Klonierung und Charakterisierung von reifungsassoziierten ...

Material und Methoden
Gel-Stammlösungen Untergele Obergel
7.5 % 10 % 12 % 15 % 5 %
Obergelpuffer 25 ml
Untergelpuffer 25 ml 25 ml 25 ml 25 ml
SDS (10 %) 1.0 ml 1.0 ml 1.0 ml 1.0 ml 1.0 ml
AA (30 %) 25 ml 33 ml 40 ml 50 ml 16.65 ml
aqua bidest ad 100 ml
Tabelle 3-3 Zusammensetzung der Untergel- und Obergel-
Stammlösungen
Tabelle 3-4 Pipettierschema
für Unter- und
Obergel
Die Herstellung des Unter- (Trenn-) gels erfolgte bereits am Vortag der
Elektrophorese. Die benötigte Menge an Untergel-Stammlösung (5 ml für Multigel
bzw. 12 ml für Multigel-Long pro Gel) wurde vor der Zugabe der Polymerisations-
Initiatoren TEMED und Ammoniumpersulfat im Wasserstrahl-Vakuum entgast. Das
gegossene Gel wurde mit wenigen Tropfen wassergesättigtem Isobutanol
überschichtet. Nach der Polymerisation wurde das Gel überschichtet mit
Untergelpuffer (1:3 verdünnt) über Nacht bei 4°C auspolymerisiert.
Nach der Polymerisation des Obergels (nach ca. 30 min abgeschlossen) wurden die
fertigen Gele in die Elektrophoresekammer eingesetzt und der Elektrodenpuffer
(Laemmli -Puffer (5x) 1 : 5 verdünnt) zugegeben. Die Proben wurden mit SDS-PP
(2x) im Verhältnis 1 : 1 vermischt, 5 min auf 95°C erhitzt und aufgetragen. Die
Elektrophorese erfolgte bei 18 mA pro Gel bei der kleinen Kammer oder 25 mA pro
Gel bei der großen Kammer für 60 und 180 min (Shapiro et al., 1967, Laemmli et al.,
1970).
3.4.7 Western-Blotting (Semi-dry-Technik)
Verwendete Pufferlösungen:
Untergel Obergel
Stammlösung 10 ml 5 ml
TEMED 10 µl 5 µl
AP (10 %) frisch 50 µl 40 µl
Anodenpuffer A: 36.3 g (0.3 M) Tris pH 10.4
200 ml (20 %) Methanol
ad 1000 ml mit aqua bidest.
Anodenpuffer B: 3.03 g (25 mM) Tris pH 10.4
200 ml (20 %) Methanol
ad 1000 ml mit aqua bidest.
Kathodenpuffer C: 5.20 g (4 mM) ε-Amino-n-Capronsäure pH 7.6
200 ml (20 %) Methanol
ad 1000 ml mit aqua bidest.
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