Klonierung und Charakterisierung von reifungsassoziierten ...

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Material und Methoden Proteinase K Promega, Madison, Wi, USA Random Primed DNA Labeling Kit Boehringer Mannheim Restriktionsenzyme Boehringer Mannheim Reverse Transkriptase SuperSkript II Gibco BRL, Eggenstein RNAmap GenHunter Corporation, Brooklin, MA, USA RNAse Boehringer Mannheim RNAse-Inhibitor Boehringer Mannheim, Pharmacia T4-DNA-Ligase Boehringer Mannheim Taq DNA-Polymerase Boehringer Mannheim Tunicamycin A1 Calbiochem, Bad Soden 3.1.6 Molekulargewichtsstandards Verwendete DNA-Längenstandards: Lambda DNA Hind III-Verdau (Gibco BRL, Eggenstein): 23130 9416 6557 4361 2322 2027 564 125 (bp) ΦX-174 RF DNA Hae III-Verdau (Gibco BRL, Eggenstein): 1353 1078 872 603 310 (bp) Lambda DNA Hind III- /ΦX-174 RF DNA Hinc III- Verdau (Phamacia): 23130 9416 6557 4361 2322 2027 1057 770 612 564 495 392 345 341 335 297 291 210 162 125 (bp) Molekulargewichtstandards für Proteine: Broad Molecular Weight Standard (HLMW, BioRad, ): 200,0 116,25 97,4 66,2 45,0 31,0 21,5 14,4 6,5 (kDa) HLMW, biotinyliert (BioRad, ) 200,0 116,25 97,4 66,2 45,0 31,0 21,5 14,4 6,5 (kDa) 3.1.7 Vektoren Bakteriophagen: Lambda ZAP II Statagene Plasmide: pBlueskript SK Stratagene pCRII Invitrogen, San Diego, CA, USA pcDNAI Invitrogen, San Diego, CA, USA 3.1.8 Primersequenzen Sequenzierprimer: M13 (-20) forward 5´-TTG TAA AAC GAC GGC CAG TG-3´ M13 reverse 5´-GGA AAC AGC TAT GAC CAT GAT-3´ SK 5´-TCT AGA ACT AGT GGA TC-3´ T3 5´-ATT AAC CCT CAC TAA AG-3´ T7 5´-AAT ACG ACT CAC TAT AG-3´ dd3f-SEQ1 5´-ATT CTA TCA CAC ATG TGA AA-3´ dd3f-SEQ2 5´-ACA GTT AGC AGC ATG TTC A-3´ dd3f-SEQ3 5´-GGT CCA AGT TCA CGA AGA T-3´ dd3f-SEQ4 5´-TTC AGA GTA AGA GGT TGG-3´ dd3f-SEQ5 5´-TTG GTT GGT GTT ATC ACT GGG TAC CTT GCC T-3´ 17
Material und Methoden Oligonucleotide und PCR-Primer: 18S spezifisches Oligonukleotid 5´-ACG GTA TCT GAT CGT CTT CGA ACC-3´ T3 (27mer) 5´-CAA GCT CGA AAT TAA CCC TCA CTA AAG-3´ CPMsense 5´-TTT CAA CTA CCA CCG CCA GGA AGG-3´ CPMantisense 5´-ATG TGC AAA AGA CTC ACT AAA AAT AA-3´ CPM P1 5´-GCT ACC AAA GGC AGC AAC AGC CCT AG-3´ CPM P3 5´-CTC CCG CCC AAC AGT CTC ATC TCC ATG CAT-3´ CPM P4 5´-CCA TTA TCA AAT GGG TAA CTG GCC ACG AGG-3´ HCgpRACE 5´-CTT GAG TGT GTT GAG CAT GCC GTA GAG CGT-3´ HCgpIN 5´-GAG CAG CAC CAG GAC CAC AAA GCC TGT TTG-3´ HCgpOUT 5´-GTA GCA GAC CAG TTT GTA TGC AGA GCA GCA CTG-3´ 3.1.9 Bakterien und Zellinien E.coli-Stämme: XL1-blue recA1, endA1, gyrA46, thi-1, hsdR17, supE44, relAl, lac, [F´, proAB lacI q Z∆M15, Tn10 (Tet r )] INVaF´ recA1, endA1, hsdR17(r -κ m +κ ), supE44, λ-, thi-1, gyrA, relAl, Φ80 lacZ∆M15∆(lacZYA-argF), deoR + , F´ Eukaryontische Zellinien: K-562 humane chronisch myeloische Leukämiezellinie (DSM ACC10) HL-60 humane akute myeloische Leukämiezellinie (DSM ACC3) U937 humane histiozytisches Lymphomzellinie (DSM ACC5) THP-1 humane monozytische Leukämiezellinie (DSM ACC16) 3.2 Zellbiologische Methoden 3.2.1 Kultur der Zellinien 3.2.1.1 Kulturbedingungen und Passagierung Die verwendeten Zellinien wurden, wenn nicht anders angegeben, in RPMI 1640 mit folgenden Zusätzen kultiviert: L-Glutamin (2mM), 2 ml Vitamine, Penicillin/Streptomycin (100 U/ml), Natriumpyruvat (1mM), 2-Mercapthoethanol (50 µM). Alle Zusätze waren von Gibco, Eggenstein. Dem Medium wurde 10% fötales Kälberserum zugesetzt und die Zellen bei 37°C, 5% Kohlendioxidgehalt und 95% relativer Luftfeuchtigkeit in einem Inkubator (Heraeus, Hanau) kultiviert. Die Seren wurden vor Gebrauch bei 56°C für 30 min inaktiviert. Nach Erreichen der Konfluenz wurden die Zellen zur Passage mit PBS gewaschen und 5 bis 10 min mit 0,05% Trypsin/ 0,02% EDTA bei 37°C inkubiert, in Medium mit Serum aufgenommen und 1:5 bis 1:10 verdünnt in neue Zellkulturflaschen verteilt. 18
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Seite 19 und 20: 1.1.3.3 Funktionalität und Differe
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Seite 23 und 24: Einleitung Monozyten reifen bei ein
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Seite 31 und 32: 3.2.2 Monozytenisolierung durch Geg
Seite 33 und 34: 3.3 Immunologische Methoden Materia
Seite 35 und 36: 3.3.2.1 Zell-ELISA Benötigte Lösu
Seite 37 und 38: 3.4 Proteinchemische Methoden 3.4.1
Seite 39 und 40: 3.4.3 Präparative Methoden zur Pro
Seite 41 und 42: 3.4.4.2 Immunpräzipitation von Obe
Seite 43 und 44: Material und Methoden Die Protein G
Seite 45 und 46: Material und Methoden Zur Immobilis
Seite 47 und 48: 3.4.8.2 Immunofärbung von Proteinb
Seite 49 und 50: Kontrolle (ohne alles) Tabelle 3-5
Seite 51 und 52: Material und Methoden 12000g, 4°C)
Seite 53 und 54: 1.0 % 1.2 % H 2 O 30 ml 50 ml 150 m
Seite 55 und 56: Material und Methoden erzeugten Del
Seite 57 und 58: 3.5.4.2 DNA-Verdau in RNA-Präperat
Seite 59 und 60: 3.5.4.5 Northern-Blotting - RNA-Tra
Seite 61 und 62: Material und Methoden 3.5.5 Phagens
Seite 63 und 64: Waschlösung A 50 ml (2x) SSC (20x)
Seite 65 und 66: • PhagenPCR PCR-Mix: Phagen in SM
Seite 67 und 68: H HN H HN O S O S NH H NH H D-Bioti
Seite 69 und 70: MW (kDa) Abbildung 4-3 Immunpräzip
Seite 71 und 72: 4.1.4 Expression und enzymatische A
Seite 73 und 74: 4.1.5 7A2-Antigen Ergebnisse In Zus
Seite 75 und 76: Ergebnisse 4.1.6.2 Charakterisierun
Seite 77 und 78: Ergebnisse Da bei der anfänglichen
Seite 79 und 80:
Ergebnisse 58-64 kDa wurde ausgesch
Seite 81 und 82:
Ergebnisse 4.3 Klonierung von reifu
Seite 83 und 84:
Ergebnisse Als nächstes wurden zur
Seite 85 und 86:
IV.a. V.a. IV.b. V.b. Ergebnisse Ab
Seite 87 und 88:
Ergebnisse Abbildung 4-19 Northern
Seite 89 und 90:
Ergebnisse Transkriptions-Startregi
Seite 91 und 92:
Ergebnisse Abbildung 4-22 Different
Seite 93 und 94:
1 GCACGAGCCAAGCCCATGAGGGCCGCGCGCCCG
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Zellmembran Ergebnisse Abbildung 4-
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5 DISKUSSION 5.1 Charakterisierung
Seite 99 und 100:
Diskussion dieser Antikörper siche
Seite 101 und 102:
Diskussion Endothelzell- oder Fibro
Seite 103 und 104:
Diskussion Wie in Tabelle 5-1 gezei
Seite 105 und 106:
Diskussion Peptidhormone sind an vi
Seite 107 und 108:
Diskussion (Bhoola et al., 1992). V
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Diskussion 5.1.1.2.3 Makrophagen un
Seite 111 und 112:
-Arg CPM NO iNOS L-Arg L-Arg L-Citr
Seite 113 und 114:
Diskussion Auch konnte keine Wechse
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5.2 Molekularbiologische Identifizi
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Diskussion arteriosklerotischen Pla
Seite 119 und 120:
Diskussion Es gelang die Klonierung
Seite 121 und 122:
Zusammenfassung Gegensatz zu dem an
Seite 123 und 124:
Literatur Auger, M.J., and Ross, J.
Seite 125 und 126:
Literatur Ganter, U., Bauer, J., Ma
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Literatur Marinkovic, D.M., Ward, D
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Literatur Rouis., M., Nigon, F., Eg
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Literatur Zaiss, M., Krause, S.W.,
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