Klonierung und Charakterisierung von reifungsassoziierten ...

Material und Methoden
Bei der Färbung von PVDF-Membranen verkürzte sich der Färbeschritt auf 1-2 min,
auch das Entfärben war nach deutlich kürzerer Zeit abgeschlossen.
3.4.8.1.2 Silberfärbung
benötigte Lösungen:
Fixierlösung A: 800 ml (40 %) Methanol
200 ml (10 %) Essigsäure (97-98 %)
ad 2000 ml mit aqua bidest.
Fixierlösung B: 200 ml (10 %) Ethanol
100 ml (5 %) Essigsäure (97-98 %)
ad 2000 ml mit aqua bidest.
Fixierlösung C: 200 ml (10 %) Ethanol
ad 2000 ml mit aqua bidest.
Silbernitrat-Lösung: 1 g (0.1 %) AgNO 3
ad 1000 ml mit aqua bidest.
Natriumcarbonat-Stammlösung: 150 g (15 %) Na 2 CO 3
ad 1000 ml mit aqua bidest.
Entwickler: 100 µl (0.1 %) Formalin-Lösung (37 %)
50 ml (3 %) Natriumcarbonat-Stammlösung
ad 250 ml mit aqua bidest
Stoppbad: 100 ml (5 %) Essigsäure (97-98 %)
ad 2000 ml mit aqua bidest.
Das SDS-Gel wurde unter leichtem Schwenken nacheinander 1 h in Fixierlösung A,
1/2 h in B, 1/2 h in C und anschließend dreimal je 10 min in Wasser inkubiert.
Anschließend wurde das Gel 1/2 h in Silbernitrat-Lösung geschwenkt. Nach kurzen
Waschen (ca. 10 s) mit Wasser wurden 50 ml frisch angesetzter Entwickler zugesetzt
und nach eingetretener Gelbfärbung wieder abgesaugt. Bei erneuter
Entwicklerzugabe wurden nach einiger Zeit (2-30 min) die Proteinbanden sichtbar.
Nach dem Erreichen der optimalen Intensität wurde der Entwickler durch das
Stopbad ersetzt.
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