Klonierung und Charakterisierung von reifungsassoziierten ...

Ergebnisse
4.4 Klonierung und Charakterisierung eines reifungsassoziiert
exprimierten Gens über differentielles Display
Als zweite Methode zur Identifizierung von reifungsassoziiert exprimierten Genen
wurde das von Liang und Pardee (1992) entwickelte differenzielle mRNA Display
verwendet. Die Grundidee hinter dieser Methode ist, daß eine Zelle ca. 15000 Gene
exprimiert und daß sich prinzipiell jede einzelne mRNA revers transkribieren und
über PCR amplifizieren läßt. Bei der Verwendung von degenerierten Oligo(dT)-
Primern und kurzen arbiträren Primern für die PCR erhält man pro Ansatz 200-300
PCR-Fragmente. Diese können über ein Sequenzgel aufgetrennt und analysiert
werden. Durch den Vergleich der Bandenmuster von verwandten, aber nicht
identischen Zellen (z.B. stimuliert / unstimuliert) lassen sich mit dieser Methode
differenziell exprimierte Gene isolieren. Mit zusätzlicher Hilfe der RACE-Technik kann
die bei anderen Screeningmethoden notwendige und aufwendige Konstruktion einer
cDNA-Bank möglicherweise umgangen werden.
Als nachteilig haben sich im Laufe der Etablierung dieser Methode die relativ
schlechte Reproduzierbarkeit und die hohe Anzahl falsch positiver Fragmente
erwiesen, die häufig durch Hybridisierung der kurzen Oligo(dT)-Primer mit Adenosinreichen
Regionen in ALU-Repeat Sequenzen verursacht werden.
4.4.1 Klonierung und Sequenzierung eines reifungsassoziierten
Transkripts
Nach einem differentiellen Display mit der Primerkombination T12MC, AP-1 (5´-
AGCCAGCGAA-3´) aus Gesamt-RNA von 1.) adhärenten Monozyten und 2.) in vitro
differenzierten Makrophagen konnten drei Fragmente isoliert werden, die
reproduzierbar in der Makrophagenpräparation erschienen und bei der
Monozytenpräparation fehlten (Abbildung 4-22 A). Nach der Reamplifikation wurden
die Fragmente in den pCRII-Vektor (Invitrogen) kloniert. Zur Bestätigung der
reifungsassoziierten Expression in Makrophagen wurden die präparierten
Plasmidinserts als Sonden für Northern Blots verwendet. Für den als dd3f
bezeichneten Klon konnte bei Makrophagen ein Signal bei ca. 2.8 kb detektiert
werden, das bei Monozyten fehlte (Abbildung 4-22 B). Die beiden anderen
Fragmente waren nicht reproduzierbar reifungsassoziiert.
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