Klonierung und Charakterisierung von reifungsassoziierten ...

Material und Methoden
3.4.5.2 Abspaltung von Proteinen über Phosphoinosit-spezifische
Phospholipase C
1 x 10 8 Zellen/ml wurden in PBS suspendiert und nach der Zugabe von 0.2 units/ml
Phosphoinosit-spezifischer Phospholipase C (PI-PLC) für 1 h langsam rotierend bei
37°C inkubiert. Die Zellen wurden abzentrifugiert und der Überstand, der die
freigesetzten PI-PLC-spaltbaren Proteine enthielt, wurde bis zur weiteren
Verwendung bei 4°C gelagert.
3.4.5.3 Enzymatische Deglykosylierungen
Die im folgenden beschriebenen Deglykosylierungen wurden, wenn nicht anders
vermerkt, direkt an den Komplexen aus immunpräzipitierten Antigenen und Protein
G-Sepharose Beads durchgeführt.
3.4.5.3.1 Neuraminidase- und β-Galactosidase-Verdau
benötigte Puffer:
Neuraminidase-Puffer: 410 mg (50 mM) NaAc/HAc (pH 5,5)
60 mg (4 mM) CaCl2 • 2 H2O
ad 100 ml mit aqua bidest.
frisch zugeben: je 100 µg/ml BSA
Galactosidase-Puffer: 410 mg (50 mM) NaAc/HAc (pH 6,0)
ad 100 ml mit aqua bidest
Glucosaminidase-Puffer: 1.47 g (50 mM) Na-Citrat/H3PO4 pH 4.8
ad 100 ml mit aqua bidest
Das Protein G-Pellet wurde mit 1 ml entsprechendem-Puffer gewaschen, mit 150 µl
Puffer versetzt und nach der Zugabe von je 10 mU Neuraminidase, β-Galactosidase
oder N-Acetyl-β-D-glucosaminidase (Boehringer Mannheim) für ca. 2 h bei 37°C
inkubiert. Anschließend wurde der Ansatz auf Eis gestellt, das Sepharose-Pellet
abzentrifugiert und die Proteine über SDS-PAGE analysiert.
3.4.5.3.2 Freisetzung von N-Glykanen durch N-Glykosidase F
benötigte Puffer:
Waschpuffer: 700 µl NaH2PO4(0.2M)
300 µl (20 mM) Na2HPO4 (0.2M)
200 µl (10 mM) EDTA pH 8.0 (0.5 M)
ad 10 ml mit aqua bidest (ergibt pH 7.0)
Glykosidase-Puffer: 700 µl NaH2PO4(0.2M)
300 µl (20 mM) Na2HPO4 (0.2M)
200 µl (10 mM) EDTA pH 8.0 (0.5 M)
100 µl (1%) β-Mercaptoethanol
1 ml (1%) SDS (10%)
ad 10 ml mit aqua bidest (ergibt pH 7.0)
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