Klonierung und Charakterisierung von reifungsassoziierten ...

Inhaltsverzeichnis
3.3.2 Phänotypische Charakterisierung von Zellen .......................................................................... 23
3.3.2.1 Zell-ELISA.........................................................................................................................................24
3.3.2.2 Durchflußzytometrie - Färbung für Oberflächenantigene ..................................................................25
3.4 PROTEINCHEMISCHE METHODEN ........................................................................................................ 26
3.4.1 Solubilisierung von zellulären Proteinen.................................................................................. 26
3.4.1.1 Präparation von Zellmembranen zur Messung membrangebundener Enzymaktivität.......................26
3.4.1.2 Präparation von Zelloberflächenproteine durch Nonidet P-40 Lyse ..................................................26
3.4.2 Bestimmung der Proteinkonzentration mit BCA ...................................................................... 27
3.4.3 Präparative Methoden zur Proteinfällung ................................................................................ 28
3.4.3.1 Chloroformextraktion von Proteinen..................................................................................................28
3.4.3.2 Ammoniumsulfat-Fällung (für Hybridomüberstände) .........................................................................28
3.4.4 Isolierung von Proteinen über Antikörperbindung ................................................................... 29
3.4.4.1 Immunaffinitätschromatographie .......................................................................................................29
3.4.4.2 Immunpräzipitation von Oberflächenantigenen .................................................................................30
3.4.5 Chemische oder enzymatische Veränderungen an Proteinen ................................................ 30
3.4.5.1 Biotinylierung von Oberflächenproteinen...........................................................................................30
3.4.5.2 Abspaltung von Proteinen über Phosphoinosit-spezifische Phospholipase C ...................................31
3.4.5.3 Enzymatische Deglykosylierungen....................................................................................................31
3.4.5.3.1 Neuraminidase- und β-Galactosidase-Verdau...........................................................................31
3.4.5.3.2 Freisetzung von N-Glykanen durch N-Glykosidase F................................................................31
3.4.6 Elektrophoretische Auftrennung von Proteinen durch SDS-PAGE ......................................... 32
3.4.7 Western-Blotting (Semi-dry-Technik)....................................................................................... 33
3.4.8 Nachweis und Charakterisierung von Proteinen ..................................................................... 34
3.4.8.1 Färbung von Proteinen in Gelen .......................................................................................................34
3.4.8.1.1 Coomassiefärbung ....................................................................................................................34
3.4.8.1.2 Silberfärbung .............................................................................................................................35
3.4.8.2 Immunofärbung von Proteinblots ......................................................................................................36
3.4.8.3 ECL-Färbung von biotinylierten Proteinen.........................................................................................36
3.4.8.4 Mikrosequenzanalyse........................................................................................................................37
3.4.9 Enzymassay für Carboxypeptidase M ..................................................................................... 37
3.5 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN................................................................................................ 38
3.5.1 Kultivierung von Bakterien ....................................................................................................... 39
3.5.2 Plasmidvektoren....................................................................................................................... 39
3.5.2.1 Plasmid MiniPrep (alkalische Lyse)...................................................................................................39
3.5.2.2 Präparation von kompetenten E.Coli.................................................................................................40
3.5.2.3 Transformation von E.Coli.................................................................................................................41
3.5.3 Präparation, Enzymatische Manipulationen, Analyse und Sequenzierung von DNA ............. 41
3.5.3.1 Gelelektrophoresen...........................................................................................................................41
3.5.3.1.1 Agarose-Gel für DNA.................................................................................................................41
3.5.3.1.2 alkalisches Agarosegel für einzelsträngige DNA .......................................................................42
3.5.3.2 Präparation von DNA Fragmenten ....................................................................................................42
3.5.3.3 Klonierung von DNA-Fragmenten .....................................................................................................43
3.5.3.4 Kontrollierte, stufenweise Verkürzung von Plasmidkonstrukten ("Nested Deletion").........................43
3.5.3.5 Sequenzierung von Plasmid DNA und computergestützte Sequenzanalysen...................................44
3.5.3.6 Markierung von cDNA-Fragmenten und Oligonukleotiden ................................................................44
3.5.4 Präparation und Analyse von RNA .......................................................................................... 44
3.5.4.1 RNA Extraktion mit Guanidin-Phenol-Chloroform .............................................................................44
3.5.4.2 DNA-Verdau in RNA-Präperationen..................................................................................................46
3.5.4.3 Isolation vom poly(A)-RNA................................................................................................................46
3.5.4.4 1% Agarose-Gel für RNA ..................................................................................................................47
3.5.4.5 Northern-Blotting - RNA-Transfer......................................................................................................48
3.5.4.6 Hybridisierung von Northern Blots.....................................................................................................48