Klonierung und Charakterisierung von reifungsassoziierten ...

Material und Methoden
Die Protein G Sepharose-Beads wurden nach der Immunpräzipitation einmal mit
500 µl Waschpuffer gewaschen und nach der Zugabe von 50 µl Glykosidase-Puffer 5
min auf 95°C erhitzt. Der Überstand wurde abgenommen und das enthaltene SDS
mit 25 µl einer 20%igen Dodecylmaltosid-Lösung (entspricht einem 10-fachen
Überschuß) neutralisiert. Nach der Zugabe von 1 U (5 µl) N-Glykosidase F zu jedem
Ansatz (Boehringer Mannheim) wurde über Nacht bei 37°C inkubiert. Vor der
analytischen SDS-PAGE wurden die deglykosylierten Proteine mit Chloroform
extrahiert (nach Offringa und Bierer, 1993).
Proteine in Lösung wurden gegen den Waschpuffer dialysiert und nach Zusatz von
entsprechenden Mengen an β-Mercaptoethanol und SDS aufgekocht. Die weitere
Bearbeitung erfolgte wie bei den Überständen der Sepharose-Beads.
3.4.6 Elektrophoretische Auftrennung von Proteinen durch SDS-
PAGE
Benötigte Lösungen:
Acrylamid-Stammlösung : 146 g Acrylamid (MW 71.1)
AA (30 %) 4.0 g (%C = 2.67 %) BIS (MW 154.2)
(alternativ für Silbergele: PDA als Crosslinker:
5.0 g PDA (MW 194.2))
ad 500 ml mit aqua bidest
Untergelpuffer: 90.83 g (1,5 M) Tris / HCl pH 8.8
ad 500 ml mit aqua bidest
Obergelpuffer: 30 g (0.5 M) Tris / HCl pH 6.8
ad 500 ml mit aqua bidest
SDS-Stammlösung (10 %): 10 g (10 %) SDS
ad 100 ml mit aqua bidest
Trispuffer TP (1.25 M): 13 g (1.25 M) Tris / HCl pH 6.8
ad 100 ml mit aqua bidest
SDS-Probenpuffer PP (2x): 10 ml (20 %) Glycerin
5 ml (125 mM) TP (1.25 M)
2 g (4 %) SDS
5 ml (10 %) 2-Mercaptoethanol
10 mg (0.02 %) Bromphenolblau
ad 50 ml mit aqua bidest
Ammoniumpersulfat AP (10 %): 100 mg (10 %) Ammoniumpersulfat
ad 1 ml mit aqua bidest.
(frisch hergestellt)
Laemmli-Elektrodenpuffer (5x): 15 g (40 mM) Tris
216g (0.95 M) Glycin
15 g (0.5 %) SDS
ad 3000 ml mit aqua bidest
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