antigens wurde
mit Triethanolamin in 1.6 ml - Fraktionen bei Vorlage von je 400 µl
Neutralisationspuffer (sauer) durchgeführt. Für MAX.3 erwies sich die Elution im
Sauren bei Vorlage von je 400 µl Neutralisationspuffer (basisch) als günstiger. Die
einzelnen Fraktionen wurden durch SDS-PAGE und anschließende Silberfärbung
analysiert.
Zur Regeneration wurden die Vorsäule und die Affinitätssäule mit je fünf
Säulenvolumen Waschpuffer, Elutionspuffer, 3M KCl-Lösung, Waschpuffer und TSA-
Lösung gespült. Die Lagerung der Säule erfolgte bei 4°C (Springer, 1991a).
29

3.4.4.2 Immunpräzipitation von Oberflächenantigenen
Material und Methoden
Nach der Markierung von zellulären Oberflächenantigenen wurden die Zellen, wie in
Kapitel 3.4.1.2 beschrieben, mit NP-40 lysiert. Der TBS-Lysepuffer enthielt dabei
zusätzlich 1% BSA. Alternativ wurden durch PI-PLC abspaltbare Oberflächenproteine
in PBS für die Präzipitationen verwendet.
Der Überstand nach dem Abzentrifugieren von Zelltrümmern (15000 g, 30´, 4°C)
wurde zur Entfernung von unspezifisch bindenden Proteinen mit 30 µl Protein G
Sepharose (v. Pharmacia) versetzt und über Nacht bei 4°C langsam rotiert
(Preclearing).
Der gereinigte Überstand wurde nach dem Entfernen der Protein-G-Sepharose (3000
Upm, 8 min, 4°C) mit dem entsprechenden monoklonalen Antikörper versetzt (Menge
hing vom Titer der mAb-Lsg. und von der Bindungskapazität der Sepharose - für m-
IgG: 6 µg/µl - ab, jeweils zwischen 10 und 500 µl). Nach 2 h langsamen Rotieren bei
4°C, wurden jeweils 30 µl Protein G Sepharose zugegeben und eine weitere Stunde
bei 4°C rotiert (Springer, 1991b).
Das Protein G-Pellet wurde fünfmal mit je 1 ml TBS-Waschpuffer gewaschen (3000
Upm, 8 min, 4°C), bei -20°C gelagert, mit verschiedenen Glykosidasen verdaut oder
für die SDS-PAGE mit 30 µl SDS-Probenpuffer und 5 µl H 2 O versetzt und 7 min auf
95°C erhitzt.
3.4.5 Chemische oder enzymatische Veränderungen an
Proteinen
3.4.5.1 Biotinylierung von Oberflächenproteinen
benötigte Reagenzien:
Biotin-Lösung (frisch): 3 mg NHSS-Biotin (Serva, Heidelberg)
ad 1ml mit PBS
Stop-Lösung (frisch): 54 mg (1 M) NH4Cl
ad 1ml mit PBS
Um die Nachweisgrenze zellulärer Oberflächenantigene bei Immunpräzipitationen
oder affinitätschromatografischen Auftrennungen zu erhöhen, wurden Oberflächenproteine
auf vitalen Zellen mit Biotin markiert. Hierzu wurden die Zellen geerntet und
dreimal mit PBS gewaschen. Auf je 1 ml Zellsuspension (0.5-1 x 10 7 Zellen/ml in PBS
oder 50 µl entsprechendes Thrombozytenpellet in 1 ml PBS) pro Reaktionsgefäß
wurden 50 µl Biotin-Lösung gegeben und die Suspension bei RT für 15 min langsam
rotiert. Durch die Zugabe von 10 µl Stop-Lösung wurde die Reaktion beendet und die
Zellen wurden einmal mit PBS + 10 µl Stoplösung und einmal mit PBS gewaschen
(Cole et al., 1987; Meier et al., 1992).
30

Material und Methoden
3.4.5.2 Abspaltung von Proteinen über Phosphoinosit-spezifische
Phospholipase C
1 x 10 8 Zellen/ml wurden in PBS suspendiert und nach der Zugabe von 0.2 units/ml
Phosphoinosit-spezifischer Phospholipase C (PI-PLC) für 1 h langsam rotierend bei
37°C inkubiert. Die Zellen wurden abzentrifugiert und der Überstand, der die
freigesetzten PI-PLC-spaltbaren Proteine enthielt, wurde bis zur weiteren
Verwendung bei 4°C gelagert.
3.4.5.3 Enzymatische Deglykosylierungen
Die im folgenden beschriebenen Deglykosylierungen wurden, wenn nicht anders
vermerkt, direkt an den Komplexen aus immunpräzipitierten Antigenen und Protein
G-Sepharose Beads durchgeführt.
3.4.5.3.1 Neuraminidase- und β-Galactosidase-Verdau
benötigte Puffer:
Neuraminidase-Puffer: 410 mg (50 mM) NaAc/HAc (pH 5,5)
60 mg (4 mM) CaCl2 • 2 H2O
ad 100 ml mit aqua bidest.
frisch zugeben: je 100 µg/ml BSA
Galactosidase-Puffer: 410 mg (50 mM) NaAc/HAc (pH 6,0)
ad 100 ml mit aqua bidest
Glucosaminidase-Puffer: 1.47 g (50 mM) Na-Citrat/H3PO4 pH 4.8
ad 100 ml mit aqua bidest
Das Protein G-Pellet wurde mit 1 ml entsprechendem-Puffer gewaschen, mit 150 µl
Puffer versetzt und nach der Zugabe von je 10 mU Neuraminidase, β-Galactosidase
oder N-Acetyl-β-D-glucosaminidase (Boehringer Mannheim) für ca. 2 h bei 37°C
inkubiert. Anschließend wurde der Ansatz auf Eis gestellt, das Sepharose-Pellet
abzentrifugiert und die Proteine über SDS-PAGE analysiert.
3.4.5.3.2 Freisetzung von N-Glykanen durch N-Glykosidase F
benötigte Puffer:
Waschpuffer: 700 µl NaH2PO4(0.2M)
300 µl (20 mM) Na2HPO4 (0.2M)
200 µl (10 mM) EDTA pH 8.0 (0.5 M)
ad 10 ml mit aqua bidest (ergibt pH 7.0)
Glykosidase-Puffer: 700 µl NaH2PO4(0.2M)
300 µl (20 mM) Na2HPO4 (0.2M)
200 µl (10 mM) EDTA pH 8.0 (0.5 M)
100 µl (1%) β-Mercaptoethanol
1 ml (1%) SDS (10%)
ad 10 ml mit aqua bidest (ergibt pH 7.0)
31

Material und Methoden
Die Protein G Sepharose-Beads wurden nach der Immunpräzipitation einmal mit
500 µl Waschpuffer gewaschen und nach der Zugabe von 50 µl Glykosidase-Puffer 5
min auf 95°C erhitzt. Der Überstand wurde abgenommen und das enthaltene SDS
mit 25 µl einer 20%igen Dodecylmaltosid-Lösung (entspricht einem 10-fachen
Überschuß) neutralisiert. Nach der Zugabe von 1 U (5 µl) N-Glykosidase F zu jedem
Ansatz (Boehringer Mannheim) wurde über Nacht bei 37°C inkubiert. Vor der
analytischen SDS-PAGE wurden die deglykosylierten Proteine mit Chloroform
extrahiert (nach Offringa und Bierer, 1993).
Proteine in Lösung wurden gegen den Waschpuffer dialysiert und nach Zusatz von
entsprechenden Mengen an β-Mercaptoethanol und SDS aufgekocht. Die weitere
Bearbeitung erfolgte wie bei den Überständen der Sepharose-Beads.
3.4.6 Elektrophoretische Auftrennung von Proteinen durch SDS-
PAGE
Benötigte Lösungen:
Acrylamid-Stammlösung : 146 g Acrylamid (MW 71.1)
AA (30 %) 4.0 g (%C = 2.67 %) BIS (MW 154.2)
(alternativ für Silbergele: PDA als Crosslinker:
5.0 g PDA (MW 194.2))
ad 500 ml mit aqua bidest
Untergelpuffer: 90.83 g (1,5 M) Tris / HCl pH 8.8
ad 500 ml mit aqua bidest
Obergelpuffer: 30 g (0.5 M) Tris / HCl pH 6.8
ad 500 ml mit aqua bidest
SDS-Stammlösung (10 %): 10 g (10 %) SDS
ad 100 ml mit aqua bidest
Trispuffer TP (1.25 M): 13 g (1.25 M) Tris / HCl pH 6.8
ad 100 ml mit aqua bidest
SDS-Probenpuffer PP (2x): 10 ml (20 %) Glycerin
5 ml (125 mM) TP (1.25 M)
2 g (4 %) SDS
5 ml (10 %) 2-Mercaptoethanol
10 mg (0.02 %) Bromphenolblau
ad 50 ml mit aqua bidest
Ammoniumpersulfat AP (10 %): 100 mg (10 %) Ammoniumpersulfat
ad 1 ml mit aqua bidest.
(frisch hergestellt)
Laemmli-Elektrodenpuffer (5x): 15 g (40 mM) Tris
216g (0.95 M) Glycin
15 g (0.5 %) SDS
ad 3000 ml mit aqua bidest
32

Material und Methoden
Gel-Stammlösungen Untergele Obergel
7.5 % 10 % 12 % 15 % 5 %
Obergelpuffer 25 ml
Untergelpuffer 25 ml 25 ml 25 ml 25 ml
SDS (10 %) 1.0 ml 1.0 ml 1.0 ml 1.0 ml 1.0 ml
AA (30 %) 25 ml 33 ml 40 ml 50 ml 16.65 ml
aqua bidest ad 100 ml
Tabelle 3-3 Zusammensetzung der Untergel- und Obergel-
Stammlösungen
Tabelle 3-4 Pipettierschema
für Unter- und
Obergel
Die Herstellung des Unter- (Trenn-) gels erfolgte bereits am Vortag der
Elektrophorese. Die benötigte Menge an Untergel-Stammlösung (5 ml für Multigel
bzw. 12 ml für Multigel-Long pro Gel) wurde vor der Zugabe der Polymerisations-
Initiatoren TEMED und Ammoniumpersulfat im Wasserstrahl-Vakuum entgast. Das
gegossene Gel wurde mit wenigen Tropfen wassergesättigtem Isobutanol
überschichtet. Nach der Polymerisation wurde das Gel überschichtet mit
Untergelpuffer (1:3 verdünnt) über Nacht bei 4°C auspolymerisiert.
Nach der Polymerisation des Obergels (nach ca. 30 min abgeschlossen) wurden die
fertigen Gele in die Elektrophoresekammer eingesetzt und der Elektrodenpuffer
(Laemmli -Puffer (5x) 1 : 5 verdünnt) zugegeben. Die Proben wurden mit SDS-PP
(2x) im Verhältnis 1 : 1 vermischt, 5 min auf 95°C erhitzt und aufgetragen. Die
Elektrophorese erfolgte bei 18 mA pro Gel bei der kleinen Kammer oder 25 mA pro
Gel bei der großen Kammer für 60 und 180 min (Shapiro et al., 1967, Laemmli et al.,
1970).
3.4.7 Western-Blotting (Semi-dry-Technik)
Verwendete Pufferlösungen:
Untergel Obergel
Stammlösung 10 ml 5 ml
TEMED 10 µl 5 µl
AP (10 %) frisch 50 µl 40 µl
Anodenpuffer A: 36.3 g (0.3 M) Tris pH 10.4
200 ml (20 %) Methanol
ad 1000 ml mit aqua bidest.
Anodenpuffer B: 3.03 g (25 mM) Tris pH 10.4
200 ml (20 %) Methanol
ad 1000 ml mit aqua bidest.
Kathodenpuffer C: 5.20 g (4 mM) ε-Amino-n-Capronsäure pH 7.6
200 ml (20 %) Methanol
ad 1000 ml mit aqua bidest.
33

Material und Methoden
Zur Immobilisierung von Proteinen aus SDS-Gelen wurden diese durch
ektrophoretischen Transfer im semi-dry-Verfahren (Towbin et al., 1979) auf
Membranen geblottet. Jeweils drei Filterpapiere (Whatman 3MM) wurden in die drei
Blotpuffer eingelegt, die Membran auf Gelgröße ausgeschnitten und benetzt (PVDF
Immobilon-P-Membran 0.45 µm, Millipore, erst in Methanol, dann in Blotpuffer B
geschwenkt; Nitrocellulose nur in Blotpuffer B) Das SDS-Gel wurde aus der
Elektrophoresekammer entnommen, das Obergel entfernt und kurz (10 - 20 s) in
Blotpuffer B geschwenkt. Der Zusammenbau des Blotsandwichs ist in Abbildung 3-1
dargestellt. Der Proteintransfer erfolgte bei 0.8 mA /cm 2 Gelfläche für die Dauer von 30 - 45
min (Towbin et al., 1979).
(-) Kathode (-)
drei Lagen Filterpapier in Puffer C
getränkt
SDS-Gel
Membran
drei Lagen Filterpapier in Puffer B
drei Lagen Filterpapier in Puffer A
(+) Anode (+)
Abbildung 3-1 Zusammenbau des Blots
3.4.8 Nachweis und Charakterisierung von Proteinen
3.4.8.1 Färbung von Proteinen in Gelen
3.4.8.1.1 Coomassiefärbung
benötigte Lösungen:
Entfärber/Fixierer: 800 ml (40 %) Methanol
200 ml (10 %) Essigsäure (97-98 %)
ad 2000 ml mit aqua bidest.
Färbelösung: 400 ml (40 %) Methanol
100 ml (10 %) Essigsäure (97-98 %)
1 g (0.1 %) Coomassie Brilliant Blue G 250
ad 1000 ml mit aqua bidest.
Die SDS-Gele wurden ohne Vorbehandlung in der fixierenden Färbelösung inkubiert.
Nach ca. 30 min wurde die Färbelösung abgesaugt und das blaugefärbte Gel 1-2 min
im Entfärber geschwenkt. Dieser Waschvorgang wird mehrere Male wiederholt und
das Gel über Nacht im Entfärberbad geschwenkt. Der Entfärber wurde nach
weitgehender Entfärbung des Gels durch Wasser ersetzt. Proteine waren als blaue
Banden auf hellem Hintergrund sichtbar.
34

Material und Methoden
Bei der Färbung von PVDF-Membranen verkürzte sich der Färbeschritt auf 1-2 min,
auch das Entfärben war nach deutlich kürzerer Zeit abgeschlossen.
3.4.8.1.2 Silberfärbung
benötigte Lösungen:
Fixierlösung A: 800 ml (40 %) Methanol
200 ml (10 %) Essigsäure (97-98 %)
ad 2000 ml mit aqua bidest.
Fixierlösung B: 200 ml (10 %) Ethanol
100 ml (5 %) Essigsäure (97-98 %)
ad 2000 ml mit aqua bidest.
Fixierlösung C: 200 ml (10 %) Ethanol
ad 2000 ml mit aqua bidest.
Silbernitrat-Lösung: 1 g (0.1 %) AgNO 3
ad 1000 ml mit aqua bidest.
Natriumcarbonat-Stammlösung: 150 g (15 %) Na 2 CO 3
ad 1000 ml mit aqua bidest.
Entwickler: 100 µl (0.1 %) Formalin-Lösung (37 %)
50 ml (3 %) Natriumcarbonat-Stammlösung
ad 250 ml mit aqua bidest
Stoppbad: 100 ml (5 %) Essigsäure (97-98 %)
ad 2000 ml mit aqua bidest.
Das SDS-Gel wurde unter leichtem Schwenken nacheinander 1 h in Fixierlösung A,
1/2 h in B, 1/2 h in C und anschließend dreimal je 10 min in Wasser inkubiert.
Anschließend wurde das Gel 1/2 h in Silbernitrat-Lösung geschwenkt. Nach kurzen
Waschen (ca. 10 s) mit Wasser wurden 50 ml frisch angesetzter Entwickler zugesetzt
und nach eingetretener Gelbfärbung wieder abgesaugt. Bei erneuter
Entwicklerzugabe wurden nach einiger Zeit (2-30 min) die Proteinbanden sichtbar.
Nach dem Erreichen der optimalen Intensität wurde der Entwickler durch das
Stopbad ersetzt.
35

3.4.8.2 Immunofärbung von Proteinblots
benötigte Lösungen:
TBS (2x) 9.7 g (40 mM) Tris/HCl pH 7.4
35.1 g (300 mM) NaCl
ad 2000 ml mit aqua bidest
Wasch-Lösung 1000 ml TBS (2x)
2 ml (0.1 %) Tween-20
ad 2000 ml mit aqua bidest
Material und Methoden
Blocking-Lösung: 5.0 g (5 %) Milchpulver
(weniger Background als bei BSA)
50 ml TBS (2x)
ad 100 ml mit aqua bidest
Antikörper: primärer Antikörper in Blocking-Lösung
Enzym-gekoppelter sekundärer Antikörper
in Blocking-Lösung
Substrate: Peroxidase (HRP): ECL (s.a. Kapitel 3.4.8.3)
Alkalische Phosphatase (AP): NBT/BCIP
Färbelösung: 200 µl Stammlösung (Boehringer Mannheim)
in 10 ml Färbepuffer: 0.1M Tris pH 9.5, 0.05 M MgCl2,
0.1 M NaCl)
Die Membranen wurden nach dem elektrophoretischen Transfer über Nacht bei 4 °C
in Blocking-Lösung inkubiert. Nach dem Absaugen der Blocking-Lösung wurde der in
Blocking-Lösung verdünnte (1:20 bis 1:5000, je nach Antikörper), primäre Antikörper
(z.B mIgG) auf die Membran gegeben und für 1 h bei RT geschwenkt. Dannach
wurde dreimal 10` in Wasch-Lösung gewaschen und eine weitere Stunde mit Enzymgekoppeltem
sekundärem Antikörper gegen den primären Antikörper (z.B. Goat anti
Mouse AP-gekoppelt) inkubiert. Nach drei Waschschritten (je 10` in Wasch-Lösung)
wurde der Blot je nach verwendetem Enzym gefärbt. Bei der Peroxidase wurde das
ECL-Färbeprotokol verwendet, bei der alkalischen Phosphatase wurde der Blot mit
NBT/BCIP nach dem Protokoll des Herstellers gefärbt.
3.4.8.3 ECL-Färbung von biotinylierten Proteinen
benötigte Lösungen:
TBS (2x) 9.7 g (40 mM) Tris/HCl pH 7.4
35.1 g (300 mM) NaCl
ad 2000 ml mit aqua bidest
Wasch-Lösung 1000 ml TBS (2x)
2 ml (0.1 %) Tween-20
ad 2000 ml mit aqua bidest
Blocking-Lösung: 5.0 g (5 %) BSA
50 ml TBS (2x)
ad 100 ml mit aqua bidest
36

Material und Methoden
Streptavidin-Peroxidase-Lösung: 25 µl (1:2000) Streptavidin-biotinylated horseradish
peroxidase complex (Amersham)
ad 50 ml mit Blocking-Lösung
Detection-Reagent 1 + 2 (Amersham)
Diese Färbung wurde in erster Linie zur Detektion von biotinmarkierten
Oberflächenantigenen auf Westernblots verwendet.
Die Membran wurde nach dem Blotten über Nacht bei 4°C in Blocking-Lösung
inkubiert. Nach dreimaligem Waschen mit Wasch-Lösung (je 10´ bei RT) wurde die
Membran mit der Streptavidin-Peroxidase-Lösung für 1 h geschwenkt und
anschließend nochmal gewaschen (dreimal je 10´ bei RT). Die Färbung erfolgte mit
dem ECL-Detektions-Kit der Firma Amersham nach dem Protokoll des Herstellers
und die Detektion wurde mit Autoradiographiefilmen durchgeführt.
3.4.8.4 Mikrosequenzanalyse
Über den monoklonalen Antikörper MAX.11 affinitätschromatographisch gereinigtes
Protein wurde durch N-Glykosidase F (NGF) deglykosyliert und anschließend
Chloroform-extrahiert. Über Affinitätschromatographie gereinigtes MAX.3-Antigen
wurde ohne Deglycosylierung Chloroform-extrahiert. In beiden Fällen wurden die
gefällten Proteine in reduzierendem Probenpuffer gelöst, der zusätzlich zu den in
Kapitel 3.4.5 aufgeführten Substanzen β-Mercaptoessigsäure (5%) enthielt. Die
reduzierten Proben wurden durch SDS-PAGE aufgetrennt, auf PVDF-Membran
geblottet und mit Coomassie Blue gefärbt. Spezifische Banden wurden
ausgeschnitten und die NH2-terminale Sequenz von R. Deutzmann (Lehrstuhl für
Biochemie I, Universität Regensburg) auf einem Protein-Sequenziergerät (Applied
Biosystems Modell 477A) mit angeschlossenem PTH-Analyser (Modell 120A)
bestimmt.
3.4.9 Enzymassay für Carboxypeptidase M
benötigte Reagenzien:
HEPES-Puffer: 4.76 g (0.2 M) HEPES/NaOH pH 7.5
2 ml (0.2%) NP-40 (10 %)
ad 100 ml mit aqua bidest
Stoplösung: 21.0 g (1 M) Zitronensäure x H2O/NaOH pH 3.2
ad 100 ml mit aqua bidest
Substrat: 4.64 mg (1 mM) Dansyl-Ala-Arg
ad 10 ml mit aqua bidest (in 1 ml Portionen bei -20°C)
Inhibitor: 0.237 mg (100 µM) MGTA
ad 10 ml mit entgastem Wasser
Standards: 0, 0.5, 1, 2, 5, 10 und 20 nmol Dansyl-Ala pro 50 µl
8.4 mg (100 nmol / 50 µl) als Stammlsg.
(in 1 ml Portionen bei -20°C lagern)
37

Kontrolle
(ohne
alles)
Tabelle 3-5 Pipettierschema der Reaktionsansätze
Material und Methoden
Die Reaktionsansätze (zweifach) wurden in Glasröhrchen (10 x 100 mm) nach dem
in Tabelle 3-5 angegebenen Schema zusammenpipettiert. Je nach zu erwartender
Aktivität wurden die Ansätze (außer Standards - auf Eis, im Dunkeln!) für 1 - 5 h bei
37°C inkubiert (im Dunkeln!). Die Reaktion wurde durch Zugabe von 150 µl
Stoplösung abgebrochen (auch zu den Standards zugegeben).
Jeweils 1 ml Chloroform wurde in jedes Röhrchen geben und ca. 15 s geschüttelt um
das Reaktionsprodukts Dansyl-Ala zu extrahieren. Die Ansätze und Standards
wurden 5` bei 1000g zentrifugiert (Phasentrennung) und die Fluoreszenz der
Chloroformphase (direkt mit den Glasröhrchen) bei 340 nm Anregung und 495 nm
Emission gemessen. Die Carboxypeptidase-Aktivität ist als Differenz der Fluoreszenz
der nicht inhibierten und der mit MGTA inhibierten Probe definiert. Die FU
(Fluoreszenzeinheiten) konnten mit Hilfe einer Standardkurve des Produkts Dansyl-
Ala in nmol umgesetztes Substrat umgerechnet werden. Zur Berechnung der
spezifischen Aktivität (nmol/mg/h) benötigte man die Gesamtproteinkonzentration der
Membranpreparation, die jeweils parallel bestimmt wurde (Skidgel, 1991).
3.5 Molekularbiologische Methoden
Mehrfach verwendete Reagenzien:
Kontrolle
(ohne
Enzym)
Probe
mit
Inhibitor
LB-Medium: 10 g NaCl
10 g Bactotryptone
5 g Hefeextrakt
ad 1000 ml mit aqua bidest - autoklaviert
Probe Standards
Hepes-Puffer 125 µl
Membranprep.
(Enzym)
- - 50 µl 50 µl -
Substat - 50 µl 50 µl 50 µl -
Standards - - - - je 50 µl
Inhibitor 25 µl 25 µl 25 µl - 25 µl
H2O 100 µl 50 µl - 25 µl 50 µl
insgesamt 250 µl
LBtetra-Platten: 1.5 g Agar
(∅ = 90 mm) ad 100 ml mit LB-Medium, aufkochen,
nachdem Agar gelöst, auf 60°C abkühlen lassen
38

25 µg/ml Tetracyclin (dunkel lagern!)
zugeben und gießen
SM-Puffer: 50 ml (20 mM) Tris/HCl pH 7.5 (1M)
5.8 g (100 mM) NaCl
2.0 g (8 mM) MgSO4 x 7 H2O
5 ml (0.01%) Gelatine 2% (w/v)
ad 1000 ml mit aqua bidest - autoklaviert
SSC (20x) 88 g (0.3 M) Na3Citrat x 2H2O / HCl pH 7.0
175 g (3 M) NaCl
ad 1 l mit aqua bidest- autoklaviert
3.5.1 Kultivierung von Bakterien
Material und Methoden
Die jeweils benötigten Bakterienstämme wurden in LB-Medium (mit 100 µg/ml
Ampicillin falls Resistenz vorhanden) durch Schütteln bei 37°C kultiviert. Zur
Herstellung von Tiefkühlkulturen wurden 600 µl einer 1:1-Mischung aus Glycerin und
LB-Medium mit 600 µl Bakteriensuspension gemischt und bei -80°C eingefroren.
3.5.2 Plasmidvektoren
3.5.2.1 Plasmid MiniPrep (alkalische Lyse)
benötigte Reagenzien:
Sol.I (vor Gebrauch (50 mM) Glucose
auf Eis !) (10 mM) EDTA
(25 mM) Tris/HCl pH 8.0
Sol.II (frisch) (200 mM) NaOH
(1 %) SDS
Sol.III 60 ml (3 M) KOAc 5M
11.5 ml Eisessig
ad 100 ml mit aqua bidest
RNase-Lsg. 10 mg/ml Rnase A
Phenol/Chloroform: 24 ml Phenol pH 7.0
23 ml Chloroform
1 ml Isoamylalkohol
Von einer 5 ml ü.N.-Kultur wurden 2-4 ml in einem 2 ml Röhrchen abzenrifugiert
(3000g, 2 min, RT) und der Überstand abpipettiert. Das Bakterienpellet wurde in 100
µl eiskalter Sol.I resuspendiert und 5 min auf Eis gestellt. Nach der Zugabe von 200
µl der frischen Sol.II wurde das Röhrchen zum Mischen mehrmals gekippt (nicht
geschüttelt) und für höchstens 5 min auf Eis gestellt. Anschließend wurden 150 µl
der eiskalten Sol.III zugegeben, das Röhrchen zum Mischen wieder mehrmals
gekippt und für 5 min auf Eis gestellt. Nach einer kurzen Zentrifugation (5 min,
39

Material und Methoden
12000g, 4°C) wurde der Überstand in neues Röhrchen transferiert, 20 µl RNase-
Lösung zugegeben und der Ansatz 30 min bei 37°C inkubiert.
Zur Extraktion wurde mit gleichem Volumen Phenol/Cloroform (450 µl) aufgefüllt,
geschüttelt, zentrifugiert (2 min, 12000g), der Überstand abgenommen und nochmal
mit gleichem Volumen (450 µl) Chloroform extrahiert. Durch Zugabe von 50 µl einer
3M NaAcetat-Lösung zwei Volumen Ethanol (1000 µl) wurde die Plasmid-DNA
gefällt. Nach dem Abzentrifugieren (20 min, 12000g, RT) wurde das DNA-Pellet
einmal mit 70%igem Ethanol gewaschen, getrocknet und in 30 µl H2O aufgenommen
(Sambrook et al., 1989).
Alternativ zu dieser Methode wurden Plasmide mit Qiagen-Säulen (Qiagen, Hilden)
nach der Vorschrift des Herstellers präpariert.
3.5.2.2 Präparation von kompetenten E.Coli
benötigte Reagenzien:
FSB (4°C): 10 ml (10 mM) Kaliumacetat 1M pH 7.5
8.91 g (45 mM) MnCl2 x 4H2O
1.47 g (10 mM) CaCl2 x 2H2O
7.46 g (100 mM) KCl
0.72 g (3 mM) CoCl2 x 6H2O
100 ml (10 %) Glycerol
ad 1000 ml mit aqua bidest, pH 6.4 mit 0.1 N HCl
XL1-blue Bakterien wurden in 100 ml LB-Medium auf eine Dichte von 0.5 OD600nm
hochgezogen, in vier 50 ml Röhrchen umgefüllt und abzentrifugiert (4000 rpm, 10`,
4°C). Das Medium wurde gründlich abgenommen (Röhrchen einige Zeit umgedreht
stehen lassen), die Bakterien in je 20 ml FSB (eisgekühlt) resuspendiert, 10` auf Eis
gestellt und wieder abzentrifugiert. Der Überstand wurde wieder möglichst vollständig
entfernt und die Zellen in je 4 ml FSB resuspendiert. Nach der Zugabe von 140 µl
DMSO auf je 4 ml resuspendierte Zellen, wurden die Bakterien durch vorsichtiges
Schwenken der Röhrchen resuspendiert und 15`auf Eis gestellt.
Weitere 140 µl DMSO pro Röhrchen wurden zugegeben, die Röhrchen geschwenkt,
die Bakterien sofort in kleinere Röhrchen umgefüllt und möglichst schnell in flüssigem
Stickstoff eingefroren. Die Lagerung der kompetenten Zellen erfolgte bei
-70°C (Sambrook et al., 1989).
40

3.5.2.3 Transformation von E.Coli
Reagenzien:
SOC-Medium: 20 g Bactotryptone
5 g Yeast Extract
0.6 g NaCl
0.2 g KCl
ad 1000 ml mit aqua bidest., autoklavieren
nach dem Abkühlen:
10 ml MgCl2 (1M), sterilfiltriert
10 ml MgSO4 (1M), sterilfiltriert
10 ml Glucose (2M), sterilfiltriert
Material und Methoden
100 µl kompetente Bakterien wurden zur Plasmid-DNA (0.1 - 1 µg in 10 µl) pipettiert,
gemischt und für 20´auf Eis gestellt. Im Wasserbad wurden die Bakterien für 60 s auf
42°C erhitzt und sofort wieder für 2´auf Eis gesetzt. Nach der Zugabe von 0.9 ml
SOC-Medium wurden die Bakterien bei 37°C für 1h geschüttelt. 0.1 ml der
Bakteriensuspension wurden auf geeignete Agar-Platten ausgestrichen und ü. N. bei
37°C inkubiert (Sambrook et al., 1989).
Es wurden mehrere der hochgewachsenen Kolonien gepickt und nach ü.N.-Kultur
Minipreps hergestellt. Die korrekte Transformation wurde durch Sequenzierung
kontrolliert, Tiefkühlkulturen wurden angelegt.
3.5.3 Präparation, Enzymatische Manipulationen, Analyse und
Sequenzierung von DNA
3.5.3.1 Gelelektrophoresen
3.5.3.1.1 Agarose-Gel für DNA
benötigte Lösungen:
TAE (50x) 242.3 g (2M) Tris
20.5 g (250mM) NaAc/HAc pH 7.8
18.5 g (50 mM) EDTA
ad 1000 ml mit aqua bidest
Ladepuffer DNA (5x) 500 µl (50mM) Tris/HCl pH 7.8
500 µl (1 %) SDS (20 %)
1 ml (50 mM) EDTA (0.5 M) pH 8.0
4 ml (40 %) Glycerin
0.1 % Bromphenolblau
ad 10 ml mit aqua bidest
41

1.0 % 1.2 %
H 2 O 30 ml 50 ml 150 ml 50 ml
Agarose 0.3 g 0.5 g 1.5 g 0.6 g
TAE (50x) 0.6 ml 1 ml 3 ml 1 ml
Ethidiumbromid 1.5 µl 2.5 µl 7.5 µl 2.5 µl
Material und Methoden
Tabelle 3-6 Zusammensetzung
verschiedener Agarose-Gele
Die Agarose wurde in Wasser aufgekocht, auf ca. 60°C abgekühlt, TAE (50x) und
Ethidiumbromid zugeben und das Gel gegossen. Als Laufpuffer wurde 1 x TAE-
Puffer verwendet. Vier Teile DNA-Probe wurden mit einem Teil DNA-Ladepuffer
versetzt und aufgetragen. Der Lauf erfolgte ohne Kühlung bei 40-50 V für 3-4 h oder
mit Kühlung bei 80-100 V für 1-2 h.
3.5.3.1.2 alkalisches Agarosegel für einzelsträngige DNA
benötigte Lösungen:
Stammlösung NaOH (10M): 20 g (10M) NaOH
ad 50 ml mit aqua bidest
Stammlösung EDTA (0.5M): 18.6 g (0.5M) EDTA /NaOH pH 8.0
ad 100 ml mit aqua bidest
Ladepuffer (5x): (250mM) NaOH
(5mM) EDTA
(18%) Ficoll
(0.15%) Bromkresolgrün
Laufpuffer: 2 ml (50mM) NaOH-Stammlsg.
800 µl (1mM) EDTA-Stammlsg.
ad 400 ml mit aqua bidest
500 mg Agarose (1%) wurden in 50 ml H2O aufkochen, auf ca. 60°C abgekühlt und
250 µl NaOH-Stammlsg. (50mM) und 100 µl EDTA-Stammlsg. zupipettiert. Das Gel
wurde gegossen, die Proben 4:1 mit Ladepuffer versehen auftragen und (ohne
Kühlung) höchstens bei 20-25 V laufen lassen. Bei radioaktiven Proben wurde das
Gel einige Stunden gepresst und anschließend autoradiographiert (Sambrook et al.,
1989).
3.5.3.2 Präparation von DNA Fragmenten
Reagenzien:
NET-Puffer: 242 mg (20 mM) Tris/HCl pH 8.0
880 mg (0.15 M) NaCl
20 µl (0.1 mM) EDTA (0.5 M) pH 8.0
ad 100 ml mit aqua bidest
42

HNET-Puffer: 242 mg (20 mM) Tris/HCl pH 8.0
5.85 g (1.0 M) NaCl
20 µl (0.1 mM) EDTA (0.5 M) pH 8.0
ad 100 ml mit aqua bidest
Material und Methoden
DEAE-Membranen: 10´ in 10 mM EDTA, 5´in 0.5 M NaOH und anschließend
mehrere Male mit Wasser waschen.
DNA-Fragmente nach Restriktionsverdau oder PCR-Amplifikation wurden auf einem
Agarosegel aufgetrennt. Kurz unterhalb des gewünschten Fragmentes wurde ein
Block aus dem Gel ausgeschnitten, die DEAE-Membran unterhalb der Bande
platziert, der Gel-Block wieder eingesetzt und das Fragment auf die Membran laufen
lassen. Der Filter wurde entnommen und unter UV-Licht auf eine minimale
Filtergröße zurechtgeschnitten. Die Membran wurde einmal mit NET-Puffer
gewaschen und die DNA-Fragmente durch zweimalig Inkubation mit je 100 µl HNET-
Puffer für 15´ bei 65°C eluiert. Nach der Vereinigung der Fraktionen wurde das
Ethidiumbromid durch Extraktion mit 600 µl Butanol (H2O-gesättigt) entfernt. Die
wässrige Phase wurde abgenommen und mit 2½-facher Menge Ethanol bei -20°C
gefällt. Das DNA-Pellet wurde nach dem Waschen mit 70%igem Ethanol in H2O
gelöst und bei -20°C gelagert.
Alternativ zu dieser Methode wurden DNA-Fragmente mit Qiaex-Beads (Qiagen,
Hilden) nach der Vorschrift des Herstellers extrahiert.
3.5.3.3 Klonierung von DNA-Fragmenten
Isolierte und durch Restriktionsverdau gewonnene DNA-Fragmente wurden über die
Restriktionschnittstellen in entsprechend geschnittene und anschließend
dephosphorylierte Plasmide ligiert. Die Ligationen erfolgten jeweils bei 16°C über
Nacht. DNA-Fragmente aus PCR-Amplifikationen wurden über den von der Taq-
Polymerase erzeugten 3´-A-Überhang in den pCR TM II-Vektor (Invitrogen, San Jose,
USA) ligiert und nach der Vorschrift des Herstellers in INVαF´-Zellen transformiert.
3.5.3.4 Kontrollierte, stufenweise Verkürzung von
Plasmidkonstrukten ("Nested Deletion")
Zur Verkürzung von Plasmid-Inserts wurde die Methode der "nested deletion"
(Pharmacia, Freiburg) angewendet. Plasmid-DNA wurde vor der einklonierten
Sequenz durch zwei Restriktionsenzyme derart gespalten, daß in Richtung des
Vektors ein 5´-Überhang und in Richtung des zu verkürzenden cDNA-Inserts ein 3´-
Überhang entstand. Die geschnitte DNA wurde dann (nach der Vorschrift des
Herstellers) mit einer 3´-Exonuklease (exo III) verdaut. Während des Verdaus wurden
alle 1 - 3 min Aliquots aus dem Verdau entfernt und anschließend mit S1-Nuklease
behandelt. Dieser Schritt entfernt entstandene Einzelstrang-Regionen. Die Länge der
43

Material und Methoden
erzeugten Deletionen wurde über ein Agarosegel bestimmt, die linearen Plasmide
gewünschter Länge re-ligiert und in XL1-blue transformiert (nach Henikoff, 1984).
Für jede Länge wurden von mehreren Kolonien der Transformation MiniPreps
hergestellt und die gewünschten Deletionssubklone ausgewählt.
3.5.3.5 Sequenzierung von Plasmid DNA und computergestützte
Sequenzanalysen
Sequenzierungen wurden nach der "dye deoxy terminator cycle sequencing" -
Methode (Applied Biosystems, Weiterstadt) nach der Vorschrift des Herstellers
durchgeführt. Die Analyse der Sequenzen erfolgte mit dem Applied Biosystems DNA
Sequencing System (Model 373A).
Sequenzvergleiche mit verschiedenen Datenbanken (EMBL, GenBank, PIR,
SwissProt) wurden über das Programm FASTA (Pearson and Lipman, 1988)
durchgeführt (HUSAR, Heidelberg).
3.5.3.6 Markierung von cDNA-Fragmenten und Oligonukleotiden
cDNA-Fragmente, die zur Hybridisierung in Northern-Analysen oder Plaque
Screenings bestimmt waren, wurden über Komplementärstrangsynthese durch
Klenow-Enzym und Hexamerprimern mit [α- 32 P] dCTP markiert (Random Primed
DNA Labeling Kit, Boehringer Mannheim). Oligonukleotide wurden am 5´-Ende über
eine Kinasereaktion durch T4-Kinase mit [γ- 32 P] ATP markiert. Freie Nukleotide
wurde durch Chromatographie über eine Sephadex G-50 Säule abgetrennt und die
eingebaute Radioaktivität im β-Counter (TRI-CARB 1600 TR, Canberra-Packard,
Frankfurt) vermessen.
3.5.4 Präparation und Analyse von RNA
3.5.4.1 RNA Extraktion mit Guanidin-Phenol-Chloroform
benötigte Reagenzien:
Solution D: 47.2 g (4 M) Guanidinthiocyanat
2.5 ml (25 mM) NaCitrat 1M pH 7.0
1.67 ml (0.5 %) Sarcosyl
ad 100 ml mit H2ODEPC
NaAcetat (2 M) 16.4 g (2 M) NaAcetat (wasserfrei)
ad 50 ml mit H2ODEPC
auf pH 4.0 mit Essigsäure (ca. 40 ml)
ad 100 ml mit H2ODEPC
44

Material und Methoden
Phenolwassergesättigt,ungepuffert frisches Phenol im Wasserbad schmelzen
0.1% 8-Hydroxychinolin
zweimal 20% H2ODEPC zugeben und schütteln,
ü.N absetzen lassen
(Phenol sollte zu ¼ mit H2ODEPC überschichtet sein)
Chloroform-Isoamylalkohol: 2 ml Isoamylalkohol
(49:1) ad 100 ml mit Chloroform
Isopropanol bei 4°C lagern
Ethanol (80%) 40 ml (80 %) Ethanol
ad 100 ml mit H2ODEPC (bei 4°C)
Polypropylen-Röhrchen Chloroform/Phenol-beständig
Solution D wurde frisch mit 7 µl/ml Merkaptoethanol versetzt. Bei adhärenten Zellen
wurde das Medium abgegossen und Solution D auf die Zellen gegeben (2 ml pro
Schale (∅ 150mm)). Das Lysat wurde mit einem Zellschaber abgekratzt, mit einer
Spritze (0.9 x 40 mm) in ein steriles 14 ml Röhrchen überführt und 10x durch die
Spritze gedrückt. Nach dem Ansäuern des Lysats mit NaAcetat (2 M) (0.1 ml pro 1
ml Lysat) wurde es sofort weiterverarbeitet oder bei -20°C gelagert. Nichtadhärente
Zellen wurden abzentrifugiert, direkt mit entsprechender Menge Sol.D versetzt und
sofort durch die Spritze gedrückt.
Auf 1 ml Lysat wurde die gleiche Menge Phenol und 0.2 ml Chloroform-
Isoamylalkohol pipettiert und gut geschüttelt. (Es sollte sich eine milchige Suspension
bilden, eventuell mußte noch Chloroform zugegeben werden). Die Suspension wurde
15´ auf Eis gestellt, zentrifugiert (20´, 10000g, 4°C) und die obere wässrige Phase
ohne Interphase abgenommen.
Der Überstand wurde mit gleichem Volumen Isopropanol aufgefüllt, kräftig
geschüttelt und bei -20°C gefällt (mind. 1h, besser ü.N.). Nach dem Zentrifugieren
(20´, 10000g, 4°C) wurde der Überstand vorsichtig abgeschüttet und Restflüssigkeit
aus dem Röhrchen ablaufen lassen. Das Pellet wurde erneut in Sol.D (0.3 ml pro 1
ml Lysat) gelöst und in 1.5 ml-Röhrchen (RNAse-frei) überführt.
Das gelöste RNA-Pellet wurde nochmal mit gleichem Volumen Isopropanol aufgefüllt,
kräftig geschüttelt und bei -20°C gefällt (mind. 1h, besser ü.N.). Nach dem
Zentrifugieren (20´, 10000g, 4°C), wurde der Überstand abgenommen und das Pellet
zweimal mit eiskaltem Ethanol (80%) gewaschen.
Die Lagerung erfolgte in Ethanol (100%) bei -80°C oder gelöst in H2ODEPC bei -20°C
(Chomczynski and Sacchi, 1987)
Die RNA-Menge wurde über ein Probegel abgeschätzt, oder im Photometer bestimmt
(OD260 von 1.0 entspricht ca. 40 µg /ml RNA, das Verhältnis OD260:OD280 sollte
zwischen 1.8 und 2.0 liegen).
45

3.5.4.2 DNA-Verdau in RNA-Präperationen
benötigte Reagenzien:
DNAse I
RNAse Inhibitor
DNAse-Puffer 1 ml (10 mM) Tris/HCl pH 8,4 (1 M)
375 mg (50 mM) KCl
150 µl (1,5 mM) MgCl2 (1M)
ad 100 ml mit H2ODEPC, autoklavieren
Phenol (ungepuffert)
Chloroform
3 M Natriumacetat
Der Ansatz wurde nach folgendem Schema pipettiert:
x µl RNA in H2ODEPC (1-10 µl)
1 µl DNAse I (10 U)
0,25 µl RNAse Inhibitor (10 U)
100-x µl H2ODEPC
Material und Methoden
Der Verdau erfolgte 30´ bei 37°C, anschließend wurde der Ansatz auf Eis gestellt.
Die RNA wurde mit 100 µl Phenol/Chloroform (3:1) extrahiert und zur
Phasentrennung kurz zentrifugiert. Die wässrige Phase wurde nochmal mit 50 µl
Chloroform extrahiert, mit 10 µl 3M NaAcetat versetzt und die RNA mit 275 µl
Ethanol über Nacht bei -20°C gefällt.
3.5.4.3 Isolation vom poly(A)-RNA
benötigte Lösungen:
Bindungspuffer (6x): (60 mM) Tris / HCl pH 7.5
(3 M) NaCl
(6 mM) EDTA
Waschpuffer: (10 mM) Tris / HCl pH 7.5
(150 mM) NaCl
(1 mM) EDTA
Elutionspuffer: (5 mM) Tris / HCl pH 7.5
Natronlauge (0.1 M) NaOH
10 mg Oligo-d(T)-Cellulose wurden zum Quellen mit 100 µl Natronlauge versetzt und
gut geschüttelt. Nach einer Quellzeit von ca. 10 min wurde zweimal mit H2ODEPC und
einmal mit Waschpuffer gewaschen und der Überstand möglichst vollständig
abgenommen.
46

Material und Methoden
100 - 150 µg getrocknete RNA wurden in 360 µl H2ODEPC gelöst, mit 75 µl
Bindungspuffer versetzt und die Lösung auf die Oligo-d(T)-Cellulose gegeben. Der
Ansatz wurde 3 min auf 65°C erhitzt und anschließend 15 min bei RT rotiert. Die
Suspension wurde in ein 1.5 ml Spin-Röhrchen überführt, abzentrifugiert und die
Cellulose dreimal mit 450 µl Waschpuffer gewaschen. Der Elutionspuffer wurde auf
70°C erhitzt, je zweimal 20 - 100 µl des heißen Elutionspuffers wurden mit der
Cellulose verrührt und in einem frischen Röhrchen abzentrifugiert. Die mRNA wurde
in Elutionspuffer bei -20°C oder - 80°C gelagert.
Alternativ zu dieser Methode wurde poly(A)-RNA aus Gesamt-RNA mit Oligotex-
Beads (Qiagen, Hilden) nach der Vorschrift des Herstellers präpariert.
3.5.4.4 1% Agarose-Gel für RNA
benötigte Lösungen:
MOPS (20x) 42 g (0.4 M) MOPS/NaOH pH 7.0
4.1 g (100 mM) NaAc
3.7 g (20 mM) EDTA
ad 500 ml mit H2ODEPC, dunkel lagern!
Ladepuffer RNA 10 ml (50 %) Formamid deionisiert
3.5 ml (2.2 M) Formalin (37%)
1 ml MOPS (20x)
0.8 ml (0.04 %) Bromphenolblau 1% in H2O
0.2 g (1%) Ficoll (in 2 ml H2O gelöst)
ad 20 ml mit, in 1 ml Portionen bei -20°C lagern
5 µl/ml Ethidiumbromid vor Gebrauch zugeben
Agarose 0.3 g 0.5 g 1.5 g 2.5 g
H2ODEPC 22.8 ml 38 ml 115 ml 190 ml
MOPS (20x) 1.5 ml 2.5 ml 7.5 ml 12.5 ml
Nach Abkühlen auf 60°C
Formaldehyd 5.3 ml 8.8 ml 26.5 ml 44 ml
insgesamt 30 ml 50 ml 150 ml 250 ml
Tabelle 3-7
Zusammensetzung der
RNA-Agarose-Gele
Die Agarose wurde im MOPS/H2ODEPC aufgekocht, auf ca 60°C abgekühlt, das
Formaldehyd unter Rühren zugegeben und gegossen. Die RNA Proben wurden
zusammen mit Ladepuffer (1 Teil RNA Probe in H2ODEPC + 4 Teile RNA-Ladepuffer)
20´ bei 65°C inkubiert, auf Eis gestellt, kurz abzentrifugiert und in die mit Laufpuffer
(1x MOPS) überschichteten Probentaschen gefüllt. Bei Probegelen wurde die
Elektrophorese bei 40 V für 4-6 h, bei Gelen für Northern-Blots ü.Nacht bei 13 - 15 V
durchgeführt.
47

3.5.4.5 Northern-Blotting - RNA-Transfer
Material und Methoden
Die Nylonmembran (Magna NT, MSI) wurde auf die Größe des Gels
zurechtgeschnitten, kurz mit aqua bidest benetzen, dann für ca. 10´ in SSC (20x)
geschwenkt.
Das Gel wurde mit der Unterseite nach oben luftblasenfrei auf die ins SSC (20x)
eingetauchten und mit SSC (20x) getränkten Filterpapiere gelegt. Die Membran
wurde luftblasenfrei aufgelegt und an den Rändern mit Kunststoffstreifen abgedichtet
(SSC darf nicht neben dem Gel nach oben gesaugt werden!). Nach zwei Lagen
Whatmanpapier (mit SSC (20x) getränkt und luftblasenfrei aufgelegt) wurde ein ca.
10 cm hoher Stapel Zellstoff aufgelegt und der Blot beschwert (Sambrook et al.,
1989).
Die Vollständigkeit des Transfers wurde unter UV-Licht kontrolliert, der Blot
photographiert, getrocknet und 3 h bei 80°C gebacken oder UV crossgelinkt.
3 Lagen Whatman-
Papier in SSC getr nkt
Abgrenzung
Abbildung 3-2 Zusammenbau des Kappilarblots.
3.5.4.6 Hybridisierung von Northern Blots
benötigte Reagenzien:
Gewicht
mehrere Lagen
Zellstoff
RNA-Gel
20x SSC
Hybridisierungslösung: 25 ml (0.5 M) NaPhosphat pH 7.2 (1 M)
(Church-buffer) 17.5 ml (7%) SDS 20%
400 µl (0.2 mg/ml) tRNA (25 mg/ml)
[500 µl (0.1 mg/ml) Herinssperma-DNA (10 mg/ml)]
(beide vorher denaturieren)
ad 50 ml mit aqua bidest
Waschlösung 2.5 ml (0.1x) SSC (20x)
25 ml (1%) SDS (20%)
ad 500 ml mit aqua bidest
Membran
2 Lagen Whatman-
Papier in SSC getränkt
48

Material und Methoden
Die Hybridisierungen wurden alternativ in drei verschiedenen Gefäßen durchgeführt:
a. Schalen (Nachteil: Viel Hybridisierungsflüssigkeit benötigt)
b. Plastikbeutel (Nachteil: Handhabung, Kontaminationsgefahr)
c. Röhren (prinzipiell sicherste Methode, manchmal mehr Hintergrund als im Beutel)
Die Filter wurden 2 h bei 65°C in der Waschlösung gewaschen. Die
Prähybridisierung erfolgte im Church-buffer für 1-4 h bei der entsprechenden
Hybridisierungstemperatur (für cDNAs: 65°C, für Oligos kälter, z.B 18S-Oligo bei
57°C). Die markierte Probe (10 7 cpm/ml) wurde zugeben und über Nacht hybridisiert.
Nach dem Abgießen der Hybridisierungslösung, wurden die Filter mit Waschlösung
abgespült und zweimal je 30´ bei 52°C in der Waschlösung geschwenkt. Die Filter
wurden gemessen und bei zu starker Strahlung nochmal bei höherer Temperatur (bis
65°C) gewaschen (Church and Gilbert, 1984; Krause et al., 1992).
Zur Autoradiographie wurden die Filter in feuchtem Zustand in Frischhaltefolie
einwickelt, in der Röntgenkassete fixiert und bei -80°C exponiert (für 32 P-markierte
Proben ü.N. bis zu 14 Tagen).
3.5.4.7 Primer Extension
Reaktionsmix:
6 µl Erststrang-Puffer (5x)
10 µl (2-10 x 10 5 cpm) Primer (30mer), endmarkiert
3 µl (250µM pro dNTP) dNTP (10mM)
3 µl (10 mM) DTT (0.1 M)
1 µl (36 U) RNase Inhibitor (Pharmacia)
6 µl (5-50 µg) Gesamt-RNA
Der Antisense-Primer (30mer) wurde 5´-endmarkiert und nicht eingebaute Nukleotide
durch Ausschlußchromatographie abgetrennt. Der Reaktionsansatz wurde auf Eis
pipettiert, für 3 min auf 95°C erhitzt und bei 56°C für 20 min hybridisiert. Der Ansatz
wurde kurz zentrifugiert und nach der Zugabe von 1 µl (200 U) Superscript II (RNase
H-freie Reverse Transkriptase) 1h bei 48°C in einem Brutschrank inkubiert. Die
Erststrang-Synthese wurde duch Zugabe von 1 µl EDTA (0.5 M) abgebrochen und
RNA nach Zugabe von 1 µl RNaseA (10µg/ml) für 1 h bei 37°C verdaut (Sambrook et
al., 1989).
Zum Ansatz wurden 100 µl Ammoniumacetat-Lösung (2.5 M) zugegeben und mit 120
µl Phenol-Chloroform extrahiert. Die DNA in der wässrigen Phase wurde mit
300 µl Ethanol gefällt, nach dem Waschen mit 70%igem Ethanol getrocknet, und
neben einer bekannten Sequenzreaktion auf einem 6%igen Sequenziergel analysiert.
49

Material und Methoden
3.5.5 Phagenscreening zur Klonierung von cDNA Sequenzen
3.5.5.1 Infektion mit Lambda ZAP II und Plattieren der Bakterien
benötigte Reagenzien:
MgSO4 (1M) 246.5 g (1M) MgSO4 x 7 H2O
ad 100 ml mit aqua bidest - autoklaviert
Maltose (10%) 5 g (10 %) Maltose
ad 50 ml mit sterilem aqua bidest - sterilfiltriert
Maltose-LB: 0.5 ml (10 mM) MgSO4 (1 M)
250 µl (0.2 %) Maltose (10%)
ad 50 ml mit LB-Medium
Top-Agarose: 0.7 g (0.7 %) Agarose
ad 100 ml mit LB-Medium, aufkochen
Am Vortag wurden XL1-blue aus der Tiefkühlkultur auf einer LBtetra-Platte
ausgestrichen und ü.N. bei 37°C im Brutraum inkubiert. Eine XL1-blue-Kolonie wurde
in 50 ml Maltose-LB angeimpft und möglichst bei 30°C (bzw 37°C) ü.N. unter
Schütteln inkubiert (Maltose-Induktion). Wenn die Bakterien am nächsten Tag
überwachsen waren, wurde einen Teil der Bakterien (OD600=0.5) nochmal für zwei
Stunden mit frischem Maltose-LB inkubiert. Am nächsten Tag wurden große LB-
Platten (∅ = 150 mm, ohne Antibiotikum) kopfüber 2h auf 37°C vortemperiert. Die
Top-Agarose wurde aufgekocht und im Wasserbad auf 48°C abgekühlt.
XL1-blue Bakterien wurden in 10mM MgSO4 auf eine OD600=0.5 eingestellt, 600 µl
der Bakterien-Suspension pro Platte wurden in 15 ml Röhrchen mit der
entsprechenden Menge der Phagen-Library infiziert und 20´ bei 37°C im Wasserbad
inkubiert.
Differentielles Screening 5000 - 7000 pfu / Platte
cDNA-Library Screening 40000-50000 pfu / Platte
Screening von einzelnen Phagen (2. Runde) 50 - 100 pfu / Platte
Tabelle 3-8 Anzahl der eingesetzten Plaque-forming Units für verschiedene
Screeningmethoden
7 ml Top-Agarose wurden pro Röhrchen zugeben und sofort auf die vortemperierten
LB-Platten ausgegossen. Nach dem Erhärten der Top-Agarose, wurden die Platten
umgedreht für 7 - 10 Stunden bei 37°C inkubiert und nach dem Erreichen der
gewünschten Plaquegröße im Kühlraum bei 4°C gelagert (Sambrook et al., 1989).
50

3.5.5.2 Präparation der Filterabdrücke
benötigte Reagenzien:
Filter Nitro-Plus (MSI)
Denaturierungs-Lösung: 5 ml (0.5 M) NaOH
9 g (1.5 M) NaCl
ad 100 ml mit aqua bidest
Neutralisierungs-Lösung: 6 g (0.5 M) Tris / HCl pH 8.0
9 g (1.5 M) NaCl
ad 100 ml mit aqua bidest
Material und Methoden
Die Filter wurden beschriftet, luftblasenfrei auf die Phagenplatte gelegt, mit dem
Skalpell drei Kerben am Rand markiert und nach 2´ abgezogen (Original-Filter).
Nachfolgend wurde noch mindestens einen Dublikat-Filter gezogen (pro Replikat 1´
länger inkubieren, Markierung wie Original-Filter).
Der abgezogene Filter wurde mit der DNA-Seite nach oben auf zwei Lagen
Filterpapier mit Denaturierungs-Lösung gelegt und 5´ einwirken lassen. Danach
wurde der Filter kurz auf Filterpapier getrocknet und mit der DNA-Seite nach oben
auf zwei Lagen Filterpapier mit Neutralisierungs-Lösung gelegt. Nach einer
Einwirkzeit von 5´ wurde der Filter getrocknt und anschließend UV-crossgelinkt
(Sambrook et al., 1989).
Zur Minderung von Bakterienkontaminationen wurden nach dem Blotten 5 Tropfen
Chloroform auf eine Glasplatte geben und die Phagenplatte umgedreht auflegt. Die
Lagerung der Platten erfolgte bei 4°C.
3.5.5.3 Hybridisierung mit radioaktiv markierten Sonden
benötigte Reagenzien:
SSPE (20x) 27.6 g (0.2 M) NaH2PO4 /NaOH pH 7.4
7.4 g (20 mM) EDTA
175 g (3 M) NaCl
ad 1 l mit aqua bidest- autoklavieren!
Prähybridisierungslösung: 15 ml (50 %) Formamid
7.5 ml (5x) SSPE 20x
150 µl (0.1 %) SDS 20%
[600 µl (0.5 mg/ml) tRNA (25 mg/ml)]
300 µl (0.1 mg/ml) Herinssperma-DNA (10 mg/ml)
ad 30 ml mit aqua bidest
Hybridisierungslösung: 15 ml (50 %) Formamid
7.5 ml (5x) SSPE 20x
150 µl (0.1 %) SDS 20%
6 ml (5 %) PEG 8000 25%
[600 µl (0.5 mg/ml) tRNA (25 mg/ml)]
300 µl (0.1 mg/ml) Herinssperma-DNA (10 mg/ml)
ad 30 ml mit aqua bidest
51

Waschlösung A 50 ml (2x) SSC (20x)
2.5 ml (0.1%) SDS (20%)
ad 500 ml mit aqua bidest
Waschlösung B 12.5 ml (0.5x) SSC (20x)
2.5 ml (0.1%) SDS (20%)
ad 500 ml mit aqua bidest
Waschlösung C 2.5 ml (0.1x) SSC (20x)
2.5 ml (0.1%) SDS (20%)
ad 500 ml mit aqua bidest
Waschlösung D 2.5 ml (0.1x) SSC (20x)
25 ml (1%) SDS (20%)
ad 500 ml mit aqua bidest
Material und Methoden
Die Filter werden 1 h in Waschlösung D bei 65°C gewaschen und die
Prähybridisierung erfolgt bei 52°C für 4-5 h. Nach der Denaturierung der cDNA-
Sonde (5´, 95°C) wird die Prähybridisierungslösung abgegossen und der Filter ü.N
bei 52°C in der Hybridisierunglösung (+ Sonde: 1-2 x 10 6 cpm/ml) geschwenkt.
Die Hybridisierungslösung wurde am nächsten Tag abgenommen und bei -20°C
eingefroren (für zweites Screening). Gewaschen wurden die Filter 5´ in Waschlösung
A, 20´ in Waschlösung B, 20´ in Waschlösung C bei RT und schließlich 30´ bei 50°C
in Waschlösung D. Die Autoradiographie erfolgte meistens ü.N..
Interessante Plaques (Signal auf Original-Filter und Duplikat sichtbar) wurden mit
einer Pipette ausgestochen und in 1 ml SM-Puffer + 30 µl Chloroform überführt. Die
Suspension wurde geschüttelt und über Nacht bei 4°C oder 1 - 2 h bei RT inkubiert.
Ein Phagenplaque durchschnittlicher Größe enthielt 10 6 -10 7 infektiöse
Phagenpartikel.
Mit den isolierten Phagen wurde eine 2. Screening-Runde durchgeführt (1 µl der
1:100 verdünnten Phagenstammlösung wurde zur Infektion eingesetzt ≈ 10 - 100
Phagenpartikel) und positive Plaques isoliert.
Die Länge des cDNA-Inserts in den Phagen wurde durch PCR kontrolliert. Zum
Sequenzieren wurde die Phagen-DNA nach der Vorschrift des Herstellers der cDNA-
Bank (Stratagene) in Plasmid-DNA umgewandelt (In vivo excision).
3.5.6 Polymerase Ketten Reaktion (PCR)
Mit Hilfe von zwei entgegengesetzt orientierten, spezifischen Primern lassen sich bei
der PCR aus DNA-Proben Gensequenzen amplifizieren (Mullis et al., 1986). Es
lassen sich geringe DNA-Mengen, oder bei vorhergehender reversen Transkription
auch zelluläre RNA analysieren. Diese Methode wurde zur Herstellung von cDNA-
Sonden, zur Klonierung von 5´-Enden (RACE-PCR), zur Kontrolle von Insertgrößen
(Phagen-PCR, Plasmid-PCR) und zur differentiellen Analyse von verwandten RNA-
Präparationen (Differential Display) verwendet.
52

3.5.6.1 Differential Display
Material und Methoden
Diese von Pardee und Liang (1992) entwickelte Methode wurde von uns zur
Identifizierung von reifungsassoziiert exprimierten Genen aus in vitro differenzierten
Makrophagen verwendet.
Gesamt-RNA von Monozyten und in vitro differenzierten Makrophagen wurde
präpariert und anschließend einem DNase-Verdau unterzogen. Das differentielle
Display erfolgte mit Hilfe des mRNA Differential Display Systems (Genhunter
Corporation, Brookline, USA), den Primern T12MC und AP-1, [α- 35 S] dATP und den
folgenden PCR-Bedingungen:
94°C, 30 s; 40°C, 2 min; 72°C, 30 s (40 Zyklen)
Die Proben wurden über ein 6%iges Harnstoff-Polyacrylamidgel aufgetrennt,
interessante Banden aus dem getrockneten Gel ausgeschnitten, nach der Vorschrift
der Herstellers extrahiert und in einer zweiten PCR-Runde amplifiziert (Bedingungen
wie bei der ersten Runde). PCR-Produkte wurden über ihren A-Überhang in den
Vektor pCRII kloniert (TA-Cloning Kit, Invitrogen).
3.5.6.2 RACE ("rapid amplification of cDNA ends") - PCR
Die durchgeführten RACE-PCRs wurden alle mit Hilfe des Marathon cDNA
Amplification Kit (Clontech) durchgeführt. Die Herstellung der cDNA, die Ligation der
Adapter und die anschließende PCR wurden nach den Vorschriften des Herstellers
durchgeführt. Die Amplifikation erfolgte mit einer Mischung aus Taq- und Pwo-
Polymerase (Expand High Fidelity PCR System, Boehringer Mannheim) unter Zusatz
eines Taq-Startantikörpers (Clontech).
PCR-Bedingungen: 94°C, 30 s; 68°C 4 min (10 Zyklen)
94°C, 30 s; 68°C 4 min + 20 s/Zyklus (20 Zyklen)
3.5.6.3 Bedingungen für weitere verwendete PCR-Amplifikationen
• CPM-Fragment (1250bp) (Primer CPMsense,CPMantisense):
95°C, 1 min; 64°C, 45 s; 72°C, 1.5 min (35 Zyklen)
• Amplifikation von Plasmidinserts direkt aus Bakterien:
(Primer M13 forward und reverse)
Bakterienkolonien wurden mit einer gelben Spitze gepickt und in 5 ml LB-Medium
angeimpft. Die Spitze wurde anschließend in den vorbereiteten Standard-PCR-Mix
getaucht. PCR-Bedingungen:
95°C, 3´; HotStart manuell
94°C, 44 s, 61°C, 40 s, 72°C, 46 s (35 Zyklen)
53

• PhagenPCR
PCR-Mix:
Phagen in SM 3 µl
Tris pH 8.5 (1 M) 10 mM 0.5 µl
MgCl2 (100 mM) 1.5 mM 0.75 µl
KCl (1 M) 50 mM 2.5 µl
Tween20 (10%) 1 % 5 µl
dNTP-Mix (2.5 mM each) 200 µM 4 µl
Primer 1: T3 long (10 pmol /µl) 200 nM 1 µl
Primer 2: M13-Forward (10 pmol /µl) 200 nM 1 µl
H2O 31.85 µl
Taq-Polymerase
95°C, 6´; HotStart
0.4 µl
50 µl
94°C, 30s, 51°C, 30s, 73°C, 3,5 min (28 Zyklen)
Material und Methoden
Bei Verwendung von spezifischen Primern wurde die Annealing-Temperatur
entsprechend der Schmelztemperatur der Primer auf bis zu 65°C erhöht.
54

4 ERGEBNISSE
4.1 Charakterisierung und Identifizierung von
Carboxypeptidase M auf Makrophagen
Ergebnisse
In Vorarbeiten wurde in der Arbeitsgruppe versucht, die von MAX.1 und MAX.11
detektierten Antigene über molekularbiologische Screening-Methoden zu
identifizieren. Weder durch Antikörper-Plaque-Screening noch durch
Expressionsscreening in COS7-Zellen konnten entsprechende cDNA-Klone isoliert
werden, da die Epitope für die beiden Antikörper wahrscheinlich nur im nativen
Zustand und bei korrekter Faltung vorhanden sind. Die Antikörper reagierten auch
nicht mit immobilisierten Proteinen nach SDS-PAGE und Western Blot, was ein
weiterer Hinweis auf eine Notwendigkeit von nativem Protein für die Antigen-
Antikörper-Wechselwirkung war.
Da diese Ansätze zur Antigencharakterisierung nicht zum Erfolg führten, wurde im
Folgenden versucht, die beiden Antigene auf dem klassischen proteinchemischen
Weg zu charakterisieren und zu identifizieren.
4.1.1 Biotinylierung als Alternative zur radioaktiven Markierung
Die zur Charakterisierung geplanten Immunpräzipitationen erforderten eine sensitive
Detektionsmethode, da sich die geringen Mengen immunpräzipitierter Proteine in den
seltensten Fällen durch Coomassie- oder Silberfärbungen nachweisen lassen. Die
klassischen Methoden, wie z.B. die biosynthetische Markierung von Proteinen durch
den Einbau von 35 S-Methionin oder die Markierung von Zelloberflächenmolekülen
durch 125 J, erfordern den Umgang mit radioaktiven Isotopen. Um die Verwendung
von radioaktiven Substanzen zu vermeiden, wurde eine neuere, von Cole et al.
(1987) entwickelte Methode der nichtradioaktiven Markierung von
Oberflächenmolekülen etabliert. Hierbei wird Biotin bei milden Bedingungen über
einen aktivierten Ester an primäre oder sekundäre Aminogruppen von Proteinen
gekoppelt (s. Abbildung 4-1) und anschließend über Streptavidin-Enzymkonjugate
nachgewiesen. Diese Methode eignet sich besonders für den Nachweis von
Oberflächenstrukturen, da die Markierungsreaktion mit intakten Zellen durchgeführt
wird und cytosolische Proteine nicht markiert werden.
55

H
HN
H
HN
O
S
O
S
NH
H
NH
H
D-Biotinoyl-�-aminocapronsäure-
N-hydroxysulfosuccinimidester Natriumsalz
(NHSS-Biotin)
Abbildung 4-1 Reaktionsschema der Biotinylierung mit NHSS-Biotin.
O
NH
O
NH
SO3Na
Ergebnisse
Bei der Etablierung dieser Methode erwies sich ein Aminocapronsäurespacer
zwischen aktiviertem Ester und Biotin als vorteilhaft, ein kürzerer Abstand zwischen
aktiviertem Ester und Biotin führte zu einer verschlechterten Sensitivität des
anschließenden Nachweises. Von verschiedenen getesteten Detergenzien für den
Zellaufschluß wurden mit Nonidet P40 die besten Resultate erzielt.
4.1.2 Biochemische Charakterisierung der von den Antikörpern
MAX.1 und MAX.11 erkannten Antigene
Zur biochemischen Charakterisierung der von MAX.1 und MAX.11 detektierten
Antigene wurden Oberflächenproteine auf Makrophagen mit Biotin markiert und nach
der Lyse immunpräzipitiert. Beide Antikörper fällten ein Glykoprotein mit einem
Molekulargewicht von 58-64 kDa. Die anschließend durchgeführte enzymatische
Deglykosylierung mit N-Glykosidase F (NGF) führte zu einer Reduzierung des
Molekulargewichts auf ca. 46 kDa, was einem Kohlehydratanteil von 28% entspricht
(s. Abbildung 4-2).
O
O
O
O
N
+H2N Protein
O
N Protein
H
56

MW
(kDa)
A B
MW
(kDa)
C
78910
Ergebnisse
Abbildung 4-2 Biochemische Charakterisierung der von MAX.1 bzw. MAX.11
erkannten Antigene. SDS-PAGE und ECL-Färbung von
Immunpräzipitationen aus Lysaten von in vitro differenzierten
Makrophagen mit den folgenden Antikörpern: Anti-CD11c (Bahn 1, 4),
MAX.1 (Bahn 2, 5), MAX.11 (Bahn 3, 6, 7, 8, 9, 10). In B wurden die
Präzipitate mit N-Glykosidase F, in C sukzessive mit Neuraminidase
(Bahn 8), Galactosidase (Bahn 9) und N-Acetyl-D-glukosaminidase
(Bahn 10) verdaut.
Ein stufenweise durchgeführter Verdau von verschiedenen Kohlehydraten
(Neuraminsäure, Galaktose und N-Acetyl-D-glukosamin) führte in allen drei Fällen zu
einer Verringerung des Molekulargewichts (s. Abbildung 4-2 C).
In früheren Arbeiten war bereits gezeigt worden, daß sich das von MAX.1 detektierte
Antigen durch Behandlung mit einer phosphoinositspezifischen Phospholipase C (PI-
PLC) von der Zellmembran abtrennen läßt (Van der Schoot et al., 1989). Eine solche
Abspaltung führt zu einer Anreicherung des Antigens, was für eine anschließende
affinitätschromatographische Aufreinigung von Vorteil ist. Deshalb wurde untersucht,
ob die von MAX.1 und MAX.11 detektierten Antigene auch nach einer PI-PLC-
Abspaltung aus dem erhaltenen Überstand gefällt werden konnten. In Abbildung 4-3
ist das positive Ergebnis dieser Immunpräzipitationen gezeigt.
57

MW
(kDa)
Abbildung 4-3 Immunpräzipitation
nach PI-PLC-Verdau.
Überstände nach PI-PLC-Behandlung von
in vitro differenzierten Makrophagen
wurden mit den folgenden Antikörpern
gefällt: Anti-CD14 (Bahn 1), MAX.1 (Bahn
2), MAX.11 (Bahn 3) und Anti-CD11c
(Bahn 4).
MW
(kDa)
Ergebnisse
Abbildung 4-4 Kreuzreaktivität von
MAX.1 und MAX.11.
Immunpräzipitation nach MAX.1 (Bahn1-3)
bzw. MAX.11 (Bahn 4-6)
Affinitätschromato-graphie mit den
folgenden Antikörpern: MAX.1 (Bahn 1, 4),
MAX.11 (Bahn 2, 5) und Anti-CD11c
(Bahn 3, 6). Die Proben wurden vor der
SDS-PAGE mit NGF verdaut.
Da sich die Eigenschaften der beiden Antigene in den beschriebenen Experimenten
sehr ähnelten, wurde untersucht, ob die beiden Antikörper MAX.1 und MAX.11 ein
einziges Antigen erkennen. Dazu wurden die beiden Antikörper an Sepharose
gekoppelt und mit Hilfe von Miniaffinitätssäulen beide Antigene getrennt aufgereinigt.
Aus den Eluaten beider Säulen konnte jeweils mit MAX.1 und MAX.11 Antigen gefällt
werden (s. Abbildung 4-4). Beide Antikörper sind kreuzreaktiv und erkennen somit
dasselbe Protein.
58

4.1.3 Reinigung und Identifizierung des MAX.1/11-Antigens
Ergebnisse
In vitro differenzierte Makrophagen (8 x 10 8 ) wurden mit PI-PLC behandelt, ein
kleinerer Anteil (1 x 10 8 Zellen) wurde vor dieser Behandlung mit Biotin markiert. Die
vereinigten Überstände wurden über eine MAX.11-Immunaffinitätssäule aufgereinigt
und kleine Mengen der eluierten Fraktionen über SDS-PAGE, Western-Blot und
anschließende ECL-Färbung analysiert. Die Antigen enthaltende Fraktion wurde
nach SDS-PAGE und Western-Blot zur Mikrosequenzanalyse verwendet. Die
folgende N-terminale Aminosäuresequenz konnte von R. Deutzmann (Lehrstuhl für
Biochemie I, Universität Regensburg) detektiert werden:
Leu-Asp-Phe-Asn-Tyr-Xaa-Xaa-Gln-Glu-Gly-Met-Glu-Ala.
Ein Vergleich mit bereits bekannten Sequenzen in der EMBL-Datenbank ergab, daß
diese Sequenz identisch zur N-terminalen Aminosäuresequenz für Carboxypeptidase
M (CPM) ist (Tan et al., 1989).
Zur Bestätigung dieser Identität mit CPM und der Kreuzreaktivität der Antikörper
MAX.1 und MAX.11 wurde die spezifische, membrangebundene Aktivität von CPM
nach Immunpräzipitationen mit beiden Antikörpern gemessen. Die Enzymaktivität
wurde über die Spaltung eines dansylgekoppelten Dipeptids (Dansyl-Ala-Arg)
bestimmt. Wie in Tabelle 4-1 gezeigt, waren beide Antikörper in der Lage die CPM-
Aktivität aus Makrophagen- und Plazentamembranpräparationen zu fällen.
Antikörper Membranpräperation aus
MAK Plazenta
(MSA) (%) (MSA) (%)
Isotypkontrolle 805 ± 123 1 100 2 310 ± 27 100
MAX.1 48 ± 40 6 ± 5 37 ± 34 12 ± 11
MAX.11 73 ± 8 9 ± 1 28 ± 25 9 ± 8
Tabelle 4-1 Immunpräzipitation der Carboxypeptidase-Aktivität aus
Membranfraktionen von in vitro differenzierten Makrophagen (MAK)
oder Plazenta.
1 Restaktivität nach Immunpräzipitation als mittlere spezifische
Aktivität (MSA) in nmol/h/mg Protein ± Standardabweichung (SD) aus
drei unabhängigen Experimenten.
2 % (mittel) der Kontrolle ± SD.
59

4.1.4 Expression und enzymatische Aktivität der
Carboxypeptidase M während der Makrophagenreifung
Ergebnisse
Im Folgenden wurde die Korrelation zwischen Oberflächenexpression, spezifischer
membrangebundener Aktivität und der Expression der mRNA von CPM während der
Serum-induzierten in vitro Differenzierung humaner Monozyten untersucht. Die
kultivierten Monozyten wurden zu verschiedenen Zeitpunkten geerntet und die
jeweiligen Untersuchungen (durchflußzytometrische Analyse, Enzymassay, mRNA-
Extraktion) parallel durchgeführt.
Durch durchflußzytometrische Analysen konnte der Anstieg der CPM-Oberflächenexpression
gezeigt werden. Die leicht unterschiedlichen Fluoreszenzintensitäten von
MAX.1 und MAX.11 waren reproduzierbar (s. Abbildung 4-5).
Abbildung 4-5 Oberflächenexpression von Carboxypeptidase M.
Durchflußzytometrische Analyse mit den beiden Antikörpern MAX.1
(❍) und MAX.11 (●). Frisch isolierte Monozyten, Monozyten nach
Adhärenz über Nacht und nach 1, 3 bzw. 7 Tagen Serumkultur
wurden für die Analyse gefärbt. Angegeben ist die `mean channel
fluorescence´ (MCF) der positiven Zellen abzüglich der MCF einer
Isotyp-Kontrolle von einem repräsentativen Experiment (n=4).
Die mittlere spezifische Aktivität (MSA) von CPM in Membranpräparationen wurde zu
gleichen Zeitpunkten durch die Umsetzung von Dansyl-Ala-Arg gemessen. Wie in
Abbildung 4-6 gezeigt, konnte ein 30-40 facher Anstieg der MSA nachgewiesen
werden.
Parallel präparierte Gesamt-RNA wurde geblottet und mit einer CPM-Sonde
hybridisiert. RNA von humanen Hautfibroblasten und gemischten, humanen
60

Ergebnisse
Lymphozyten wurde als Negativkontrolle, RNA von humaner Plazenta als
Positivkontrolle verwendet. Die CPM-mRNA wurde - ebenso wie Enzymaktivität und
Oberflächenexpression - im Laufe der acht Kulturtage deutlich hochreguliert (s.
Abbildung 4-7).
Abbildung 4-6 CPM-Aktivität während der Monozytendifferenzierung. Membranen
wurden von frisch isolierten Monozyten, nach Adhärenz über Nacht
und nach 1, 3 bzw. 7 Tagen Serumkultur präpariert. Die
membrangebundene Enzymaktivität wurde durch die Umsetzung des
Substrats Dansyl-Ala-Arg gemessen. Die Werte sind als mittlere
spezifische Aktivität (MSA) von vier unabhängigen Experimenten
angegeben.
Abbildung 4-7 Northern Blot Analyse der CPM mRNA. Gesamt RNAs von frisch
isolierten Monozyten (d0), nach Adhärenz über Nacht (d1), nach 1
(d2), 3 (d4) bzw. 7 (d8) Tagen Serumkultur, von gemischten
Lymphozyten (L), Plazenta (P) und humanen Hautfibroblasten
wurden mit einer CPM-Sonde hybridisiert.
61

4.1.5 7A2-Antigen
Ergebnisse
In Zusammenarbeit mit D. Männel (Abt. für Tumorimmunologie des Inst. für
Pathologie, Universität Regensburg) wurden in der Arbeitsgruppe neue monoklonale
Antikörper produziert, die im Zell-ELISA in vitro differenzierte Makrophagen, nicht
aber Blutmonozyten erkennen. Zur ersten Charakterisierung der Antigene, die diese
Antikörper erkennen, wurden Immunpräzipitationen aus Lysaten von biotinmarkierten
Makrophagen durchgeführt. Der als 7A2 bezeichnete Antikörper präzipitierte ein
glykosyliertes Protein mit einem Molekulargewicht von 58-64 kDa (s. Abbildung 4-8).
Die gefärbte Bande entsprach hierbei den durch MAX.1 und MAX.11 erzeugten
Mustern. Diese Ähnlichkeit und die nach enzymatischer Deglykosylierung
entstandene 46 kDa-Bande (entsprechend wie bei MAX.1/11) legten nahe, daß es
sich bei dem 7A2-Antigen ebenfalls um Carboxypeptidase M handelt. Im Folgenden
wurde untersucht, ob dieser Antikörper, wie MAX.1 bzw. MAX.11, die spezifische
Enzymaktivität aus Plazenta- oder Makrophagenmembranen präzipitierte. Im
Vergleich zu einem Isotyp-Kontrollantikörper konnten in drei unabhängigen
Experimenten 85 ± 7 % der spezifischen Aktivität aus Plazenta und 83 ± 9 % der
spezifischen Aktivität aus Makrophagenpräparationen gefällt werden.
Abbildung 4-8 Biochemische Charakterisierung
des von 7A2 erkannten Antigens.
SDS-PAGE und ECL-Färbung von
Immunpräzipitationen aus Lysaten
von in vitro differenzierten
Makrophagen (A) ohne, (B) mit
anschließender enzymatischer
Deglykosylierung.
MW
(kDa)
62

4.1.6 Molekularbiologische Vorarbeiten zur Klonierung des
humanen CPM-Gens
Ergebnisse
Das vollständige mRNA-Transkript von CPM hatte bei Hybridisierungen eine Länge
von ca 4.2 kb, eine weitere Bande, eventuell alternativ gesplißte mRNA, war
oberhalb von 5 kb erkennbar (s. Abbildung 4-7). Die publizierte Sequenz umfaßt
jedoch nur ca 2 kb. Zur Charakterisierung des Gens ist eine möglichst vollständige
cDNA erforderlich.
4.1.6.1 Charakterisierung des 5´-Endes der CPM-mRNA
Zur Klonierung eventuell fehlender Sequenzbereiche im 5´-untranslatierten Bereich
der CPM cDNA und zur groben Bestimmung der Lage des Transkriptionsstarts
wurden RACE-PCRs mit drei Primern durchgeführt, die jeweils 120, 340 und 680 bp
oberhalb vom bekannten Sequenzstart lagen. Wie in Abbildung 4-9 gezeigt,
entsprachen die durch 5`-RACE-PCR erzeugten Banden den oben genannten
Abständen, das 5´-Ende der CPM cDNA war also möglicherweise vollständig oder
fast vollständig sequenziert.
Abbildung 4-9
1.5%iges Ethidiumbromid-gefärbtes Agarosegel
einer 5´-RACE-PCR zur ungefähren Bestimmung
der Länge des 5´-untranslatierten Bereiches der
CPM-mRNA. Die Amplifikation wurde mit Adapterligierter
cDNA von in vitro differenzierten
Makrophagen (d5) und den Primern CPM P1, P3
und P4 durchgeführt.
(kb)
63

Ergebnisse
4.1.6.2 Charakterisierung und Klonierung des 3´-Endes der CPMmRNA
In der Region nahe der bekannten poly(A)-Sequenz konnte keine
Konsensussequenz für das Polyadenylierungssignal (AAUAAA) gefunden werden.
Dies ist ein Hinweis darauf, daß der wirkliche poly(A)-Schwanz in einem
unbekannten 3´-Sequenzbereich liegen könnte. Ein Sequenzvergleich (s. Abbildung
4-10) des bekannten 3´-Endes ergab eine über 80%ige Homologie zu sog. Alu-
Repeat-Sequenzen. Diese mobilen Pseudogene sind 150-300 bp lang, machen mit
800000 Kopien ca. 5% des humanen Genoms aus und besitzen ein A-reiches 3´-
Ende. Im Falle einer oligo(dT)-geprimten reversen Transkription der CPM-mRNA
könnte dieses A-reiche 3´-Ende mit dem Primer hybridisieren und die Transkription
aus der Richtung des echten poly(A)-Schwanz unterbrechen.
ALU 1 .........................CGGCCGGGCACGGTGGTTCACGCCT 25
|||| || | ||| | | |
CPM 1698 CTTCTACATACAAGACTTCACCATAAGGCCAGGAGCAGTGCTCACGCCTT 1747
. . . . .
ALU 26 GTAATCCCAGTACTTTGGGAGGCTGAGGTGAGTGGATCAC...GAGGTCA 72
|||||||||| |||||||||||| ||||| | ||||||| |||||||
CPM 1748 GTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCCAAGGTGGGCGGATCACCTTGAGGTCA 1797
. . . . .
ALU 73 GGAGTTCAAGACCAACCTGGCCAAGATGGTGATAACCCCGTCTCTACTAA 122
|||||||||||||| |||| |||| ||||||| ||||| |||||||||
CPM 1798 GGAGTTCAAGACCAGCCTGACCAACATGGTGA.AACCCTGTCTCTACT.. 1844
. . . . .
ALU 123 AAATACAAAAATTAGCAGGGCGTGGTGACCGGCACCTGTAATCCCAGCTA 172
||| |||||| ||| |||||| | |||||||||| || ||||
CPM 1845 ......AAATATTAGCGGGGTGTGGTGGCGGGCACCTGTAGTCGCAGCCT 1888
. . . . .
ALU 173 CTTAGGAGGCTGAGGCA.GAGAATTGGTTGAACCAGGGAGGCGGAGGTTG 221
| |||||||||| || |||||| | ||||||| ||||||||| |||
CPM 1889 TTCGGGAGGCTGAGACAGGAGAATCGCTTGAACCCTAGAGGCGGAGTTTG 1938
. . . . .
ALU 222 CAGTGAGCTGAGATCGTGCCACTGCACTCCAGCCTGGGCAACAGAGCAAG 271
|||||||| ||||| |||||| || |||||||| |||||||||||| |||
CPM 1939 CAGTGAGCCGAGATAGTGCCATTGTACTCCAGCTTGGGCAACAGAGTAAG 1988
. .
ALU 272 ACTCCGTCTCAAAAAAGAAAAAAAAAACA 300
|||| |||||
CPM 1989 ACTCTGTCTC................... 1998
Abbildung 4-10 Alu-Repeat. Sequenzvergleich des 3' Endes humaner
Carboxypeptidase M mit einer H.sapiens Alu Repeat Sequenz (Klone
2-48, Accessionnr. X62357). Die verglichenen Sequenzen sind zu
82.7 % identisch.
64

Ergebnisse
4.2 Charakterisierung von weiteren Oberflächenantigenen
4.2.1 MAX.3-Antigen
Ebenso wie die beiden Antikörper MAX.1 bzw. MAX.11 ist MAX.3 ein Antikörper, der
reifungsabhängig exprimierte Strukturen auf Makrophagen erkennt. Auch in diesem
Fall waren molekularbiologische Ansätze zur Identifizierung fehlgeschlagen, so
wurde auch hier versucht, das Antigen auf biochemischem Wege zu charakterisieren
und zu identifizieren.
4.2.1.1 Biochemische Charakterisierung des vom Antikörper MAX.3
erkannten Antigens
Bei Immunpräzipitationen aus Lysaten von biotinmarkierten Makrophagen konnte das
Antigen als diffuse Bande zwischen 60 und 90 kDa detektiert werden. Nach
enzymatischer Deglykosylierung des präzipitierten Materials verringerte sich das
Molekulargewicht auf ca. 45 kDa. Das von MAX.3 erkannte Antigen war also mit
einem Kohlehydratanteil von 25-50% stark N-glykosyliert (s. Abbildung 4-11 Bahn 2,
4).
Abbildung 4-11
Immunpräzipitationen mit MAX.3.
SDS-PAGE und ECL-Färbung von
Immunpräzipitationen aus Lysaten von in
vitro differenzierten Makrophagen (MAK)
und Blutplättchen (P) mit dem Antikörper
MAX.3 (Bahn 1,2). In Bahn 3, 4 wurden die
Präzipitate mit N-Glykosidase F verdaut.
MW
(kDa)
65

Ergebnisse
Da bei der anfänglichen Charakterisierung des Antikörpers eine Kreuzreaktivität mit
Thrombozyten festgestellt werden konnte, wurde versucht, das entsprechende
Antigen aus Thrombozytenlysaten zu fällen. Thrombozyten wurden mit Biotin
oberflächenmarkiert, lysiert und immunpräzipitiert. Der Vergleich mit der aus
Makrophagen präzipitierten Bande zeigt eine deutlich geringere Glykosylierung des
Antigens auf Thrombozyten. Das Molekulargewicht liegt bei ca. 58-62 kDa (s.
Abbildung 4-11). Nach enzymatischer Deglykosylierung wird auch hier das
Molekulargewicht auf ca. 45 kDa reduziert, ein Hinweis darauf, daß beide Antikörper
dasselbe Antigen auf Makrophagen und Thrombozyten erkennen und sich das
Proteingerüst des Antigens auf beiden Zelltypen nicht unterscheidet.
4.2.1.2 Affinitätschromatographische Aufreinigung
Ein Problem bei der Identifizierung des MAX.3-Antigens war die geringe Menge an
Antikörper, die zur Verfügung stand. Die in der Arbeitsgruppe von Emmrich (Leipzig)
kultivierten Hybridome produzierten nur noch ca. 2-3 mg/Liter MAX.3-Antikörper, was
eine effiziente Anreicherung des Antikörpers erschwerte. Für die Herstellung einer
Immunaffinitätssäule standen nur 2 mg aufgereinigter Antikörper zur Verfügung, was,
wie im Folgenden beschrieben, einen zweiten Anreicherungsschritt nötig machte.
In anfänglichen Experimenten wurde versucht, das Antigen aus Makrophagenlysaten
aufzureinigen. Wegen der großen Menge an unspezifischen Verunreinigungen in
diesen Präparationen wurde dazu übergegangen, das Antigen aus Thrombozyten zu
isolieren. Bei basischen Elutionen (pH 11.5) war das Antigen erst in den späten
Fraktionen detektierbar und, verteilt auf vier bis fünf Fraktionen, stark verdünnt.
Durch Veränderung des pH-Wertes des Elutionspuffers ins Saure (pH 2.7) konnte ein
schärferer Elutionsverlauf erreicht werden. Das gereinigte Antigen war auf zwei bis
drei Fraktionen à 2 ml verteilt.
Um eine Volumenverringerung, also eine weitere Konzentrierung des Antigens zu
erreichen, wurden zwei Lektine, Weizenkeim Agglutinin (WGL, bindet reversibel an
N-Acetyl-β-D-glukosaminreste und schwächer an Sialinsäurereste) und Concanavalin
A (ConA, bindet reversibel an α-D-Mannose- oder α-D-Glukosereste), zur
affinitätschromatographischen Anreicherung der Eluate getestet.
66

Ergebnisse
Wie in Abbildung 4-12 demonstriert, konnte frisch präpariertes MAX.3-Antigen
vollständig an WGL-Agarose gebunden werden. ConA-Sepharose zeigte eine
niedrigere Affinität für das Antigen.
Abbildung 4-12 Bindung von MAX.3-Antigen an Lektine. Über Affinitätschromatographie
gereinigtes MAX.3 Antigen (Bahn A) wurde mit
WGL-Agarose (Bahn B) oder ConA-Sepharose (Bahn C) gefällt und
nach SDS-PAGE Silber-gefärbt. Auf Bahn D und E wurden die
jeweiligen Überstände (Restprotein nach der Fällung) aufgetragen.
Abbildung 4-13
MW
(kDa)
Präparation von MAX.3-Antigen für die
Mikrosequenzanalyse. Über Immunaffinität und
Lectinaffinität gereinigtes Antigen wurde nach
SDS-Page und Western-Blot auf PVDF-Membran
mit Coomassie Blue angefärbt.
Das Antigen wurde von S. Heinz, im Rahmen seiner Diplomarbeit in unserer
Arbeitsgruppe, aus mehreren Thrombozytenlysaten angereichert. Insgesamt fünf
Antigen-enthaltende Fraktionen wurden über WGL-Agarose auf 600 µl Volumen
eingeengt und in vier Portionen mit Chloroform extrahiert. Das gefällte Protein wurde
über ein 10%iges SDS-Gel aufgetrennt und nach dem Blotten auf PVDF-Membran
mit Coomassie angefärbt (s. Abbildung 4-13). Die deutlich gefärbte Proteinbande bei
67

Ergebnisse
58-64 kDa wurde ausgeschnitten und von R. Deutzmann (Inst. für Biochemie I,
Universität Regensburg) N-terminal ansequenziert. Die folgende Aminosäuresequenz
konnte detektiert werden:
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
(Lys)-Asp-Ser-Glu-Ile-Phe-Thr-Val-Asn-Gly-Ile-Leu-Gly-Glu.
Vergleichende Analysen in der EMBL-Datenbank ergaben keine Homologien zu
bereits bekannten Sequenzen. Anhand der Aminosäuren 4-12 wurde nun ein
degeneriertes Oligonukleotid synthetisiert, das in weiteren Experimenten zur
molekularbiologischen Klonierung verwendet wird.
4.2.2 8H8-Antigen - Identität mit Komplementrezeptor CR4
Im Rahmen der Charakterisierungsversuche neu in der Arbeitsgruppe erzeugter
Antikörper, wurde auch der monoklonale Antikörper 8H8 untersucht. Wie alle
anderen Antikörper war er aufgrund seiner Fähigkeit, reifungsassoziierte Antigene
auf Makrophagen zu erkennen, selektioniert worden.
Abbildung 4-14
Kreuzreaktivität von 8H8 und Leu-M5.
Immunpräzipitation nach 8H8 Affinitätschromatographie
mit 8H8, Anti-CD11c (Leu-M5) und einem
Kontrollantikörper.
MW
(kDa)
68

Ergebnisse
Bei Immunpräzipitationen entsprach das von ihm erzeugte Bandenmuster
weitgehend dem des Antikörpers LeuM5, der die α-Kette des Komplement-Rezeptors
CR4 markiert. Dieses Antigen ist auf Monozyten und Makrophagen detektierbar. Um
diese eventuelle Identität bestätigen zu können, wurden 500 µg aufgereinigter
Antikörper 8H8 an Sepharose-Matrix gekoppelt. Über die erhaltene
Miniaffinitätssäule wurde das 8H8-Antigen aufgereinigt und konnte anschließend (wie
in Abbildung 4-14 gezeigt) sowohl durch den Antikörper 8H8 als auch durch den
Antikörper LeuM5 (Anti-CD11c), nicht aber durch einen Kontrollantikörper gefällt
werden.
69

Ergebnisse
4.3 Klonierung von reifungsassoziiert exprimierten Genen
über Differentielles Screening
4.3.1 Differenzielles Screening - Monozyten versus Makrophagen
Zur Identifizierung von reifungsassoziiert exprimierten Genen aus Makrophagen
wurde ein differenzielles Screening mit einer Makrophagen cDNA-Bank durchgeführt,
die von S.W. Krause innerhalb der Arbeitsgruppe für diesen Zweck hergestellt
worden war. Im initialen Screening wurden 20000 Plaques analysiert. 120 Plaques
reagierten stärker mit radioaktiv markierter cDNA aus Makrophagen als mit der aus
Monozyten. Die Phagen wurden isoliert und daraufhin einzeln ein zweites Mal
gescreent. Für 41 Plaques konnte ein spezifisches Signal bei Makrophagen
reproduziert werden (s. Abbildung 4-15). Diese Plaques wurden durch ´in vivo
excision´ in Plasmide umgewandelt und die cDNA-Inserts partiell sequenziert.
4.3.2 Sequenzanalysen und Northern Blot Analysen
Zur Identifikation der ermittelten cDNA-Sequenzen wurden Computeranalysen in der
EMBL-Genbank durchgeführt. In Tabelle 4-2 ist eine Übersicht der erhaltenen Daten
gezeigt.
Klon Nr. Homologien
1, 4, 5, 6, 9, 11, 12, 16 Osteopontin
2, 3, 7, 8, 14, 15, 23, 24, 26, 32, 39 Human Cartilage Glycoprotein HC-gp39
10, 18, 22, 25 Apolipoprotein E
13, 17, 20, 21, 27 Collagenase Typ IV
19 Cathepsin B
29 Pleckstrin
30 Ferritin (leichte Kette)
34 Tryptophanyl-tRNA-Synthetase
37 Thymosin β-10
35, 36 -
28, 31, 33, 38, 40, 41 Introns, Alu-Sequenzen
Tabelle 4-2 Differenzielles Screening. Übersicht über die analysierten Klone und
ihre Homologien.
70

Ergebnisse
Für insgesamt acht Klone konnten keine deutlichen Homologien festgestellt werden,
die restlichen 35 cDNA-Sequenzen waren identisch mit neun bereits klonierten
cDNAs.
Abbildung 4-15 1. (A+B) und 2. (C+D) Screening-Runde. Filter A und C wurden mit
einer Sonde aus Makrophagen-mRNA, B und D mit einer Sonde aus
Monozyten-mRNA hybridisiert (weiße Pfeile markieren
reifungsassoziiert auftretende Signale, schwarze Pfeile markieren
Signale auf beiden Filtern).
71

Ergebnisse
Als nächstes wurden zur Bestätigung der makrophagenspezifischen Expression
Northern Blot Analysen durchgeführt. Für Apolipoprotein E (s. Abbildung 4-16) und
Ferritin (leichte Kette) war ein Expressionsanstieg während der Reifung bekannt, für
Osteopontin, Collagenase Typ IV, HC-gp39, Cathepsin B und Tryptophanyl-tRNA-
Syntethase (s. Abbildung 4-17) konnte ein Expressionsanstieg in mehreren (n≥3)
unabhängigen Experimenten reproduziert werden.
Abbildung 4-16 Northern Analyse für Apolipoprotein E. Expression während der
Monozytendifferenzierung in vitro. Gesamt RNAs wurden von frisch
isolierten Monozyten (d0), nach Adhärenz über Nacht (d1), nach 1
(d2), 3 (d4) bzw. 7 (d8) Tagen Serumkultur präpariert.
Pleckstrin und Thymosin β-10 waren im Northern Blot nicht reifungsassoziiert, für
sechs der unbekannten Sequenzen (28, 31, 33, 38, 40, 41) konnten in Northern Blot
Hybridisierungen keine eindeutigen Signale festgestellt werden. Im Falle der Klone
35 und 36 war wiederum kein reifungsabhängiger Expressionsanstieg festzustellen.
72

I.a.
II.a.
III.a.
I.b.
II.b.
III.b.
Ergebnisse
73

IV.a.
V.a.
IV.b.
V.b.
Ergebnisse
Abbildung 4-17 Northern Analyse (a.) und densitometrische Auswertung der
Autoradiogramme (b) für fünf reifungsassoziierte Klone. Expression von
HC-gp39 (I), Osteopontin (II), Collagenase Typ IV (III), Cathepsin B (IV)
und Tryptophanyl-tRNA Synthetase (V) während der Monozytendifferenzierung
in vitro. Gesamt RNAs wurden von frisch isolierten
Monozyten (d0), nach Adhärenz über Nacht (d1), nach 1 (d2), 3 (d4)
bzw. 7 (d8) Tagen Serumkultur präpariert.
4.3.3 Charakterisierung der reifungsabhängigen Expression von
HC-gp39
Das Expressionsprofil von HC-gp39 (s. Abbildung 4-17) wies darauf hin, daß die
Regulation dieses Gens erst zu einem relativ späten Zeitpunkt während der in vitro
Differenzierung erfolgt. Erst ab Tag 4 der in vitro Kultur ist ein kräftiges Signal im
Northern detektierbar. In der Literatur werden bisher keine ähnlich regulierten Gene
beschrieben. Im Folgenden sollte untersucht werden, ob sich dieses Gen als Modell
für transkriptionelle Regulationsprozesse der späten Phase der monozytären
Differenzierung eignet.
74

4.3.3.1 Expression von HC-gp39 bei Kurzzeitstimulationen
Ergebnisse
Monozyten und Makrophagen können durch eine Vielzahl von Agentien zur
Expression von Aktivierungsgenen stimuliert werden. Um zu klären, ob das HC-gp39
Gen neben der reifungsassoziierten auch eine aktivierungsassoziierte Expression
aufweist, wurden Kurzzeitstimulationen mit einer Kombination aus LPS/IFN-γ oder
Vitamin D3 durchgeführt. Wie in Abbildung 4-18 gezeigt, konnte in keinem Fall ein
Anstieg der HC-gp39 Expression festgestellt werden.
Abbildung 4-18 Northern Analyse der Expression von HC-gp39 bei
Kurzzeitstimulationen. Monozyten wurden in Serum
alleine, mit Vit.D3 oder einer Kombination aus LPS und
IFN-γ für 4 bzw. 16 h kultiviert und geerntet. Zur Kontrolle
wurde RNA von frisch isolierten Monozyten oder in vitro
differenzierter Makrophagen (d8) aufgetragen.
4.3.3.2 Expression von HC-gp39 in dendritenähnlichen Zellen
Durch Inkubation mit IL-4, GM-CSF und INF-γ differenzieren Monozyten in
dendritenähnliche Zellen, die sich von Makrophagen in Phänotyp und Funktionalität
deutlich unterscheiden. Um zu untersuchen, ob sich die Hochregulation von HC-gp39
auf den Makrophagendifferenzierungsweg beschränkt oder auch bei der
Differenzierung in dendritenähnliche Zellen auftritt, wurde die Expression von HCgp39
von beiden Differenzierungsformen miteinander verglichen. In Abbildung 4-19
ist gezeigt, daß bei der Differenzierung in dendritenähnliche Zellen keine deutliche
Hochregulation der HC-gp39 Expression erfolgt.
75

Ergebnisse
Abbildung 4-19 Northern Blot Analyse der Expression von HC-gp39 in
dendritenähnlichen Zellen. Monozyten wurden parallel mit Zusatz von
Serum (MAK) oder einer Mischung aus IL-4, GM-CSF und IFN-γ für
10 Tage kultiviert. Bei den im zweiten Fall erhaltenen
dendritenähnlichen Zellen wurde zwischen adhärenten (adhDC) und
nicht adhärenten Zellpopulationen (mdDC) unterschieden.
4.3.4 Molekularbiologische Charakterisierung des humanen
HC-gp39 -Gens - Bestimmung der HC-gp39 mRNA
Initiationsstelle
Wie auch im Falle von CPM sollten für HC-gp39 erste Untersuchungen durchgeführt
werden, um im Anschluß an diese Arbeit das Gen und den dazugehörigen Promotor
klonieren und charakterisieren zu können.
Vom humanen HC-gp39 ist eine 1741 bp lange Nucleotidsequenz beschrieben
(Hakala et al., 1993), die die vollständige mRNA repräsentieren soll. Der exakte
Transkriptionsstart wurde nun mittels Primerextension und 5´-RACE-PCR bestimmt.
76

Ergebnisse
Abbildung 4-20 Primerextension der HC-gp39 mRNA. Aufgetragen wurde eine
bekannte Sequenzreaktion und die Reaktionsprodukte aus den
Extensionansätzen mit dem Primer HCgpOUT und Makrophagen
RNA (I), dem Primer HCgpIN und Makrophagen RNA (II) oder als
Negativkontrolle mit Monozyten RNA (III). Die spezifischen Banden
sind jeweils durch Pfeile markiert.
Die Primerextension-Reaktion wurde mit zwei Primern durchgeführt, die
komplementär zu 30bp (+19 bis +48; Primer HCgpIN), bzw. zu 33bp (+49 bis +81;
Primer HCgpOUT) der HC-gp39 cDNA sind. Für die reverse Transkription wurde
RNA von in vitro differenzierten Makrophagen (d5) bzw. als Negativ-Kontrolle RNA
von frisch isolierten Monozyten verwendet. Wie in Abbildung 4-20 gezeigt, konnten
zwei, sich über jeweils vier Basen erstreckende Transkriptionsinitiationsbereiche
detektiert werden. Mit Hilfe einer bekannten Sequenzreaktion konnte die Länge der
Fragmente bestimmt werden. Relativ zum Adenosin des Translationsstarts ergeben
sich zwei Transkriptions-Startregionen von -78 bis -81 bp und -122 bis -125 bp. Beide
77

Ergebnisse
Transkriptions-Startregionen liegen außerhalb der publizierten Sequenz, die bei -71
bp (relativ zum Adenosin des Translationsstarts) endet.
Für die RACE-PCR wurde Adapter-ligierte Makrophagen-cDNA und ein Primer
verwendet, der zu den Basen +223 bis +252 der HC-gp39 cDNA komplementär ist.
Unter Berücksichtigung der Adapterlänge und der über Primer extension ermittelten
Transkriptionsinitiationsbereiche ergeben sich theoretische Fragmentgrößen von 377
bp bzw. 421 bp. Wie in Abbildung 4-21 zu sehen ist, ließ sich ein
Amplifikationsprodukt im Bereich der berechneten Fragmentgrößen detektieren. Die
beiden theoretisch zu erwartenden Fragmente ließen sich allerdings nicht exakt
voneinander abgrenzen.
Abbildung 4-21 1.5%iges Ethidiumbromid-gefärbtes Agarosegel einer 5´-RACE-PCR
zur ungefähren Bestimmung der Länge des 5´-untranslatierten
Bereiches der HC-gp39-mRNA. Die Amplifikation wurde mit Adapterligierter
cDNA von in vitro differenzierten Makrophagen (d5) und dem
Primer HC-gpRACE durchgeführt.
(bp)
78

Ergebnisse
4.4 Klonierung und Charakterisierung eines reifungsassoziiert
exprimierten Gens über differentielles Display
Als zweite Methode zur Identifizierung von reifungsassoziiert exprimierten Genen
wurde das von Liang und Pardee (1992) entwickelte differenzielle mRNA Display
verwendet. Die Grundidee hinter dieser Methode ist, daß eine Zelle ca. 15000 Gene
exprimiert und daß sich prinzipiell jede einzelne mRNA revers transkribieren und
über PCR amplifizieren läßt. Bei der Verwendung von degenerierten Oligo(dT)-
Primern und kurzen arbiträren Primern für die PCR erhält man pro Ansatz 200-300
PCR-Fragmente. Diese können über ein Sequenzgel aufgetrennt und analysiert
werden. Durch den Vergleich der Bandenmuster von verwandten, aber nicht
identischen Zellen (z.B. stimuliert / unstimuliert) lassen sich mit dieser Methode
differenziell exprimierte Gene isolieren. Mit zusätzlicher Hilfe der RACE-Technik kann
die bei anderen Screeningmethoden notwendige und aufwendige Konstruktion einer
cDNA-Bank möglicherweise umgangen werden.
Als nachteilig haben sich im Laufe der Etablierung dieser Methode die relativ
schlechte Reproduzierbarkeit und die hohe Anzahl falsch positiver Fragmente
erwiesen, die häufig durch Hybridisierung der kurzen Oligo(dT)-Primer mit Adenosinreichen
Regionen in ALU-Repeat Sequenzen verursacht werden.
4.4.1 Klonierung und Sequenzierung eines reifungsassoziierten
Transkripts
Nach einem differentiellen Display mit der Primerkombination T12MC, AP-1 (5´-
AGCCAGCGAA-3´) aus Gesamt-RNA von 1.) adhärenten Monozyten und 2.) in vitro
differenzierten Makrophagen konnten drei Fragmente isoliert werden, die
reproduzierbar in der Makrophagenpräparation erschienen und bei der
Monozytenpräparation fehlten (Abbildung 4-22 A). Nach der Reamplifikation wurden
die Fragmente in den pCRII-Vektor (Invitrogen) kloniert. Zur Bestätigung der
reifungsassoziierten Expression in Makrophagen wurden die präparierten
Plasmidinserts als Sonden für Northern Blots verwendet. Für den als dd3f
bezeichneten Klon konnte bei Makrophagen ein Signal bei ca. 2.8 kb detektiert
werden, das bei Monozyten fehlte (Abbildung 4-22 B). Die beiden anderen
Fragmente waren nicht reproduzierbar reifungsassoziiert.
79

Ergebnisse
Abbildung 4-22 Differentielles mRNA Display (A) von frisch isolierten Monozyten
(MO) versus in vitro differenzierte Makrophagen (MAK). Das
reproduzierbar reifungsabhängige PCR-Fragment (dd3f) ist durch
einen Pfeil gekennzeichnet. B. Northern Hybridisierung mit dem
klonierten dd3f-PCR-Fragment als Sonde. Zur Kontrolle für die
gleichmäßige Beladung des Gels wurde ein 18S-spezifisches
Oligonukleotid als Sonde verwendet.
Die Sequenzierung des 666 bp-Fragments und ein anschließender Vergleich mit
bekannten Sequenzen ergab keine Homologien. Da es sich also um ein unbekanntes
Transkript handelt, wurde mit dem klonierten Fragment eine Makrophagen cDNA-
Bank gescreent. Sieben Phagen, die mit dem dd3f-Fragment hybridisierten, wurden
isoliert und anschließend über "in vivo excision" in Plasmide umgewandelt. Die
beiden längsten Inserts hatten eine Länge von 2.5 kb. Ein ca. 2.3 kb langer Klon
wurde über "nested deletion" verdaut, subkloniert und zusammen mit den restlichen
Klonen unterschiedlicher Länge sequenziert (s. Abbildung 4-23). Die erhaltene, 2539
bp umfassende cDNA-Sequenz (Genbank Accession Number X85750) ist in
Abbildung 4-24 gezeigt.
80

DbI, J2a (2316 bp)
Nested Deletion
SEQ02 SEQ01
SEQ03
A2aI, H2aI (2532 bp)
ORF
L1a (1844 bp)
J2a (1152 bp)
K1a (874 bp)
dd3f (666 bp)
Sac I Sac I Pst I EcoRI EcoRI Kpn I
Sau3A I
500 bp
Ergebnisse
Differential Display
SEQ04 SEQ05
Abbildung 4-23 Das dd3f-PCR-Fragment und die aus der MAK-cDNA-Bank isolierten
cDNA Klone. Die aus dem DbI-Klon durch Exo III-Verdau generierten
Subklone wurden sequenziert und die erhaltene Sequenz durch
partielle Sequenzierung des Gegenstrangs kontrolliert.
4.4.2 Charakterisierung des reifungsassoziierten Transkripts
dd3f
Der längste detektierbare offene Leserahmen ergibt, vom ersten ATG-Kodon
gelesen, ein Polypeptid aus 238 Aminosäuren. Der Region um die ersten beiden
ATG-Kodons in diesem Sequenzabschnitt fehlen zwar die klassischen Kozak
Sequenzen, dafür ist der mögliche 5´-untranslatierte Bereich aber GC-reich. GCreiche
Bereiche werden auch bei anderen Genen, denen die klassischen ´starken´
Startkodons fehlen, gefunden (Sherrington et al., 1995). Der 3´-untranslatierte
Bereich endet mit einem poly(A)-Schwanz und enthält Konsensussequenzen zur
Polyadenylierung an den Basenpositionen 984, 2074 und 2499.
81

1 GCACGAGCCAAGCCCATGAGGGCCGCGCGCCCGGCCGCCGGTGCTGACGAGACGGAGCTC
61 CTGGCCCCCGAGGAGGAGCAGAGGATCAATGCGGTTCAAGAATCGATTCCAGCGGTTCAT
M R F K N R F Q R F M 11
121 GAACCATCGAGCTCCAGCCAATGGCCGCTACAAGCCAACTTGCTATGAACATGCTGCTAA
N H R A P A N G R Y K P T C Y E H A A N 31
181 CTGTTACACACACGCATTCCTCATTGTTCCGGCCATCGTGGGCAGTGCCCTCCTCCATCG
C Y T H A F L I V P A I V G S A L L H R 51
241 GCTGTCTGATGACTGCTGGGAAAAGATAACAGCATGGATTTATGGAATGGGACTCTGTGC
L S D D C W E K I T A W I Y G M G L C A 71
301 CCTCTTCATCGTTTCTACAGTATTTCACATTGTATCATGGAAAAAGAGCCACTTAAGGAC
L F I V S T V F H I V S W K K S H L R T 91
361 AGTGGAGCATTGTTTTCACATGTGTGATAGAATGGTTATCTATTTCTTCATTGCTGCTTC
V E H C F H M C D R M V I Y F F I A A S 111
421 TTATGCTCCATGGTTAAATCTTCGTGAACTTGGACCCCTGGCATCTCATATGCGTTGGTT
Y A P W L N L R E L G P L A S H M R W F 131
481 TATCTGGCTCATGGCAGCTGGAGGAACCATTTATGTATTTCTCTACCATGAAAAATATAA
I W L M A A G G T I Y V F L Y H E K Y K 151
541 GGTGGTTGAACTCTTTTTCTATCTCACAATGGGATTCTCTCCAGCCTTGGTGGTGACATC
V V E L F F Y L T M G F S P A L V V T S 171
601 AATGAACAACACCGATGGACTTCAGGAACTTGCCTGTGGGGGCTTAATTTATTGCTTGGG
M N N T D G L Q E L A C G G L I Y C L G 191
661 AGTTGTGTTCTTCAAGAGTGATGGCATCATTCCATTTGCCCACGCCATCTGGCACCTGTT
V V F F K S D G I I P F A H A I W H L F 211
721 TGTGGCCACGGCAGCTGCAGTGCATTACTACGCCATTTGGAAATACCTTTACCGAAGTCC
V A T A A A V H Y Y A I W K Y L Y R S P 231
781 TACGGACTTTATGCGGCATTTATGACCAATCTGTACTAATTCTCCAAACCAGTATTATTT
T D F M R H L * 238
841 CAATTATGGCACTTGGGAGTGGGGTGAGAGCTAAACATTGCACAGGGCAAAGAAAAAAAA
901 TAACTGCACTGACTTTATATCTTTTGAATATAATTACTGTGAAAGTATAAAGGCTGTGTT
961 CTGGAATTTTCTGCCTCACAGCAAATAAATAAGGTAGTGAATTAATTATTCATTCCATTC
1021 CACTATCATGAAGGACTCTGAATAGACTTGGCCAACTGATGTTTACAAACCAGACTTTTA
1081 TATTTTAATTTTACAGATTTTACTACATGATTTTTCTAAATTACTATGTCAGGTTGTAAA
1141 AGTCAGTGCAATAACAAACCTTCCTTTTTAAGAAGAAAATTGTTTCTATTACTTTCCCAT
1201 TCACTAGGTAAAGAATCATGGACAGAACTTACACTACTTTTTACCATGTTTCATCTTGGC
1261 ATAACATGGTTCTTTTTTAAATAGAAACTTTAGTTTTTTGTAAATTTTTAAAAAAATATT
1321 TCATTGATATGCATCTCTGCAGGTCCTCATTCATGTTGTAAATTTTTGCAGCAAGCAGTC
1381 AACATTCCACAAACGAACAAACATTATACCTCTTCTGATAGTTTTATTAAGCATGGAGAA
1441 ATTGCCAATTTTTAAAAACTGCAGTTTTCCAAACTTTTCTGCCAACCTCTTACTCTGAAT
1501 TCAGTGCTGCTTTGGGACATATACTTGACCTAGCTTGGTTTACCAGTGATGGAAAAGTAT
1561 TTTGATATCATTAACTTTTTCAAAAGATCCAACTTTTTCTCTATGCCTTTGCCACATTCT
1621 CTTCAGGGTCTCTTTCCACAGCGGATAAATGTTTTTTCTGTATTATGACAGTATTGTTGT
1681 GATGGCCATCTGCTGGAAACTCCTGAAGAGCATTATGTATTACAGTGAGCAGTTGTATTG
1741 CCTGTTTGGTGCCCAATGGTTAAGTCATTGTCACTTAGCTTTATATTGTCAGTTTGATAT
1801 TTATTTTAAATTGTGGAACTAGATGCATAAATTCACATTTCTGCCTTTCCTTTGCATCTT
1861 CTCATATATTGTGTTTTTTTTTTTTTTCCTAGAAAAAATATTTAAAGCATTGTTTGACAG
1921 GTAGAAACTCATGTATCTGTAGTCCATGAGTTATATCCTGGCTCAGTGGAGTGATATTTA
1981 TGTATTATTTTTACTTTTCTCTCAGTGTCTTATATTAAGATTAACATGTTGTTAATAGTT
2041 GCTTTGTTGATTAATCTCTCTTGTTGGTGTTTTAATAAATGAAATAGGCTTGCCTTTAGA
2101 TCGGGTGCTGATATTGCCTGTTTCCTAGTAATGGGCTGATCAAATGATCAGTGGAATTCT
2161 TGGTTTGATGATAACCTTATTAATTGAAATTTTTTACTGATGTGGCTTTAAAAGAGGTTT
2221 ATTTTGTATATGTTTAGAACTCTCTGATTTTGATGAATTATATGGGAGTGAGAAACAGAA
2281 GAAGTGGTATTTGCTGGCGAGTTAAATAGGCAAGGTACCCAGTGATAACACCAACCAAAC
2341 CACTCCTATCTGCATGATTCTGAACATCTGGATGCCTGTTGTTTTACTGTGTATATTTTA
2401 TTTTTAATATATTAACTTTGTGGATTCATTTAAGGTCTACTCAAAAGTAACACTGTCCAA
2461 ACCACTAATATGTATGTAAAAATTGTGCTGTATACTACAATAAAGTTGTTACTTGGATTT
2521 GTTCCAAAAAAAAAAAAAA
Abbildung 4-24 DNA- und abgeleitete Aminosäuresequenz von dd3f. Mögliche
Translations-Startkodons (ATG), ein Stopsignal (TGA) und
Konsensussequenzen für die Polyadenylierung (AATAAA) sind
unterstrichen.
Ergebnisse
82

Ergebnisse
Eine Analyse des abgeleiteten Proteins nach der Methode von Kyte und Doolittle
(1982) ergab innerhalb der Peptidsequenz sieben hydrophobe Bereiche, die jeweils
durch hydrophile Regionen voneinander getrennt sind (Abbildung 4-25 A). Die
Abbildung 4-25 B zeigt ein hypothetisches Modell für die Struktur des putativen
Proteins in Anlehnung an Strukturmodelle für Rezeptoren mit sieben Transmembran-
Segmenten.
Die dd3f-Nucleotidsequenz zeigt keine Homologie zu bekannten Genen. Wegen
struktureller Ähnlichkeiten wurde ein Vergleich der Aminosäuresequenz des
putativen dd3f-Proteins mit bekannten Sieben-Transmembrandomänen-Rezeptoren
durchgeführt (Attwood et al., 1991). Die gefundenen Sequenzhomologien zu G-
Protein-gekoppelten Rezeptoren waren allerdings sehr gering. Dem dd3f-Protein
fehlen typische Charakteristika (konservierte Aminosäuren, Glykosylierungsstellen,
Stellen für die G-Protein-Kopplung), die für Mitglieder dieser Rezeptorfamilie
beschrieben sind.
Ein Vergleich mit Konsensussequenzen ergab vier Phosphorylierungsstellen, zwei
davon für Kaseinkinase II (Positionen 24 und 230), eine für Proteinkinase C (Position
83) und eine für Thyrosinkinase (Position 151). Eine mögliche N-
Glykosylierungsstelle konnte an Position 173 gefunden werden, an Positionen 66 und
184 bestände theoretisch die Möglichkeit eine N-Myristinylierung.
Zur weiteren Charakterisierung des dd3f-Transkripts wurde der Expressionsverlauf
während der Makrophagenreifung und die Expression des Transkripts in
verschiedenen humanen Zellen und Geweben mit Hilfe von Northern-
Hybridisierungen untersucht. In Abbildung 4-26 und Abbildung 4-27 sind die
Autoradiographien dieser Hybridisierungen gezeigt. Das Signal für dd3f steigt
kontinuierlich im Laufe der Reifung an, ist also deutlich reifungsassoziiert. Starke
Signale konnten in Makrophagen, zwei myeloiden Zellinien (K562, THP-1), Plazenta
und einer Leberkarzinom-Zellinie (HepG2) detektiert werden. Etwas schwächer war
die Expression im Dickdarm, in der Haut, in zwei anderen myeloiden Zellinien (U937,
HL-60), einer Colonkarzinom Zellinie (HT-29) und Lymphozyten. Kein Signal konnte
in Monozyten, Leber, Hautfibroblasten, einer Keratinozytenzellinie (HaCat) und einer
Melanomzellinie (Mel-Im) nachgewiesen werden.
83

Zellmembran
Ergebnisse
Abbildung 4-25 Theoretische Strukturanalysen für das dd3f-Protein.
A. Hydrophobizitäts-Plot nach Kyte und Doolittle. Die sieben
potentiellen Transmembrandomänen sind von I - VII durchnummeriert.
B. Ein hypothetisches Strukturmodell für das dd3f-
Protein. Die intra- bzw. extrazelluläre Ausrichtung ist nicht bekannt.
Hydrophobe Aminosäuren sind schwarz, mögliche
Phosphorylierungsstellen grau eingezeichnet (Pos. 24, 83, 151, 230).
Die potentielle N-Glykosylierungsstelle ist mit einem Stern markiert.
84

Abbildung 4-26
Ergebnisse
Northern Hybridisierung mit dem klonierten
dd3f-PCR-Fragment gegen gesamt-RNA aus
frisch isolierten Monozyten (d0), ü.N.
adhärenten Monozyten (d1) und für 1 (d2), 3
(d4) und 7 (d8) Tage mit Serum kultivierte
Monozyten. Zur Kontrolle für die gleichmäßige
Beladung des Gels wurde ein 18Sspezifisches
Oligonukleotid als Sonde
verwendet.
Abbildung 4-27 Northern Hybridisierungen eines 1.5 kb EcoRI-Fragments von
dd3f mit Gesamt-RNA verschiedener humaner Gewebe und
Zellinien.
85

5 DISKUSSION
5.1 Charakterisierung von reifungsassoziierten
Oberflächenantigenen auf Makrophagen
Diskussion
Die vorliegenden Arbeit beschäftigt sich mit der Klonierung und Charakterisierung
von reifungsassozierten, makrophagenspezifischen Proteinen. Ausgangspunkt für die
im folgenden beschriebenen proteinchemischen Charakterisierungen waren
monoklonale Antikörper gegen reifungsassoziierte Oberflächenstrukturen, die auf
Makrophagen exprimiert werden.
Für einen Teil der Antikörper, die für eine Charakterisierung zur Verfügung standen
(MAX.1, 3, 11), war bereits früher beschrieben worden, daß sie Antigene erkennen,
die reifungsassoziiert auf Makrophagen exprimiert werden (Andreesen et al., 1986,
1988). Weitere monoklonale Antikörper mit dieser Eigenschaft wurden in der
Arbeitsgruppe in Zusammenarbeit mit D. Männel (Abt. für Tumorimmunologie des
Inst. für Pathologie, Universität Regensburg) erzeugt.
Die Identität der antigenen Strukturen war unklar. Eine Identifizierung der von diesen
Antikörpern detektierten Antigene war insbesondere in Hinsicht auf die funktionelle
Bedeutung, die sie für den reifen Makrophagen haben, von großem Interesse.
Im Vorfeld dieser Arbeit waren bereits Anstrengungen unternommen worden, die von
den Antikörpern MAX.1, MAX.11 und MAX.3 detektierten Antigene mit
molekularbiologischen Methoden (Expressionsscreening in prokaryontischen oder
eukaryontische Systemen) zu identifizieren. Diese Ansätze hatten aber nicht zum
Erfolg geführt. Deshalb wurde zur Charakterisierung und Identifizierung der
detektierten Proteine der klassische Weg über proteinchemische Methoden gewählt.
5.1.1 Identifizierung von Carboxypeptidase M auf Makrophagen
Die biochemische Charakterisierung ihrer Antigene lieferte bereits erste Hinweise auf
die Kreuzreaktivität der Antikörper MAX.1 und MAX.11 - beide Antikörper
präzipitierten ein GPI-verankertes Glykoprotein von 58-64 kDa, dessen
Molekulargewicht nach enzymatischer Deglykosylierung auf ca. 45 kDa sank. Da in
der Literatur keine entsprechenden Oberflächenantigene auf Makrophagen
86

Diskussion
beschrieben waren, wurde versucht, das von MAX.11 und MAX.1 markierte Antigen
aufzureinigen.
PI-PLC spaltbare Oberflächenmoleküle von in vitro differenzierten Makrophagen
dienten als Ausgangsmaterial für eine immunaffinitätschromatographische Reinigung
über MAX.11. Das gereinigte und angereicherte Protein konnte in Zusammenarbeit
mit Herrn Dr. R. Deutzmann (Lehrstuhl für Biochemie I, Universität Regensburg) Nterminal
ansequenziert werden. Durch Sequenzvergleiche in Gendatenbanken
konnte für die determinierte Sequenz eine 100%ige Homologie zu Carboxypeptidase
M (CPM) (Tan et al., 1989), einer membrangebundenen Ectopeptidase, festgestellt
werden.
Die Daten aus der biochemischen Charakterisierung (Molekulargewicht, GPI-Anker)
entsprechen den Literaturdaten über dieses Enzym (Skidgel et al., 1989; Tan et al.,
1989; Deddish et al., 1990). Auch die Tatsache, daß beide Antikörper die spezifische
Aktivität dieses Enzyms aus Membranpräparationen fällen konnten, bestätigte die
Identität des MAX.1/11-Antigens mit CPM.
Durch ältere immunhistochemische Untersuchungen von Makrophagen aus
verschiedenen Körperflüssigkeiten und durch im Rahmen der Arbeit durchgeführte
durchflußzytometrische Untersuchung der monozytären Differenzierung in vitro,
wurde gezeigt, daß die Antikörper MAX.1 und MAX.11 ein leicht unterschiedliches
Färbeverhalten aufweisen (Andreesen et al., 1986, 1988). Bei den durchgeführten
durchflußzytometrischen Untersuchungen scheint das von MAX.1 erkannte Epitop
auf CPM im Vergleich zu MAX.11 verzögert exprimiert zu werden. Durch
verschiedene Deglykosylierungsexperimente und Lektinbindungsversuche konnte
gezeigt werden, daß Glykane des komplexen Typs einen Großteil der auf CPM
exprimierten Zuckerstrukturen darstellen. Man nimmt an, daß die Expression
bestimmter Glykosyltransferasen, die für die Struktur und die räumliche Anordnung
der Glykane verantwortlich sind, abhängig ist vom Differenzierungsstadium der
Zellen. Für HL-60 z.B. ist eine Zunahme von biantennären und triantennären und
eine Abnahme von tetraantennären Glykanstrukturen im Laufe der PMA-induzierten
Differenzierung beschrieben worden (Mizoguchi et al., 1984). Eine
differenzierungsabhängige Glykosylierung von CPM wäre also eine mögliche
Erklärung für die unterschiedliche Reaktivität der Antikörper MAX.1 und MAX.11.
Durch die frühere Expression des von MAX.11 erkannten Epitops auf CPM korreliert
87

Diskussion
dieser Antikörper sicherlich besser mit der Anwesenheit und der Aktivität dieses
Enzyms, während MAX.1 wohl eher ein Marker speziell für reifere Makrophagen
darstellt.
Weitere Argumente für die Identität des von MAX.1 und MAX.11 erkannten
Glykoproteins mit CPM liefert ein Vergleich des beschriebenen Expressionsmusters
und der Aktivitätsverteilung in verschiedenen Geweben. Zusätzlich zur starken
Expression auf in vitro differenzierten Makrophagen konnten mit MAX.1 bzw. MAX.11
Strukturen in Niere, Plazenta, im oberen Gastrointestinaltrakt und schwächer in
lymphatischen Organen detektiert werden (Andreesen et al., 1988). Diese
Antigenverteilung entspricht der in der Literatur beschriebenen Verteilung der
enzymatischen Aktivität. Membrangebundene spezifische Aktivität für CPM ist in
Membranpräparationen verschiedener Gewebe (Plazenta, Lunge, Niere, Gehirn) und
kultivierter Zellinien nachgewiesen worden (Skidgel et al., 1984, 1989; Deddish et al.,
1990; Nagae et al. 1992, 1993).
Über die transkriptionelle Regulation der CPM-Expression gibt es bis jetzt noch keine
Daten. Im Vergleich zu gesunden Personen ist die sonst relativ niedrige CPM-
Expression auf Alveolarmakrophagen in Patienten mit aktiver Sarkoidose erhöht.
Makrophagen in den Granulomen solcher Patienten produzieren 1,25
Dihydroxyvitamin D3 (Adams et al., 1985). Das Vitamin könnte in diesem Fall für die
erhöhte CPM-Expression verantwortlich sein, da eine deutliche CPM-Expression
auch beobachtet wird, wenn Monozyten serumfrei in Gegenwart von 1, 25
Dihydroxyvitamin D3 in vitro differenziert werden (Kreutz et al., 1990).
Auch eine regulatorische Wirkung von T-Lymphokinen auf die CPM-Expression ist
denkbar. So wurde z.B. an der Niere gezeigt, daß bei Transplantatabstoßungsreaktionen
eine T-Zell Aktivierung für die Expression von CPM auf Makrophagen
nötig ist, da CPM nach Cyclosporin-Behandlung nicht auf Makrophagen detektiert
werden konnte (Andreesen et al., 1988b). Die Beeinflußung der Expression von CPM
auf tumorassoziierten Makrophagen deutet darauf hin, daß von Tumorzellen
produzierte Faktoren regulatorisch wirken können (Konur et al., 1996).
CPM zählt zur Familie der Carboxypeptidasen. Diese Enzyme spalten endständige
Aminosäuren am Carboxyterminus von Peptiden und Proteinen ab. Enzyme aus der
Gruppe der basischen Carboxypeptidasen (B, N, H, M, D) spalten speziell die beiden
basischen Aminosäuren Arginin und Lysin ab.
88

Diskussion
1958 wurde von Folk und Gladner die erste basische Carboxypeptidase aus
Rinderpankreas aufgereinigt. Das Verdauungsenzym wurde als Carboxypeptidase B
(EC 3.4.17.2) bezeichnet (B für Abspaltung von ´b´asischen Aminosäuren) und stellt
den Prototyp der spezialisierteren Carboxypeptidasen dar. Sein pH-Optimum liegt im
Neutralen (pH 6-8) und es enthält als Metalloenzym ein Zinkion in seinem aktiven
Zentrum. Im gesunden Organismus kommt dieses Enzym nur in Pankreas und
Dünndarm vor.
In den frühen 60er Jahren wurde von Erdös und Sloane im Blutplasma ein Enzym
entdeckt, das Bradykinin durch Abspaltung des C-terminalen Arginins inaktiviert.
Dieses Enzym wurde als Carboxypeptidase N (EC 3.4.17.3) bezeichnet. Der
tetramere Enzymkomplex besteht aus zwei kleineren aktiven Untereinheiten und
zwei inaktiven, glykosylierten Untereinheiten, die die aktiven Untereinheiten
stabilisieren und in der Zirkulation halten (Plummer and Hurwitz, 1978; Levin et
al.,1982). Das pH-Optimum dieser Carboxypeptidase liegt im Neutralen (pH 6-8).
Dieses Enzym wird in der Leber synthetisiert und sein Vorkommen beschränkt sich
auf das Blutplasma.
Von der Arbeitsgruppe Steiner wurde 1975 ein Carboxypeptidase B-ähnliches
Metalloenzym beschrieben, das aktives Insulin freisetzen konnte (Tager et al., 1975).
Es dauerte allerdings noch weitere 10 Jahre bis Carboxypeptidase H (EC 3.4.17.10)
von Fricker gereinigt und charakterisiert werden konnte (H für
´h´ormonprozessierend). Dieses Enzym findet man hauptsächlich in sekretorischen
Granula von Nebenniere, Hypophyse, im Gehirn und Pankreas. Im Gegensatz zu
den ersten beiden Carboxypeptidasen, die ein neutrales pH-Optimum haben, spaltet
dieses Enzym im Sauren (pH 5-6) am besten.
Skidgel et al. gelang 1989 die Aufreinigung und Charakterisierung der ersten
membranständigen basischen Carboxypeptidaseaktivität aus humaner Plazenta.
Dieses Enzym (Carboxypeptidase M, E.C. 3.4.17.12) ist, wie auch in dieser Arbeit
demonstriert werden konnte, über einen Phosphoinositol-Anker an die Zellmembran
gebunden (Dedish et al., 1990; Van der Schoot et al., 1989). Wie die anderen
Enzyme dieser Gruppe ist Carboxypeptidase M ein Metalloenzym, das ein Zinkion in
seinem aktiven Zentrum trägt und sein pH-Optimum im Neutralen (pH 6-8) hat. Seine
spezifische membrangebundene Aktivität konnte in verschiedenen humanen
Geweben (Plazenta, Niere, Lunge, Blutgefäße...) und einigen Zellinien (bestimmte
89

Diskussion
Endothelzell- oder Fibroblastentypen) nachgewiesen werden. Die PI-Verankerung
des Enzyms ermöglicht theoretisch eine Abspaltung durch Phospholipasen. Diese
Freisetzung scheint in vivo auch aufzutreten, da freies CPM in einigen
Körperflüssigkeiten (Bronchoalveoläre Lavage, Fruchtwasser, Urin) nachgewiesen
werden konnte (Marinkovic et al., 1980; Skidgel et al., 1984). Im Rahmen dieser
Arbeit konnte erstmals gezeigt werden, daß Makrophagen die Fähigkeit besitzen,
große Mengen an CPM auf der Oberfläche zu exprimieren. Makrophagen könnten
also in einigen Geweben die Hauptquelle für CPM darstellen.
In einer kürzlich publizierten Veröffentlichung beschreiben de Saint-Vis et al. (1995)
einen Antikörper (M27), der CPM markiert und, neben myeloiden Zellen, B-Zellen in
germinalen Zentren erkennt. Für die beiden Antikörper MAX.1 und MAX.11 ist eine
Färbung von B-Zellen nicht nachgewiesen worden. Es bleibt zu klären, ob die
angewandten Färbemethoden nicht sensitiv genug waren oder ob B-Zell-CPM, z.B.
wegen einer B-Zell-spezifischen Glykosylierung, durch die beiden Antikörper nicht
detektiert wird. Auch wurde von de Saint-Vis bisher nicht untersucht, ob
Makrophagen mit dem Antikörper M27 markiert werden können.
Es konnte also eindeutig geklärt werden, daß MAX.1 und MAX.11 das Enzym
Carboxypeptidase M auf der Oberfläche von Monozyten/Makrophagen erkennen und
daß die Expression und die Aktivität von CPM im Laufe der Differenzierung drastisch
ansteigt. Die Expression von CPM, markiert durch MAX.1 oder MAX.11, scheint
innerhalb der hämatopoetischen Zellen weitgehend auf Monozyten/Makrophagen
beschränkt zu sein.
Erst kürzlich wurden zwei weitere interessante Proteine beschrieben, die Homologien
zu basischen Carboxypeptidasen besitzen. He et al. (1995) identifizierten in
Adipozyten einen transkriptionellen Repressor, dessen intakte
Carboxypeptidaseaktivität Voraussetzung für seine repressorische Funktion ist.
Neben den beiden bisher beschriebenen Repressormechanismen - inaktive
Repression durch Kompetition oder Blockierung oder aktive Repression durch
unabhängige, direkte Wechselwirkung des Repressors mit an anderen Stellen
gebundenen Transkriptionsaktivatoren oder Cofaktoren - könnte es somit noch eine
dritte, mit einer enzymatischen Spaltung verknüpfte Form der Repression geben.
Von Kuroki et al. (1995) wurde ein Hepatitis B-bindendes Membranglykoprotein
(gp180) aus Entenleber gereinigt und kloniert. Aufgrund von Sequenzanalysen
90

Diskussion
konnten sie gp180 als neues Mitglied der Genfamilie der basischen
Carboxypeptidasen einordnen. Dieses Protein ist vermutlich das Enten-Homologe
zur Carboxypeptidase D, die kurz darauf von Song und Fricker (1995) aus
Rinderhypophyse gereinigt und charakterisiert wurde. Dieses membranständige
Enzym hat in Bezug auf Synthese-, Wirkungsorte und pH-Optimum ähnliche
Eigenschaften wie Carboxypeptidase H. Die humane Form der Carboxypeptidase D
wird in der Arbeitsgruppe von Skidgel charakterisiert und derzeit in Zusammenarbeit
mit unserer Arbeitsgruppe kloniert und sequenziert. Northern Analysen mit einer im
Rahmen dieser Arbeit präparierten RNA-Kinetik haben ergeben, daß die mRNA für
Carboxypeptidase D von Monozyten/Makrophagen exprimiert und im Laufe der
Differenzierung hochreguliert wird. Makrophagen besitzen also die Fähigkeit, sowohl
im sauren als auch im basischen Milieu auf der Zelloberfläche Arginin und Lysin von
Proteinen und Peptiden abzuspalten.
Es stellt sich die Frage, welche Funktionen CPM und CPD auf Makrophagen
ausüben können.
5.1.1.1 Carboxypeptidase M (und D) auf Makrophagen -
Mögliche Funktionen und Substrate
Die größte Bedeutung der basischen Carboxypeptidasen liegt wahrscheinlich in ihrer
Fähigkeit, durch Abspaltung von endständigem Lysin oder Arginin die Aktivität von
Peptidhormonen zu beeinflussen (Skidgel, 1988). Bei der Synthese von biologisch
aktiven Peptiden werden in einigen Fällen (Enkephaline, Insulin, Substanz P) aus
Proteinvorstufen durch Proteasen Peptide erzeugt, die ihre Aktivität erst nach
Abspaltung eines endständigen Arginins entfalten. Andere biologisch aktive Peptide
wie z.B. Anaphylatoxin C3a, Fibrinopeptide oder Kinine werden durch die Entfernung
des endständigen Arginins inaktiviert (Skidgel, 1988). Aufgrund der katalytischen
Eigenschaften dieser Enzymfamilie ist eine große Anzahl von Peptid- oder
Proteinsubstraten für basische Carboxypeptidasen denkbar (s.Tabelle 5-1). Die Rolle
von CPM und CPD auf Makrophagen wird in vivo von ihren Wirkungsorten und den
dort vorhandenen Substraten abhängen.
Die zur Zeit verfügbaren Daten über mögliche Substrate sind noch unvollständig.
Auch existieren nur wenig Literaturdaten über die Wirkung von Peptidhormonen auf
Zellen des Immunsystems.
91

Diskussion
Wie in Tabelle 5-1 gezeigt, besitzen eine Reihe von Wachstumsfaktoren Arginin oder
Lysin am Carboxyterminus. Eine Entfernung dieser basischen Aminosäuren
verändert die physikalischen Eigenschaften dieser Proteine. Ob sich allerdings auch
die biologische Wirkung ändert, ist bis heute nicht untersucht worden.
Die Prozessierung der in Tabelle 5-1 aufgeführten Peptidhormone ist meist
mehrstufig und beinhaltet komplexe regulatorische Vorgänge, die nur zum Teil
verstanden sind. Die Aktivierung der Peptide kann sich in intrazellulären
Kompartimenten (z.B. Insulin in sekretorischer Granula) oder extrazellulär abspielen
(z.B. Kinine im Plasma). Die Freisetzung der aktiven Hormone in vivo hängt von
einem Zusammenspiel von Proteasen, Peptidasen und entsprechenden
Hormonvorstufen ab.
Substrat C-term. Aminosäure-
sequenz
Bradykinin - - - -Pro-Phe-Arg
Anaphylatoxin C3a
Anaphylatoxin C4a
Anaphylatoxin C5a
Enkephalin a
Hexapeptide b
c
d
- - - -Leu-Ala-Arg
- - - -Leu-Gln-Arg
- - - -Leu-Gly-Arg
- - - -Phe-Met-Arg
- - - -Phe-Met-Lys
- - - -Phe-Leu-Arg
- - - -Phe-Leu-Lys
α-Neoendorphin - - - -Tyr-Pro-Lys
Dynorphin A - - - -Lys-Leu-Lys
Fibrinopeptid 6A - - - -Pro-Ala-Lys
Fibrinopeptid 6D - - - -Glu-Trp-Lys
Fibrinopeptid A - - - -Gly-Val-Arg
Fibrinopeptid B - - - -Ser-Ala-Arg
β-Preprotachykinin - - - -Gly-Lys-Arg
Atriopeptin II - - - -Ser-Phe-Arg
Cardiodilatin - - - -Ala-Gly-Arg
Albumin Propeptid - - - -Phe-Arg-Arg
Protamin - - - -Arg-Arg-Arg
Calmodulin - - - -Lys
Komplementfaktor Ba - - - -Gln-Lys-Arg
Creatinkinase - - - -Lys
Enolase - - - -Lys
Renin - - - -Leu-Ala-Arg
Substrat C-term. Aminosäuresequenz
Erythropoietin - - - -Gly-Asp-Arg
Epidermal growth factor
(EGF)
EGF-like protein 1
EGF-like protein 2
EGF-like protein 3
EGF-like protein 4
EGF-like protein 5
EGF-like protein 6
EGF-like protein 7
- - - -Glu-Leu-Arg
- - - -Asp-Gly-Lys
- - - -Asp-Gly-Lys
- - - -Asp-Arg-Lys
- - - -Asp-Gly-Lys
- - - -Leu-Ala-Arg
- - - -Cys-Gln-Arg
- - - -Leu-Asp-Arg
Amphiregulin
Hepatozyten Wachstums-
- - - -Gly-Glu-Lys
faktor (α-Kette)
Macrophage stimulating
- - - -Gln-Leu-Arg
protein (MSP)
- - - -Glu-Thr-Lys
Nerve growth factor (NGF)
Brain derived neutrotrophic
- - - -Ala-Val-Arg
factor
Vascular endothelial growth
- - - -Arg-Val-Arg
factor (VEGF)
- - - -Pro-Arg-Arg
Hemoregulatory peptide - - - -Asp-Cys-Lys
PDGF (α-Kette) - - - -Asp-Val-Arg
Tuftsin Thr-Lys-Pro-Arg
Tabelle 5-1 Natürlich vorkommende Peptide und Proteine, die als Substrate für
basische Carboxypeptidasen in Frage kommen.
Das biologisch aktive Peptid trifft nach seiner Generierung auf eine Vielzahl von
degradierenden Enzymen und hat meist nur eine geringe Halbwertszeit. Die rasche
Deaktivierung wird als Schutz vor anhaltenden biologischen Effekten der
Peptidhormone angesehen. Freie Proteasen (z.B. CPN) wirken dabei eher
systemisch, während membrangebundene Enzyme wie z.B. CPM oder CPD die
92

Diskussion
Aktivität eines Peptids - vor oder nach Bindung an seine Rezeptoren - direkt auf der
Oberfläche einer einzelnen Zelle beeinflussen können (Skidgel et al., 1988).
Die Art und Menge der degradierenden Enzyme ist wahrscheinlich sowohl unter
normalen als auch pathophysiologischen Bedingungen für einen ausgewogenen,
kontrollierten Effekt von biologisch aktiven Peptiden zuständig.
Gerade in Geweben könnten Makrophagen in der Balance zwischen
Peptidaktivierung und -degradierung eine wichtige Funktion übernehmen. Neben der
Sekretion von löslichen proteolytischen Enzymen (z.B. Typ IV Collagenase, s.a.
Kapitel 5.2) können Makrophagen, neben CPM und CPD, eine Reihe von membranverankerten
Peptidasen und Proteasen exprimieren. In Tabelle 5-2 sind in einer
kurzen Übersicht solche membranständige proteolytische Enzyme aufgeführt, die auf
Monozyten, Makrophagen oder monozytären Zellinien gefunden wurden. Diese
Enzyme sind z.T. gut charakterisiert (CD13, CD26,...), z. T. aber auch nur durch ihre
enzymatische Aktivität definiert.
Enzym bekannte Substrate Spaltstelle Literatur
Carboxypeptidase M Bradykinin, Opioide -X-X-X-X-↓-(K,R)-COOH s. Text
(CPM)
Peptide, Substanz P,...
Aminopeptidase N
(APN/CD13)
Opioide Peptide, fMLP,
Enkephaline
NH2-(A,F,Y,L,O,P)-
↓-X-X-X-X
Griffin et al, 1981, 1983
Dipeptidylpeptidase
IV (DPPIV/CD26)
Substanz P, TNF-α NH2-X-(D,E)-↓-X-X-X- Bauvois et al., 1992
Angiotensin-
Angiotensin, Kinine, X-X-(↓)-X-↓-X-X-COOH* Rohrbach, 1984;
converting enzyme Bradykinin, Substanz P,
Rohrbach and Conrad,
(ACE)
fMLP,
1991
Aminopeptidase B -
Aktivität
Angiotensin,
Thymopentin
NH2-( K,R)-↓-X-X-X- Talmadge et al., 1990
Tripeptidylpeptidase-
Aktivität
TNF-α NH2-A-A-F-↓-X-X-X Bauvois et al., 1992
Tabelle 5-2 Membranständige Proteasen und Peptidasen auf
Monozyten/Makrophagen (* Die Spaltstelle von ACE ist nicht genau
definiert, beschrieben ist die Freisetzung von C-terminalen Di- oder
Tripeptiden)
5.1.1.2 Biologisch aktive Peptide - Regulationsmechanismen und die
Rolle der basischen Carboxypeptidasen
Im Folgenden werden mögliche Zusammenhänge zwischen Makrophagen, ihren
membrangebundenen Peptidasen und einigen wichtigen Peptidhormonen diskutiert.
93

Diskussion
Peptidhormone sind an vielen regulatorischen Prozessen des Körpers beteiligt.
Neben ihrer Bedeutung bei normalen physiologischen Abläufen, spielen sie eine
besondere Rolle bei inflammatorischen Prozessen (z.B. Kinine, Anaphylatoxine).
Auch als Vermittlersubstanzen zwischen Nerven- und Immunsystem scheinen
gewisse Peptide eine große Rolle zu spielen.
5.1.1.2.1 Makrophagen und der Metabolismus von neuroendokrinen
Peptidhormonen und Neurotransmittern
Es gibt vermehrt Hinweise, daß bestimmte Zytokine, Peptidhormone,
Neurotransmitter, und ihre Rezeptoren im Endokrin-, Nerven- und Immunsystem gemeinsam
genutzt werden. Die verschiedenen Systeme können sich wahrscheinlich
durch diese „gemeinsame Sprache“ gegenseitig beeinflussen (Blalock, 1994).
Makrophagen können induzierbar eine Reihe von Hormonen und Neurotransmittern
synthetisieren, beschrieben ist bis jetzt die Expression von Cortikotrophin
(adrenocorticotropes Hormon, ACTH), Endorphinen, Enkephalinen und Substanz P
(Martin et al., 1987; Blalock, 1992, 1994).
Ein Teil dieser Neuropeptide (ACTH, Substanz P) verlieren im Laufe der
intrazellulären Prozessierung ihrer Vorläuferpeptide C-terminale Arginin- oder Lysin-
Reste (Rehfeld Jakobsen and Schwartz, 1990). Ob CPM, oder eventuell CPD, bei
der Prozessierung dieser Peptide im Makrophagen eine Rolle spielt, ist noch nicht
untersucht.
Auch im Falle der Enkephaline kann im Laufe der Prozessierung eine Abspaltung
von endständigem Arginin oder Lysin durch eine basische Carboxypeptidase
erfolgen (Skidgel, 1988). Für diese opioiden Peptide werden unterschiedliche
Rezeptorspezifitäten für die Hexapeptide und die des-Arg-Pentapeptide beschrieben.
Erstere scheinen eine höhere Affinität für κ-Opioidrezeptoren zu besitzen, die
Pentapeptide ohne die C-terminale basische Aminosäure binden besser an δ- und µ-
Opioidrezeptoren (Magnan et al., 1982). Über die Wirkung der einzelnen Enkephaline
auf Zellen des Immunsystems gibt es noch wenig gesicherte Daten. Im Falle der
Makrophagen wurden für Enkephaline in vitro Effekte auf die antikörperabhängige
Zytotoxizität (Foris et al., 1984, 1986), die LPS-induzierte IL-1-Sekretion (Yang und
Li, 1989; Apte et al., 1990) und die Freisetzung von reaktiven
Sauerstoffverbindungen (Willems et al., 1988; Effanov et al., 1994) beschrieben.
Diese Effekte waren z.T. gegensätzlich und varriierten, abhängig von der
94

Diskussion
eingesetzten Konzentration und dem Testsystem, stark (Foris et al., 1986). In vivo
wirken Enkephaline, wie alle anderen opioiden Peptide, eher immunsuppressiv
(Marotti et al., 1993).
In Abbildung 5-1 ist in einer schematischen Übersicht der Metabolismus von
Enkephalinen im Zusammenhang mit Makrophagen dargestellt. Neben CPM kann
auch eine weitere Peptidase auf der Oberfläche der Makrophagen an der
Prozessierung von Enkephalinen teilnehmen. Aminopeptidase N (CD13) spaltet eine
Aminosäure vom N-Terminus dieser Peptidhormone und deaktiviert sie auf diese
Weise (Miller et al., 1994). Interessanterweise scheinen zwei andere Peptidhormone
(Substanz P, Bradykinin) dieses Enzym kompetitiv zu blockieren (Xu et al., 1995).
Diese Tatsache verdeutlicht die Komplexität regulatorischer Abläufe im Metabolismus
von biologisch aktiven Peptiden.
Abbildung 5-1 Schematische Darstellung der auf der Makrophagenoberfläche
möglicherweise stattfindenden Stoffwechselvorgänge von
Enkephalinen. Enkephalin Hexapeptide verändern nach Abspaltung
von Arginin durch CPM ihre Rezeptorspezifität. Parallel dazu können
Enkephaline durch eine weitere Peptidase auf Makrophagen
deaktiviert werden (Aminopeptidase N, APN, CD13).
5.1.1.2.2 Makrophagen und der Metabolismus von Kininen
Kinine (Bradykinin, Lys-Bradykinin und Met-Lys-Bradykinin) sind vasoaktive Peptide,
die eine Vielzahl biologischer Prozesse beeinflussen. Kinine wirken
blutdrucksenkend, erhöhen die vaskuläre Durchlässigkeit, verursachen
Schmerzempfindung, kontrahieren die glatte Muskulatur der Bronchien, des Darms
und der Gebärmutter und erhöhen die Motilität von Spermien. Auf zellulärer Ebene
fördern Kinine den Transport von Chloridionen und Glukose, setzen Neurotransmitter
frei (z.B. Substanz P), aktivieren Phospholipase A2 und können mitogen wirken
95

Diskussion
(Bhoola et al., 1992). Vor allem bei entzündlichen Prozessen spielen sie
wahrscheinlich eine wichtige Rolle. Bei der Applikation von Bradykinin in humane
Haut werden alle Zeichen und Symptome einer Entzündung beobachtet
(Schmerzempfinden, Ödembildung, Infiltration von Lymphozyten) (Ferreira, 1972).
Auf gewisse Reize (z.B. Verletzungen) werden Kinine aus Vorläuferproteinen
(Kininogene) durch bestimmte Serinproteasen (Kallikreine) freigesetzt (Müller-Esterl,
1989). Kallikreine werden in glandulären Zellen und Neutrophilen gefunden und
kommen ubiquitär in biologischen Flüssigkeiten vor (Frey et al., 1950, Bhoola et al.,
1979).
Bradykinin bindet als komplettes Nonapeptid an den sog. BK2-Rezeptor, der für die
meisten der oben beschriebenen biologischen Wirkungen verantwortlich gemacht
wird (Bhoola et al., 1992). Die des-Arg-Form bindet dagegen an den sog. BK1-
Rezeptor, der z.B. auf Makrophagen exprimiert wird (Tiffany and Burch, 1989).
Makrophagen aus Mäusen reagieren auf des-Arg-Bradykinin über den BK1-Rezeptor
mit der Sekretion von IL-1 und TNF-α (Tiffany and Burch, 1989).
Die Abspaltung von C-terminalem Arginin durch Carboxypeptidase M führt bei
Kininen also zu einer veränderten Rezeptorspezifität und damit zu einem veränderten
Wirkungsspektrum (Roberts, 1989). Ein vereinfachtes Schema des Bradykinin-
Metabolismus im Zusammenhang mit Makrophagen ist in Abbildung 5-2 gezeigt.
In der Lunge führt die Freisetzung von Bradykinin in hohen Konzentrationen zu
drastischen Gefäßerweiterungen und zur Verengung der Bronchien (Collier et al.,
1960). CPM (auf Typ I Pneumozyten und Alveolarmakrophagen) schützt zusammen
mit zwei weiteren membrangebundenen Peptidasen („angiotensin converting
enzyme“ (ACE) und neutraler Endopeptidase (NEP)) die Alveolen vor diesen
Effekten des Bradykinins, die über den BK2-Rezeptor vermittelt werden (Chodimella
et al., 1991; Desmazes et al., 1992; Dragovic et al., 1993).
In entzündlichen Prozessen sind eine Vielzahl von Effekten denkbar. Die Wirkung
von Bradykinin auf neuronale Zellen sollte durch CPM abgeschwächt werden, da
durch die Abspaltung des endständigen Arginins die über den BK2-Rezeptor
vermittelte Effekte in den Hintergrund treten. CPM-positive Makrophagen konnten
verstärkt bei entzündlichen Darmerkrankungen, bei chronischen
Gelenkentzündungen und einigen chronischen Erkrankungen der Atemwege
(Sarkoidose, exogen allergische Alveolitis) gefunden werden (Andreesen et al.,
96

Diskussion
1988b). Bei diesen und ähnlichen pathophysiologischen Vorgängen wird eine
besondere Rolle der Kinine diskutiert (Christiansen et al., 1987; Lerner et al., 1987).
Abbildung 5-2 Schematische Darstellung des Bradykininmetabolismus auf der
Oberfläche von Makrophagen. Bradykinin wird durch CPM in des-
Arg-Bradykinin umgewandelt, das dann an den BK1-Rezeptor binden
kann. Parallel dazu können beide Kinine durch ACE, einer weiteren
Peptidase, die von Makrophagen exprimiert werden kann, gespalten
und damit inaktiviert werden.
Auch im Zusammenhang mit Tumorprogression und Metastasierung könnte Kininen
eine besondere Bedeutung zukommen. Die mitogenen Effekte könnten die
Proliferation von entarteten Zellen fördern (Goldstein et al., 1984). Die
vasodilatorische Wirkung der Kinine könnte Tumorzellen den Zutritt in die Zirkulation
erleichtern und dadurch die Metastasierung fördern. Erhöhte Kininspiegel wurden
z.B. in der Aszitesflüssigkeit von Patienten mit Ovarial-, Lebr und Darmkarzinomen
gefunden (Matsumara et al., 1988, 1990). Gerade dieser letzte Effekt erscheint
besonders interessant, da innerhalb der Arbeitsgruppe gezeigt werden konnte, daß
bestimmte Tumorzellen die Fähigkeit besitzen, die Expression von CPM auf
tumorassoziierten Makrophagen zu unterdrücken (Konur et al., 1996). In diesen
Tumorgeweben würde freigesetztes Bradykinin wahrscheinlich nur langsam in des-
Arg-Bradykinin konvertiert und würde eher durch den BK2-Rezeptor vermittelte
Effekte ausüben, zu denen auch die gefäßerweiternde und -permeabilisierende
Wirkung gezählt wird (Bhoola et al., 1992).
97

Diskussion
5.1.1.2.3 Makrophagen und der Metabolismus von Anaphylatoxinen
Anaphylatoxine sind pharmakologisch aktive Peptide, die bei der
Komplementaktivierung entstehen. Sowohl bei der Aktivierung über den klassischen
als auch über den alternativen Weg werden sie aus der α-Kette von C3, C4 und C5
abgespalten (C3a, C4a, C5a). Die Anaphylatoxine (insbesondere C5a) werden als
wirksame Entzündungsmediatoren betrachtet - ihre physiologische Rolle scheint die
Rekrutierung von inflammatorischen Zellen zum Entzündungsherd und die
Aktivierung ihrer Effektorfunktionen zu sein (Walport, 1996).
Besonders C5a ist ein starker Aktivator für alle Zellen der myeloiden Linie. Es wirkt
chemokinetisch und chemotaktisch auf Monozyten/Makrophagen und Neutrophile.
C5a bewirkt die Degranulation und Freisetzung intrazellulärer Enzyme, verstärkt den
Arachidonsäuremetabolismus (Produktion von Prostaglandinen und Eicosanoiden),
stimuliert die Produktion von toxischen Sauerstoffmetaboliten und induziert in
Monozyten die Synthese von IL-1 und IL-6. Zusätzlich bewirkt C5a die Freisetzung
von Histaminen aus Basophilen und Mastzellen und steigert die Permeabilität der
Blutgefäße (Walport, 1996).
In der Zirkulation werden die Anaphylatoxine innerhalb kürzester Zeit durch CPN in
ihre des-Arg-Derivate umgewandelt, ihre Wirkungen werden dadurch aufgehoben
oder stark abgeschwächt. Lediglich die chemotaktische Fähigkeit von des-Arg-C5a
scheint erhalten zu bleiben (Okamoto et al., 1986). Eine Begrenzung des weiten
Wirkungsspektrums von in Geweben freigesetzten Anaphylatoxinen könnte durch
CPM (oder CPD) auf Makrophagen erfolgen.
5.1.1.2.4 Makrophagen und der Metabolismus von L-Arginin
Eine der beiden Aminosäuren, die von CPM freigesetzt werden, L-Arginin, ist die
Ausgangssubstanz von einigen Stoffwechselwegen in Makrophagen, die für
Wundheilungsprozesse (Albina et al., 1990) oder auch Tumorwechselwirkungen
(Mills et al., 1992) von Bedeutung sein könnten. L-Arginin wird normalerweise im
Harnstoffzyclus aus Glutamat über Ornithin synthetisiert. Der größte Teil des
gebildeten Arginins wird allerdings unter Bildung von Harnstoff wieder gespalten, ein
Prozess, der den Argininvorrat sehr gering hält (Lehninger et al., 1994). Für ihr
Wachstum benötigen z.B. junge Säugetiere größere Mengen an Aminosäuren.
98

Diskussion
Arginin wird dann zu einer essentiellen Aminosäure. Auch bei
Wundheilungsprozessen oder in Tumorgewebe wird ein erhöhter Metabolismus von
L-Arginin beobachtet (Albina et al, 1990; Mills et al., 1992).
Auf der einen Seite ist L-Arginin die Ausgangsubstanz für die intrazelluläre Synthese
von NO durch NO-Synthase. Dieses kurzlebige Radikalgas wirkt als Neurotransmitter
(Moncada et al., 1991) und ist als Botenmolekül an der Regulation des Blutdrucks
beteiligt (Ignarro et al., 1987). Die großen Mengen NO, die von einer induzierbaren
NO-Synthase produziert werden können, werden für einige zytotoxische Effekte von
Makrophagen verantwortlich gemacht (Hibbs et al., 1988). Diese Funktion wird vor
allem im Zusammenhang mit der Abwehr von intrazellulären Mikroorganismen
(Evans et al., 1993), Pilzen (Adams et al., 1991), aber auch von Tumorzellen
(Lorsbach et al., 1993) diskutiert.
Auf der anderen Seite kann L-Arginin intra- und extrazellulär durch Arginase in L-
Ornithin umgewandelt werden. L-Ornithin kann wiederum über Ornithindecarboxylase
in Polyamine oder über Ornithinaminotransferase in L-Prolin umgewandelt werden
(Shih, 1981). Polyamine sind Mediatoren des Zellwachstums und L-Prolin ist eine
wichtige Aminosäure für die Collagensynthese. Beide Faktoren könnten bei der
Wundheilung (Albina et al., 1990) eine wichtige Funktion haben, in entartetem
Gewebe allerdings auch das Tumorwachstum fördern (Mills et al., 1992).
Im Falle einer L-Arginin-Depletion durch verstärkten Metabolismus in der
Wundheilung könnte L-Arginin, neben seinem normalen Syntheseweg über Ornithin,
auch über die Abspaltung aus Peptiden durch Carboxypeptidase M oder D für einen
der drei beschriebenen Reaktionswege zur Verfügung gestellt werden. In Abbildung
5-3 ist ein möglicher, hypothetischer Zusammenhang zwischen NO-induzierter
Cytotoxizität und Carboxypeptidase M auf Makrophagen dargestellt.
99

-Arg
CPM
NO
iNOS
L-Arg
L-Arg
L-Citrullin
Arginase
Arginase
Ornithin
+
Harnstoff
Diskussion
Abbildung 5-3 Übersicht über verschiedene Stoffwechselwege und Metaboliten von
L-Arginin im Zusammenhang mit Makrophagen und CPM. L-Arginin
wird im Harnstoffzyklus erzeugt, durch Arginase aber relativ schnell
wieder in Ornithin und Harnstoff gespalten. Extrazellulär durch CPM
abgespaltenes Arginin könnte einen niedrigen Argininspiegel im
Makrophagen ausgleichen.
5.1.2 Molekularbiologische Charakterisierung von
Carboxypeptidase M auf Makrophagen
Ornithin
+
Harnstoff
Polyamine
zellul re Proliferation
DNA und RNA Synthese
L-Prolin
Collagensynthese
Makrophagen exprimieren CPM besonders stark nach Serum-induzierter in vitro
Differenzierung. Die Expression in vivo scheint abhängig vom Gewebe und vom
Aktivierungszustand des Makrophagen zu sein.
Zur weiteren Untersuchung von Regulationsmechanismen wurde mit der
Charakterisierung und Klonierung der CPM-mRNA und des Promotors begonnen.
Die veröffentlichte cDNA-Sequenz umfaßt nur einen Teil der gesamten CPM-mRNA,
im Northernblot ist ein deutlich größeres mRNA Transkript detektierbar (Tan et al.,
1989). Durch RACE-PCR wurde das 5´-Ende der mRNA eingegrenzt, die erhaltenen
Fragmentgrößen entsprachen der Länge der veröffentlichten Sequenz. Die fehlende
Sequenzinformation ist also im 3´-Ende zu suchen. Unterstützt wurde diese These
durch das Fehlen eines Konsensus-Polyadenylierungssignals vor dem detektierten
poly(A)-Schwanz und der, bis jetzt noch nicht bekannten, Anwesenheit einer Alu-
Sequenz am 3´-Ende der mRNA. Versuche, weitere Sequenzinformationen über
RACE-PCR-Methoden zu erhalten, sind bis jetzt fehlgeschlagen. Die poly(A)-reiche
Region am 3´-Ende des Alu-Repeats scheint eine vollständige reverse Transkription
100

Diskussion
mit Oligo(dT)-Primern vom wirklichen poly(A)-Schwanz effektiv zu verhindern. Da
sich der 3´-untranslatierte Bereich vieler mRNAs auf einem Exon befindet, ist die
Wahrscheinlichkeit groß, daß die restliche Sequenzinformation bei der geplanten
Charakterisierung des CPM-Gens gefunden wird. Der Charakterisierung des Gens
und die Klonierung des Promotors wird derzeit in Zusammenarbeit mit Herrn Dr. R.
Skidgel (Dept. of Pharmacology, Chicago) durchgeführt. Promotoranalysen sollen
Hinweise auf mögliche Transkriptionsmechanismen in Monozyten/Makrophagen
liefern.
5.1.3 Charakterisierung weiterer reifungsassoziierter
Oberflächenantigene
Drei weitere monoklonale Antikörper wurden im Laufe der vorliegenden Arbeit näher
charakterisiert. Die Strategie, die letztlich zur Identifizierung der entsprechenden
Antigene führen sollte, war prinzipiell dieselbe wie im Falle der Antikörper MAX.1 und
MAX.11. Immunpräzipitationen sollten erste Anhaltspunkte liefern. Falls nötig sollten
die Antigene über Immunaffinität gereinigt und NH2-terminal ansequenziert werden.
Unbekannte Proteine sollten dann mit Hilfe molekularbiologischer Techniken kloniert,
sequenziert und weiter charakterisiert werden.
5.1.3.1 Identifizierung eines weiteren Antikörpers gegen
Carboxypeptidase M und eines Antikörpers gegen den
Komplementrezeptor CR4
Im Falle der beiden in der Arbeitsgruppe erzeugten Antikörper 7A2 und 8H8 lieferten
die Daten aus der Immunpräzipitation ausreichend Informationen für eine rasche
Identifizierung über Präzipitationsexperimente. Der Antikörper 7A2 zeigte nach
Fällung ein ähnliches Bandenmuster wie die beiden Antikörper MAX.1 und MAX.11.
Nachdem die Messung der CPM-Aktivität im Labor bereits etabliert worden war,
konnte gezeigt werden, daß auch dieser Antikörper einen großen Teil der
membrangebundenen spezifischen Carboxypeptidaseaktivität fällen konnte. CPM
scheint also ein sehr immunogenes Antigen zu sein.
Der Antikörper 7A2 ist also ein weiterer Antikörper gegen CPM. Wie
proteinchemische Untersuchungen ergaben, erkennt der Antikörper keine
denaturierten, geblotteten Proteine und eignet sich somit nicht für Western-Analysen.
101

Diskussion
Auch konnte keine Wechselwirkung zwischen Antikörperbindung und aktivem
Zentrum festgestellt werden. Wie MAX.1 und MAX.11 hat der Antikörper keine
Enzym-blockierende
Untersuchungen.
Wirkung, eignet sich somit nicht für funktionelle
Der Antikörper 8H8 färbt im Zell-ELISA und in der Durchflußzytometrie
reifungsassoziiert Makrophagen. Monozyten werden nicht gefärbt und die Expression
des Antigens wird im Laufe der Zeit hochreguliert.
Das von 8H8 detektierte Antigen konnte auf ähnliche Art und Weise wie 7A2
identifiziert werden. Das Bandenmuster nach Immunpräzipitation entsprach
weitgehend dem des Anti-CD11c Antikörpers Leu-M5. Eine Kreuzreaktivität der
beiden Antikörper konnte durch immunaffinitätschromatographische Reinigung von
8H8-Antigen und anschließende Präzipitation durch den Anti-CD11c Antikörper
gezeigt werden.
Die beiden Hauptbanden nach der Fällung entsprechen den beiden Ketten des
Komplementrezeptors CR4 (p150-95, CD11c/CD18), einem Adhäsionsmolekül aus
der Familie der β2-Integrine. CR4 bindet Ca 2+ -abhängig iC3b und Fibrinogen und
spielt bei der Adhäsion von Monozyten und Neutrophilen auf Endothelzellen eine
Rolle (Walport, 1996). Die Tatsache, das Monozyten sich mit dem Antikörper 8H8 im
Gegensatz zum Anti-CD11c Antikörper LeuM5 nicht anfärben lassen, deutet darauf
hin, daß das vom Antikörper erkannte Epitop erst im Laufe der Differenzierung
erzeugt wird. Ein möglicher Grund wäre z.B. eine wie in Kapitel 5.1.1 diskutierte
differentielle Glykosylierung des Antigens. Dieses Phänomen wurde allerdings nicht
weiter untersucht.
5.1.3.2 Charakterisierung des vom Antikörper MAX.3 detektierten
Antigens
Der monoklonale Antikörper MAX.3 fällt aus Makrophagenlysaten ein Glykoprotein
von ca. 60-80 kDa. Nach enzymatischer Deglykosylierung blieb ein Proteingerüst von
45 kDa bestehen. Anhand dieses Präzipitationsmusters konnten für MAX.3 auf
Makrophagen in der Literatur keine Kandidaten für eine mögliche Identität gefunden
werden. Die Aufreinigung aus Makrophagenlysaten erwies sich als problematisch, da
die aufgereinigten Mengen aufgrund der inhomogenen Glykosylierung nur schwer
102

Diskussion
detektierbar waren. Eine durch Deglykosylierung erreichte Ankonzentrierung war
wegen der Komigration von Aktinverunreinigungen in SDS-Gelen ungeeignet.
Eine Kreuzreaktivität mit Megakaryozyten und Thrombozyten war für MAX.3 bereits
beschrieben worden (Andreesen et al., 1986). Nach Immunpräzipitationen stellte sich
heraus, daß das MAX.3-Antigen auf Thrombozyten im Gegensatz zu dem des
Makrophagen ein deutlich verringertes Molekulargewicht (58-62 kDa) aufweist. Beide
Antigene besitzen nach enzymatischer Deglykosylierung das gleiche
Molekulargewicht (45 kDa). Diese Tatsache deutet darauf hin, daß ein vermutlich
identisches Proteingerüst von den zwei Zelltypen unterschiedlich glykosyliert wird.
Dieses Phänomen wurde für andere Antigene (z.B. CD43, GLUT1) bereits
beschrieben (Ellies et al., 1994; Kumagai et al., 1994).
Das Thrombozytenantigen wurde daraufhin in Zusammenarbeit mit Herrn S. Heinz im
Rahmen seiner Diplomarbeit aufgereinigt und von Herrn Dr. R. Deutzmann (Lehrstuhl
für Biochemie I, Universität Regensburg) ansequenziert. Mit der erhaltenen Sequenz
konnte in aktuellen Protein- und Gendatenbanken keine Homologie zu bekannten
Proteinen identifiziert werden. Derzeit wird versucht, mit Hilfe verschiedener
molekularbiologischer Techniken über degenerierte Oligonukleotide eine passende
cDNA aus Makrophagen-RNA zu isolieren.
Die Hauptmembrankomponenten auf Thrombozyten sind relativ gut charakterisiert
(Nurden et al., 1986). Literraturrecherchen ergaben ein Kandidatenprotein für das
MAX.3-Antigen, das allerdings nur schlecht beschrieben ist: Glykoprotein VI (GPVI).
Dieses Thrombozyten-Membranglykoprotein ist bis heute lediglich durch sein
Molekulargewicht (61 kDa) und sein Migrationsverhalten in zweidimensionaler
Gelelektrophorese definiert (Nurden et al., 1986). Diskutiert wurde eine Identität von
GPVI mit einem Membranprotein auf Thrombozyten, das durch seine Affinität zu Typ
I bzw. Typ III Collagen charakterisiert ist (Chiang und Kang, 1982; Kotite und
Cunningham, 1986; Moroi et al., 1989; Arai et al., 1995). Die aufgereinigten Mengen
an MAX.3-Antigen waren allerdings bis jetzt noch zu gering, um eine
Wechselwirkung mit den oben genannten Collagentypen zu untersuchen.
Die Klonierung einer cDNA und die Ableitung einer möglichen Primärstruktur des
Antigens ist in der Fortführung dieser Arbeit angestrebt. Dies soll weitere wichtige
Informationen für die funktionelle Bedeutung vom MAX.3-Antigen auf Thrombozyten
und Makrophagen liefern.
103

5.2 Molekularbiologische Identifizierung von
reifungsassoziiert exprimierten Genen
Diskussion
Die durchgeführten Untersuchungen des Differenzierungsprozesses von Monozyten
mit monoklonalen Antikörpern waren primär auf Oberflächenmoleküle als
phänotypische Marker beschränkt. Daher wurde versucht, zusätzliche Informationen
über zelluläre Vorgänge während der Reifung von Monozyten über
molekularbiologische Methoden zu erhalten.
Etabliert wurden im Rahmen dieser Arbeit zwei Screeningmethoden, die beide zur
Identifizierung von reifungsassoziiert exprimierten Genen führten: das differentielle
Screening und das differentielle mRNA Display.
5.2.1 Identifizierung von genetischen Markern der
Makrophagenreifung durch Differentielles Screening
Die erste (klassische) Methode wurde mit einer von Herrn Dr. S.W. Krause innerhalb
der Arbeitsgruppe hergestellten Makrophagen cDNA-Bank durchgeführt. Mit dieser
Methode konnten überwiegend bekannte cDNA-Klone isoliert werden. Von den
isolierten unbekannten Sequenzen konnte in keinem Falle eine reproduzierbare
Reifungsassoziation gezeigt werden. Sie entsprachen in den meisten Fällen
unerwünschten genomischen cDNA-Fragmenten, die, meist über die poly(A)-reiche
Region von Alu-Sequenzen revers transkribiert, in cDNA-Banken vorkommen
können.
Die reifungsassoziierte Expression von Apolipoprotein E (ApoE) und der leichten
Kette von Ferritin (Speicherprotein für Eisen) in Makrophagen ist bereits von anderen
Arbeitsgruppen beschrieben worden (Zannis et al., 1985; Ganter et al., 1989). ApoE
ist eine Hauptkomponente verschiedener Plasmalipoproteine und spielt eine wichtige
Rolle im Cholesterinmetabolismus und der rezeptorvermittelten Aufnahme von
Lipoproteinpartikeln. Mit seiner Regulation beschäftigen sich derzeit einige
Arbeitsgruppen (Basheeruddin et al., 1991, 1994; Brandt et al., 1993; Rouis et al.,
1990).
Für fünf weitere identifizierte Gene (HC-gp39, Osteopontin, Typ IV Collagenase,
Cathepsin B und Tryptophanyl-tRNA-Synthetase) war eine Expression in
Makrophagen noch nicht beschrieben oder nicht systematisch untersucht worden.
104

Diskussion
Die meisten cDNA-Klone wurden für „human cartilage glykoprotein“ HC-gp39 isoliert,
das in großen Mengen von kultivierten Chondrozyten und Fibroblasten aus der
Synovialis sezerniert wird (Hakala et al. 1993). Eine Expression dieses Gens war im
Knorpelgewebe von gesunden Personen nicht feststellbar, wurde aber bei Patienten
mit rheumatoider Arthritis gefunden. Auch durch Kultur von Knorpelgewebe wurde
HC-gp39 induziert (Hakala et al. 1993). Wie die Ergebnisse des differentiellen
Screenings und der anschließend durchgeführten Northern Blots zeigten,
exprimieren auch reife Makrophagen große Mengen der HC-gp39 mRNA.
Über Sequenzhomologien läßt sich HC-gp39 in die Familie der Chitinasen einordnen
(Hakala et al. 1993). Eine Funktion ist bis jetzt allerdings nicht bekannt, es könnte
eventuell bei Entzündungen oder Wundheilungsprozessen eine Rolle spielen. In
diesem Zusammenhang könnte auch die hohe Expression bei reifen Makrophagen
von Bedeutung sein. Interessant ist die, im Gegensatz zu allen anderen untersuchten
Genen, späte Expression der mRNA im Laufe der Differenzierung. Die meisten der
hier untersuchten Gene werden zumindest in geringem Maße durch einen
Adhärenzstimulus induziert. HC-gp39 ist aber erst schwach nach 48 h Kulturdauer
detektierbar. Es läßt sich durch Stimulantien, die klassischerweise Monozyten
aktivieren, in Kurzzeitkulturen nicht induzieren und wird nur in sehr geringem Maße in
dendritenähnlichen Zellen, die aus Monozyten generiert wurden, exprimiert.
Das gefundene Expressionsmuster macht HC-gp39 zu einem idealen Modellgen für
die Untersuchung von transkriptionellen Regulationsmechanismen während der
späten Phase der in vitro Differenzierung von humanen Monozyten. Darum wurden
die ersten Untersuchungen begonnen, das Gen zu klonieren und zu charakterisieren.
Es konnten zwei Transkriptionsinitiationsbereiche bestimmt werden, die für die
Analyse des noch zu klonierenden Promotors von Bedeutung sein werden. Erst
kürzlich wurde von Boot et al. (1995) eine humane Chitotriosidase aus der Chitinase-
Familie kloniert, die von Makrophagen erst in späten Differenzierungsstadien
exprimiert wird. Eventuell ist die späte Expression während der Makrophagenreifung
ein Kennzeichen für Mitglieder dieser Genfamilie.
Auch das am zweithäufigsten gefundene Gen kodiert für ein sezerniertes Protein:
Osteopontin. Dieses 44 kDa große Phosphoglykoprotein ist stark negativ geladen
und seine Expression ist häufig mit Mineralisierungsprozessen assoziiert (Denhardt
und Guo, 1993). So konnte man die Expression dieses Gens in Makrophagen aus
105

Diskussion
arteriosklerotischen Plaques nachweisen (Hirota et al., 1993). Über die
Wechselwirkung einer Arg-Gly-Asp (RGD) Sequenz mit Integrinen kann Osteopontin
die Zelladhäsion unterstützen und Signale in die Zelle übermitteln. So wurde z.B. ein
suppressiver Effekt auf die NOS-Expression in Nierenepithelzellen beschrieben
(Hwang et al., 1994). In Bezug auf Makrophagen scheint dieses
Extrazellulärmatrixprotein in vieler Hinsicht interessant zu sein. Neben seiner
Expression in arteriosklerotischen Plaques wurde es auch in Tumorgewebeangrenzenden
Makrophagen gefunden (Brown et al., 1994) und könnte somit eine
Rolle bei der direkten Kommunikation zwischen Tumor und Makrophage spielen.
Osteopontin ist eines der wenigen Gene, für die eine direkte transkriptionelle
Regulation durch Vitamin D3 über ein „vitamin D3 response element“ in der
Promotorregion beschrieben wurde (Zhang et al., 1992). Diese Tatsache korreliert
mit einem durch Vitamin D3 induzierten monozytären Reifungsprozess (Kreutz et al.,
1990). Das Expressionsverhalten von Osteopontin während der Differenzierung vom
humanen Blutmonozyten zum Makrophagen wurde in der vorliegenden Arbeit
erstmals genauer dargestellt.
Für die 92kDa TypIV Collagenase, einem Enzym, das Extrazellulärmatrix degradiert,
war eine Produktion in Alveolarmakrophagen bereits von Welgus et al. (1980)
beschrieben worden. Die Regulation auf der Ebene der mRNA wurde allerdings bis
heute noch nicht untersucht. Die im Rahmen dieser Arbeit erhaltenen Daten zeigen,
daß Monozyten erst nach einer Adhärenz signifikante Mengen an Typ IV
Collagenase mRNA exprimieren. Diese Beobachtung korreliert gut mit der
Vorstellung, wie Monozyten ins Gewebe auswandern. Im Blutstrom wird dieses
Enzym nicht produziert. Sobald Monozyten aber auf dem Endothel adhärieren, wird
die Aktivität dieses Enzyms benötigt, um die Basalmembran der Gefäße und um
interstitielles Gewebe durchwandern zu können.
Cathepsin B ist eine von Makrophagen produzierte lysosomale Cysteinproteinase.
Ein signifikanter Anstieg der enzymatischen Aktivität von Cathepsin B konnte bereits
von Morland (1985) gezeigt werden. Hier konnte dieser Anstieg auf der Ebene der
mRNA bestätigt werden. Die verstärkte Expression von lysosomalen Proteinen in
reifen Makrophagen paßt zu der Beobachtung, daß Makrophagen eine größere
Kapazität zur Phagozytose besitzen als Monozyten (Becker, 1984).
106

Diskussion
Tryptophanyl-tRNA-Synthetase unterscheidet sich im Expressionsmuster deutlich
von den anderen identifizierten Genen. Es wird als Bestandteil der
Translationsmaschinerie bereits in frisch isolierten Monozyten exprimiert. Die
Hochregulation während des Reifungsprozesses ist wohl ein Zeichen für die
verstärkte metabolische Aktivität von reifen Makrophagen (in Bezug auf die zelluläre
Proteinbiosynthese).
Mit Hilfe des differentiellen Screenings konnte also eine Reihe von Genen identifiziert
werden, die mit einer erhöhten Stoffwechselaktivität von reifen Makrophagen (ApoE,
Ferrintin, Cathepsin B, Tryptophanyl-tRNA-Synthetase) in Verbindung gebracht
werden können oder im Zusammenhang mit Wechselwirkungen zwischen
Makrophage und Extrazellulärmatrix stehen (HC-gp39, Osteopontin, Typ IV
Collagenase). Eine Gemeinsamkeit der identifizierten Gene ist die deutliche
Hochregulation im Laufe der Differenzierung. Zum Teil werden die Gene parallel zur
Adhärenz induziert (Typ IV Collagenase, Osteopontin, Cathepsin B), zwei der
gefundenen Gene werden erst in reiferen Zellen exprimiert (ApoE, HC-gp39). Im
Gegensatz zu früheren Untersuchungen, die sich auf die Charakterisierung von
adhärenzinduzierten Genen beschränkten (Haskill et al., 1988; Sporn et al., 1990),
konnten hier Markergene für reife Makrophagen isoliert werden.
In weiterführenden Untersuchungen soll die Bedeutung dieser „Markergene“ der
monozytären Reifung bei pathophysiologischen Differenzierungsformen (z.B bei
Tumor-assoziierten Makrophagen) untersucht werden.
5.2.2 Klonierung eines reifungsassoziiert exprimierten Gens
über Differentielles Display
Nach der Identifizierung oben genannter Gene durch differentielles Screening wurde
eine zweite Methode zur Klonierung von unterschiedlich stark exprimierten Genen
etabliert, das von Liang und Pardee (1992) beschriebene differentielle Display. Diese
ursprünglich für Zellinien entwickelte Alternative zu den klassischen
Screeningmethoden wurde im Rahmen dieser Arbeit erstmals erfolgreich bei
primären Zellen angewendet. In Primärkulturen auftretende, geringfügige
Kontaminationen durch andere Zelltypen, im untersuchten Fall z.B. durch
Lymphozyten, erhöhen dabei die Rate an falsch positiven oder falsch negativen
cDNA-Fragmenten.
107

Diskussion
Es gelang die Klonierung eines mRNA-Transkriptes, das, entsprechend den
Versuchsbedingungen, reifungsassoziiert von Makrophagen exprimiert wird. Dem
cDNA-Fragment aus der ursprünglichen PCR-Amplifikation (dd3f) konnten einige
cDNA-Klone aus unserer Makrophagen cDNA-Bank zugeordnet werden, wobei der
größte Klon, der mit 2.5 kb der detektierten Größe im Northern Blot weitgehend
entsprach, vollständig sequenziert wurde. Bei der Analyse der Sequenz konnte ein
offener Leserahmen detektiert werden, der aufgrund struktureller Vorhersagen über
das abgeleitete Protein sehr interessant erscheint. Dieses putative Polypeptid von ca.
27 kDa besitzt große strukturelle Homologien zu Mitgliedern der Familie der G-
Protein-gekoppelten Rezeptoren. Im Hydrophobizitätsprofil nach Kyte und Doolittle
(1982) sind deutlich sieben einzelne hydrophobe Sequenzbereiche sichtbar, einem
für Sieben-Transmembrandomänen-Rezeptoren charakteristischem Merkmal
(Dohlman et al., 1991). Abgesehen von dieser strukturellen Homologie konnten bei
direkten Vergleichen auf der Ebene der Sequenz nur geringfügige Ähnlichkeiten zur
Familie der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren festgestellt werden (Attwood et al.,
1991). So fehlen z.B. einige der charakteristischen konservierten Aminosäuren,
Glykosylierungsstellen und Verbindungsstellen zur G-Protein-gekoppelten
Signalübertragung (Attwood et al., 1991).
dd3f ist also ein bisher unbekanntes Transkript, das wahrscheinlich ein Protein mit
mehreren Transmembrandomänen kodiert. Seine Induktion während der Reifung
vom Monozyten zu Makrophagen deutet an, daß es mit dem unterschiedlichen
funktionellen Repertoire von Monozyten und Makrophagen verbunden sein könnte.
Interessanterweise wurde das dd3f Transkript in allen untersuchten Zellinien
myeloiden Ursprungs detektiert, eine besondere Bedeutung für Zellen dieser Linie ist
also nicht auszuschließen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Versuche begonnen, ein
entsprechendes Protein zu charakterisieren, um weitere Hinweise auf die Translation
und eine mögliche Funktion zu erhalten. Derzeit wird versucht, mit einem vermutlich
hydrophilen Sequenzabschnitt des NH2-terminalen Endes vom dd3f-Polypeptid ein
polyklonales Antiserum zu erzeugen, das für Immunpräzipitationen oder Western
Blots verwendet werden soll.
In weiteren Untersuchungen muß geklärt werden ob das dd3f-Polypeptid als
Rezeptor oder Ionenkanal fungiert oder andere für den Makrophagen wichtige
Funktionen übernimmt.
108

6 ZUSAMMENFASSUNG
Im Rahmen dieser Dissertation wurden
Zusammenfassung
• von Antikörpern markierte Zelloberflächenproteine mit Hilfe proteinchemischer
Arbeitstechniken charakterisiert,
• über molekularbiologische Methoden Gene identifiziert,
deren Expression im Laufe der in vitro Differenzierung von humanen Blutmonozyten
in reife Makrophagen hochreguliert wird.
Alle untersuchten monoklonalen Antikörper (MAX.1, MAX.3, MAX.11, 8H8 und 7A2)
erkennen Zelloberflächenantigene, die auf Monozyten nur schwach oder gar nicht
nachweisbar sind, auf Makrophagen aber deutlich exprimiert werden. Die beiden
Antikörper MAX.1 und MAX.11 erkennen dasselbe GPI-verankerte Glycoprotein mit
einem Molekulargewicht von ca. 58-64 kDa. Nach der chromatographischen
Reinigung über Immunaffinität konnte die NH2-terminale Aminosäuresequenz des
Antigens bestimmt werden. Sequenzanalysen ergaben, daß diese Sequenz identisch
ist mit der NH2-terminalen Aminosäuresequenz von Carboxypeptidase M (CPM),
einer membrangebundenen Ectopeptidase, die die Abspaltung der basischen
Aminosäuren Arginin und Lysin vom COOH-terminalen Ende von Peptiden und
Proteinen katalysiert. Diese Identität wurde durch mehrere Tatsachen untermauert:
die biochemischen Eigenschaften des MAX.1/11 Antigens sind identisch mit den für
CPM in der Literatur beschriebenen Eigenschaften; die Gewebeverteilung der
Aktivität dieses Enzyms entspricht weitgehend den immunhistologischen Befunden
über die Gewebereaktivität der beiden Antikörper; beide Antikörper waren in der
Lage, die spezifische Aktivität von CPM aus Membranpräparationen zu fällen. Der
neu in der Arbeitsgruppe erzeugte Antikörper 7A2 hatte ein den Antikörpern MAX.1
und MAX.11 entsprechendes Präzipitationsverhalten und detektiert somit auch CPM.
Es konnte gezeigt werden, daß sowohl die Oberflächenexpression, als auch die
Expression der mRNA und die spezifische membrangebundene Aktivität von CPM
während der in vitro Differenzierung von humanen Monozyten deutlich ansteigt. Die
Regulationmechaismen während der Differenzierung und die biologische Funktion
von CPM auf Makrophagen sind zur Zeit noch unklar.
Der monoklonale Antikörper 8H8 detektierte bei Immunpräzipitationen den
Komplementrezeptor 4 (CR4, gp150/95). Das Epitop für diesen Antikörper scheint, im
109

Zusammenfassung
Gegensatz zu dem anderer Antikörper gegen CR4, in durchflußzytometrischen
Untersuchungen
aufzutauchen.
und im Zell-ELISA reifungsabhängig auf Makrophagen
Der monoklonale Antikörper MAX.3 erkennt ein Oberflächenantigen, daß auf
Makrophagen stark glycosyliert ist (MW: 60-80 kDa), auf Thrombozyten jedoch ein
deutlich geringeres Molekulargewicht aufweist (MW: 52-62 kDa). Beide detektierten
Antigene besitzen nach der Abspaltung von Asparagin-verknüpften Zuckerstrukturen
ein vermutlich identisches Proteingerüst mit einem Molekulargewicht von 45 kDa.
Antigen konnte über Immunaffinität aus Thrombozytenmembranen aufgereinigt und
die NH2-terminale Aminosäuresequenz bestimmt werden. Sequenzanalysen ergaben
im Falle von MAX.3 keine Homologien zu bekannten Proteinen.
Die Untersuchungen auf der Ebene der Transkription führten zur Identifizierung
einiger Gene, die während der in vitro Differenzierung von Monozyten hochreguliert
werden.
Durch die Methode des Differentiellen Screenings wurden insgesamt sieben Gene
gefunden. Für Apolipoprotein E und Ferritin (leichte Kette) war der Anstieg im Laufe
der Differenzierung bereits beschrieben worden, für Cathepsin B war eine solche
Regulation bereits auf der Ebene der Proteine bekannt. Die Hochregulation von HCgp39,
Osteopontin, Typ IV Collagenase und Tryptophanyl-tRNA-Synthetase konnte
hier erstmals anhand von Northern Blot Analysen gezeigt werden. Besonders
interessant erscheint die späte Regulation des sezernierten Glycoproteins HC-gp39.
Mit der zweiten verwendeten Methode, dem Differentiellen Display, konnte ein bisher
unbekanntes Transkript (dd3f) kloniert und sequenziert werden, daß
reifungsabhängig in Makrophagen, nicht aber in frisch isolierten Monozyten
exprimiert wird. Die Nukleotidsequenz enthält einen offenen Leserahmen, der für ein
hydrophobes Protein mit sieben Transmembransegmenten kodieren könnte. Dieses
Protein könnte als Rezeptor oder Ionenkanal fungieren.
110

7 LITERATUR
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120

8 ANHANG
LEBENSLAUF:
Name: Michael Wilhelm Rehli
Geburtsdatum: 02.01.1967
Geburtsort: Düsseldorf
Eltern: Wilhelm und Margret Rehli
Anhang
Grundschule:
1973-1977
St. Martin Schule in Ratingen
Gymnasium:
1977-1978 Theodor-Heuss-Gymnasium Ratingen
1978-1986 Gymnasium Zwiesel
Mai-Juni 1986 Abitur
Universität:
1986 Immatrikulation an der Universität Regensburg, Studiengang
Chemie
1988 Vordiplom
1991 Hauptdiplomsprüfungen
Febr.-Nov. 1992 Diplomarbeit am Institut für Klinische Chemie der Universität
Regensburg (Prof. Schmitz)
Thema: ´Vergleichende Untersuchungen der Zytoskelettproteine
bei Lipidstoffwechselstörungen´
seit 1993 Beginn der Promotion an der Klinik für Innere Medizin I der
Universität Regensburg (Prof. Andreesen)
Thema: ´Klonierung und Charakterisierung von
reifungsassoziierten, makrophagenspezifischen Proteinen´
assoziiertes Mitglied im Graduiertenkolleg ´Therapieforschung
Onkologie´
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