Klonierung und Charakterisierung von reifungsassoziierten ...

Material und Methoden
Streptavidin-Peroxidase-Lösung: 25 µl (1:2000) Streptavidin-biotinylated horseradish
peroxidase complex (Amersham)
ad 50 ml mit Blocking-Lösung
Detection-Reagent 1 + 2 (Amersham)
Diese Färbung wurde in erster Linie zur Detektion von biotinmarkierten
Oberflächenantigenen auf Westernblots verwendet.
Die Membran wurde nach dem Blotten über Nacht bei 4°C in Blocking-Lösung
inkubiert. Nach dreimaligem Waschen mit Wasch-Lösung (je 10´ bei RT) wurde die
Membran mit der Streptavidin-Peroxidase-Lösung für 1 h geschwenkt und
anschließend nochmal gewaschen (dreimal je 10´ bei RT). Die Färbung erfolgte mit
dem ECL-Detektions-Kit der Firma Amersham nach dem Protokoll des Herstellers
und die Detektion wurde mit Autoradiographiefilmen durchgeführt.
3.4.8.4 Mikrosequenzanalyse
Über den monoklonalen Antikörper MAX.11 affinitätschromatographisch gereinigtes
Protein wurde durch N-Glykosidase F (NGF) deglykosyliert und anschließend
Chloroform-extrahiert. Über Affinitätschromatographie gereinigtes MAX.3-Antigen
wurde ohne Deglycosylierung Chloroform-extrahiert. In beiden Fällen wurden die
gefällten Proteine in reduzierendem Probenpuffer gelöst, der zusätzlich zu den in
Kapitel 3.4.5 aufgeführten Substanzen β-Mercaptoessigsäure (5%) enthielt. Die
reduzierten Proben wurden durch SDS-PAGE aufgetrennt, auf PVDF-Membran
geblottet und mit Coomassie Blue gefärbt. Spezifische Banden wurden
ausgeschnitten und die NH2-terminale Sequenz von R. Deutzmann (Lehrstuhl für
Biochemie I, Universität Regensburg) auf einem Protein-Sequenziergerät (Applied
Biosystems Modell 477A) mit angeschlossenem PTH-Analyser (Modell 120A)
bestimmt.
3.4.9 Enzymassay für Carboxypeptidase M
benötigte Reagenzien:
HEPES-Puffer: 4.76 g (0.2 M) HEPES/NaOH pH 7.5
2 ml (0.2%) NP-40 (10 %)
ad 100 ml mit aqua bidest
Stoplösung: 21.0 g (1 M) Zitronensäure x H2O/NaOH pH 3.2
ad 100 ml mit aqua bidest
Substrat: 4.64 mg (1 mM) Dansyl-Ala-Arg
ad 10 ml mit aqua bidest (in 1 ml Portionen bei -20°C)
Inhibitor: 0.237 mg (100 µM) MGTA
ad 10 ml mit entgastem Wasser
Standards: 0, 0.5, 1, 2, 5, 10 und 20 nmol Dansyl-Ala pro 50 µl
8.4 mg (100 nmol / 50 µl) als Stammlsg.
(in 1 ml Portionen bei -20°C lagern)
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