Aus der Klinik für Plastische Chirurgie der Universität zu Lübeck ...

Aus der Klinik für Plastische Chirurgie
der Universität zu Lübeck
Direktor: Prof. Dr. Mailänder
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Angiogenetische Effekte von VEGF 165 nach adenoviralem Gentransfer im
ischämischen Lappenmodell der Ratte
Inauguraldissertation
zur
Erlangung der Doktorwürde
der Universität zu Lübeck
- Aus der Medizinischen Fakultät -
vorgelegt von
Alexandra Di Mauro, geb. Maichle
aus Hechingen
Lübeck 2008
1

1. Berichterstatter: Prof. Dr. med. Hans-Günther Machens
2. Berichterstatter: Priv.-Doz. Dr. med. Björn Mayer
Tag der mündlichen Prüfung: 06.05.2009
Zum Druck genehmigt. Lübeck, den 06.05.2009
gez. Prof. Dr. med. Werner Solbach
-Dekan der medizinischen Fakultät-
2

Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung
1.1 morphologische und molekulare Grundlagen der Angiogenese
1.2 Strategien zur therapeutischen Angiogeneseinduktion
2. Fragestellung und Zielsetzung der Arbeit
3. Material und Methoden
3.1 Material
3.1.1 Vektoren
3.1.3 Tiere
3.1.4 ELISA
3.1.5 Mikroangiographie
3.1.6 real time PCR
3.1.7 FACS-Analyse
3.2 Methoden
3.2.1 Implantation von Silastik und Gewinnung der Fibroblasten
3.2.2 Kryoasservation
3.2.3 Kultivierung der Zellen
3.2.4 adenovirale Transfektion
3.2.5 Versuchstier und operatives Vorgehen
3.2.5.1 Gruppeneinteilungen und Behandlung des Gewebes in Setting II und III
3.2.5.2 operatives Vorgehen und Behandlung in Setting I
3.2.6 LacZ-Färbung
3.2.7 Auswertung in vitro
3.2.7.1 ELISA
3.2.7.2 Transduktionsraten
3.2.8.1 Auswertung in vivo
3.2.8.2 Mikroangiographie
3.3 Statistik
4. Ergebnisse
4.1 X-gal Färbung
4. 2 Transfektionsrate
4.3 Produktion von VEGF165
4.3.1 Proteinexpression in vitro
4.4 Effekte der modifizierten Fibroblasten
4.4.1 Nachweis von VEGF165 mittels rtPCR
4.4.2 Immunhistochemischer Nachweis von VEGF165
4.4.3 Immunhistochemischer Nachweis von Kapillaren
4.4.4 Mikroangiographie
4.5 Effekte der modifizierten Fibroblasten in einem etablierten Lappenmodell der Ratte
4.5.1 Planimetrie
4.5.2 Mikroangiographie
3

4.5.3 Immunhistochemie
5. Diskussion
5.1 Therapiestrategien zur therapeutischen Angiogeneseinduktion
5.2 Angiogeneseinduktion in unserem Modell
5.3 Ausblick
6. Zusammenfassung
7. Literatur
8. Anhang
9. Danksagung
10. Lebenslauf
Liste der Abkürzungen:
ELISA= Enzyme-linked Immunosorbent Assay
rtPCR= real time Polymerase Chain Reaction
FACS= Fluorescent Activated Cell Sorter
LacZ= Gen fÄr die β-Galactosidase
x-gal= 5-Brom-4-chlor-3-indoxyl-β-D-galactopyranosid: Substrat der β-Galaktosidase
GFP= Green Fluorescent Protein
VEGF= Vascular Endothelial Growth Factor
bFGF= basic Fibroblast Growth Factor
PDGF= Platelet Derived Growth Factor
NMFB= Non Modified Fibroblasts
DMEM= Dulbeccos Mod Eagle Medium
FBS= Fetal Bovine Serum
PBS= Phosphate Buffered Saline
DMSO= Dimethyl- Sulfoxid
LZ= Langzeit
mRNA= messenger Ribonucleic Acid
MOI= Multiplicity of Infection
PFU= Plaque Forming Unit
cDNA= complementary Deoxyribonucleic Acid
POT= postoperativer Tag
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1. Einleitung
Die Plastische Chirurgie beschÅftigt sich hauptsÅchlich mit dem mÑglichst gleichwertigen
Ersatz fehlender Teile des KÑrpers durch lebendes Gewebe (54, 76). Eine Conditio sine qua
non ist dabei die Sicherstellung einer adÅquaten ErnÅhrung im zu transplantierenden oder
transponierenden Gewebe durch Perfusion oder Diffusion (5, 55, 73). Sobald im Gewebe eine
ischÅmische Situation auftritt, wird eine Signalkaskade von molekularen Mechanismen in
Gang gesetzt, die das Ziel hat, die entstandene IschÅmie mÑglichst schnell wieder zu
beseitigen. ZusÅtzlich zu den zentral gesteuerten kardiovaskulÅren Reaktionen kommt es im
betroffenen Gewebe dabei primÅr zu einer Vasodilatation, um dem gesteigerten
Sauerstoffbedarf des Gewebes gerecht zu werden, sowie zur îffnung zusÅtzlicher
arteriovenÑser Shuntverbindungen (‚choke vessels’). Reichen diese Gegenregulierungs-
maÖnahmen im Gewebe nicht aus und ist die ischÅmische SchÅdigung nicht zu ausgeprÅgt, so
werden energieabhÅngige gewebestrukturelle VerÅnderungen in Gang gesetzt, die einem
chronisch gesteigerten Sauerstoffbedarf gerechter werden kÑnnen: es kommt zur Ausbildung
neuer BlutgefÅÖe (83, 84).
1.1 Morphologische und molekulare Grundlagen
Ein Grundprinzip allen Lebens ist die Aufrechterhaltung eines intra- und extrazellulÅren
Steady-State-Zustandes sowie eines physiologischen FlieÖgleichgewichtes. Jegliche
Unterbrechung und StÑrung in der Erhaltung dieses Gleichgewichtes gefÅhrdet und zerstÑrt
schlieÖlich das Leben des davon abhÅngigen Zell- und Gewebeverbundes. In allen hÑher
entwickelten Organismen spielt der BlutfluÖ eine zentrale Rolle zur Sicherung der
Zellfunktion (10). Die Versorgung mit Sauerstoff und energiereichen Substraten sowie der
Abtransport von Metaboliten muÖ den sich stÅndig verÅndernden Bedingungen angepaÖt
werden. Physiologische VerÅnderungen der Gewebedurchblutung, gleich, ob es sich um eine
ErhÑhung oder Verminderung handelt, mÄssen den verÅnderten energetischen Anforderungen
der Zelle Åquivalent sein und dÄrfen auf keinen Fall unterbrochen werden. Geschieht dies
dennoch, fÄhrt eine solche VerÅnderung Äber kurz oder lang zum Zelluntergang. Eine
MÑglichkeit des Organismus, dem erhÑhten Energiebedarf der Zellen gerecht zu werden,
besteht neben der îffnung zuvor noch von der Durchblutung ausgeschalteter GefÅÖe in der
5

Ausbildung neuer mikrozirkulatorischer Bahnen. Dieser letztere Prozess wird dann in Gang
gesetzt, wenn keine abrupte Unterbrechung des Steady-States erfolgt, sondern der vermehrte
Energiebedarf langsam genug einsetzt, so daÖ dem Organismus noch Zeit zur Ausbildung
neuer Kapillaren verbleibt (14, 36). Dieser Regulierungsvorgang der Neubildung von
BlutgefÅÖen erfolgt, wie jede andere Zellteilung im Organismus auch, vom ersten Moment
des embryonalen Lebens an und wird immer wieder neu in Gang gesetzt bis zum Tode des
Gesamtorganismus.
Morphologie
Angiogenese stellt einen biologischen Vorgang dar, bei dem neue Kapillaren gebildet werden
durch Aktivierung, Migration und Proliferation von Endothelzellen aus vorbestehenden
Endothel-PerizytenverbÅnden. Aussprossungen der aktivierten Endothelzellen dringen dabei
in das Bindegewebsstroma ein durch eine partielle Desintegration der Basalmembran im
MuttergefÅÖ als ersten Schritt. Die Migration der Endothelzelle wird normalerweise
richtungsbestimmt durch angiogenetische Stimuli und unterstÄtzt durch eine Proliferation der
benachbarten Endothelzellen. In diesem Zusammenhang spricht man von der Entwicklung
sogenannter ‚buds’ und ‚sprouts’. Nach Ausbildung eines Lumens und Fusion zweier
benachbarter aussprossender Endothelzellen beginnt der BlutfluÖ durch die neu gebildete
Kapillare. Die folgende Abbildung 1 a fasst diesen komplizierten Vorgang anschaulich
zusammen. In vivo lassen sich solche Prozesse nur in Momentaufnahmen abbilden
(Abbildung 1 b).
6

Abbildung 1a und 1b
Abbildung 1a: Schematische Darstellung der wesentlichen Schritte in der Entwicklung
kapillÅrer Aussprossungen, wie sie von Rhodin und Fujita (67) beschrieben wurden.
Dargestellt sind sich in Sprossen entwickelnde Kapillaren des Rattenmesenteriums nach
Analyse von Intravitalvideoaufnahmen und elektronenmikroskopischen Bildern. In der
arteriovenÑsen Kapillarschlinge durchdringen kleine endotheliale FortsÅtze [1] als erstes die
Basalmembran (gepunktet), entwickeln darin zellulÅre Protrusionen [2] und entwickeln sich
weiter in endotheliale AuslÅufer mit kleinen Verzweigungen [3]. Im weiteren Verlauf
wachsen diese AuslÅufer in die LÅnge [4]. Fibroblasten setzen sich auf diesen AuslÅufern fest
und transformieren zu Perizyten. Eine Extravasion von Plasma und Blutbestandteilen in den
interstitiellen Raum wird verhindert durch Perizyten, die zeitweise wie ein Schirm (‘umbrella’
- Zelle) solche Leckagen abdichten. Abbildung 1b: Wand eines kleines BlutgefÅÖes in der
frÄhen Angiogenesephase . Die Pfeile zeigen auf die Stelle, an der die Endothelzelle mit
kurzen FortsÅtzen nach auÖen vortritt, um dort von einer perivaskulÅren Zelle (Perizyt) wie
von einem Schirm (‚umbrella’) umfasst zu werden (aus Machens HG: Habilitationsschrift
1996).
7

Einen weiteren Angiogenesemechanismus, aus bereits vorbestehenden BlutgefÅÖen neue
bilden zu kÑnnen, stellt die LÅngsteilung bestehender EndothelschlÅuche (‚Intussusception’)
und das axiale endotheliale LÅngenwachstum (‚Pruning’) dar (37).Von Vaskulogenese spricht
man in diesem Zusammenhang, wenn die GefÅÖbildung durch endotheliale VorlÅuferzellen,
andere Stammzellen oder im prÅnatalen Entwicklungsstadium geschieht. Der Begriff
Angiogenese hingegen bezieht sich auf die Entstehung von BlutgefÅÖen aus echten, bereits
vorbestehenden Endothelzellen. Die auf diese Weise neu geformten BlutgefÅÖe kÑnnen
entweder fortbestehen als reife Kapillaren oder sich weiterentwickeln zu grÑÖeren venÑsen
oder arteriellen GefÅÖen, wobei besonders komplexe Mechanismen im Bindegewebe eine
Rolle spielen unter Einbeziehung von Perizyten und glatten GefÅÖmuskelzellen. Die
Weiterentwicklung solcher, in ihrem Aufbau durch kontraktile Elemente verstÅrkten GefÅÖe
wird Arteriogenese genannt (8).
GrundsÅtzlich mÄssen diese VorgÅnge unterschieden werden von dem WiederanschluÖ
vaskulÅrer Strukturen an bereits vorbestehende BlutgefÅÖe. Dieser Vorgang spielt im Rahmen
von HeilungsvorgÅngen ebenfalls eine sehr wichtige Rolle, aber entspricht keiner echten
Angiogenese im Sinne einer Neubildung von BlutgefÅÖen (9).
Molekularbiologie
Die molekularen Grundlagen der Angiogenese sind ÅuÖerst komplex und weiterhin
Gegenstand intensiver Forschungsarbeiten. Wenigstens drei verschiedene
Regulationsmechanismen spielen dabei eine Rolle: 1. Proteine, die autokrin oder von
benachbarten Zellen in parakriner Form sezerniert oder aus der ExtrazellulÅren Matrix und
lysierten Zellen freigesetzt werden (87); 2. Direkte Zell-Zell Interaktionen oder solche
zwischen Zellen und ExtrazellulÅrer Matrix auf der Ebene der ZelloberflÅchen,
AdhÅsionsmolekÄlen, Zytoskelettproteinen und Integrinen und 3. Proteolytische Enzyme,
welche entweder eine Modifikation dieser regulatorischen Substanzen,
ZelloberflÅchenmolekÄle und der ExtrazellulÅren Matrix bewirken oder direkt mit der
endothelialen Funktion interferieren.
Proteine spielen bei der Angiogeneseinduktion eine SchlÄsselrolle. Diese Substanzen sind
sehr verschieden in ihrem Ursprung, Molekulargewicht, chemischer Zusammensetzung und
biologischer Wirksamkeit. Die meisten Faktoren mit hÑherem Molekulargewicht gehÑren
dabei in eine der drei folgenden Substanzklassen, welche die Angiogenese in vivo regulieren:
8

1. Wachstumsfaktoren und Zytokine (42, 60); 2. Bestandteile der Zelloberflächen und der
Extrazellulären Matrix und 3. Proteasen. Um therapeutisch und klinisch für angiogenetische
Zwecke Anwendung finden zu können, sollten diese Substanzen dabei folgende
Eigenschaften besitzen: 1. Fähigkeit zur Induktion und Stimulation einer kontrollierten
Angiogenese in adultem Gewebe; 2. klar begrenzte Zelleffekte durch die Angiogenese mit
vernachlässigbaren lokalen und systemischen Nebenwirkungen; 3. effektive Dosen bereits im
Nano - und Picomolarbereich mit Dosis-Wirkungsrelation; 4. chemisch definierte Substanzen,
die problemlos zu handhaben sind und 5. breites klinisches Anwendungsfeld. Diese Kriterien
werden von der Gruppe der Wachstumsfaktoren und Zytokinen erfüllt, welche sich zudem
durch die Techniken der Biotechnologie und Molekularbiologie rekombinant in vitro
herstellen und von extern appliziert lassen (Protein-basierte Therapie). Ein weiterer Vorteil
dieser Substanzen liegt darin, daß sie parakrin von genetisch modifizierten Zellen sezerniert
werden können. In den letzten 18 Jahren wurden mehr als 30 angiogenetische Faktoren
isoliert, von denen der am häufigsten verwendeten Wachstumsfaktor mit angiogenetischer
Potenz Vascular Endothelial Growth Factor/Vascular Permeability Factor (VEGF/VPF)
darstellt. VEGF, früher auch VPF genannt, ist ein homodimeres Glykoprotein (40-45 kD),
welches in hoher Affinität selektiv an die Tyrosinkinase-Rezeptoren von Endothelzellen
bindet und sowohl parakrin von Makrophagen, Fibroblasten, glatten Muskelzellen und
anderen Zellen als auch autokrin von Endothelzellen selbst synthetisiert wird. Inzwischen sind
5 verschiedene Subtypen (121, 145, 165, 189 und 206) bekannt, die sich durch
unterschiedliche Eigenschaften, an Heparin zu binden, unterscheiden (88) und von denen die
bekannteste und am häufigsten therapeutisch eingesetzte Isoform das VEGF 165 darstellt (18).
VEGF wirkt in vivo und in vitro über die endothelialen Rezeptoren (31) mitogen auf diese
Zellen und entfaltet dadurch seine direkte angiogenetische Wirkung (26). In verschiedenen
Endothelzelltypen exprimiert VEGF zudem auch noch Plasminogenaktivatoren und -
inhibitoren sowie Kollagenase, was die direkte angiogenetische und exklusiv
endothelzelltypische Wirkung (91) von VEGF weiter verständlich macht. Darüber hinaus hat
VEGF 165 auch auf andere Zellen wie Schwann-Zellen und Epithelzellen positive Effekte (48,
69, 75).
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1.2 Strategien zur therapeutischen Angiogeneseinduktion
Das klinische Wissen um die essentielle Bedeutung einer ausreichenden Gewebeperfusion fÄr
die Wundheilung hat schon frÄh innerhalb der chirurgischen Forschung zu Bestrebungen
gefÄhrt, Mittel und Wege zur Induktion einer therapeutischen Angiogenese in vivo zu finden
(53). Diese Forschung hat innerhalb der letzten Dekade zusÅtzlichen Auftrieb erhalten durch
die Entwicklungen der Regenerativen Medizin, der die Plastische Chirurgie vor allem durch
das Tissue Engineering (6, 34, 81) in besonderer Weise fachlich verbunden ist. Die
therapeutische Einflussnahme auf die Bildung neuer funktioneller BlutgefÅÖe innerhalb der
plastisch-chirurgischen Forschung wird derzeit auf vier verschiedenen Wegen umgesetzt: (I)
die ein- oder mehrfache Applikation angiogenetischer Wachstumsfaktoren in das gewÄnschte
Zielgebiet (57), (II) die Transfektion von Zellen in vitro/vivo zur Modulation ihrer
Genexpression (20, 47), (III) die Applikation von ex-vivo prÅparierten Carriern zur
gesteuerten Freisetzung von angiogenetischen Proteinen und (IV) (25, 43) die Transplantation
von angiogenetisch potenten Zellen oder adulten Stammzellen des Knochenmarkes sowie des
peripheren Blutes (12, 80) (Abbildung 2).
Endotheliale
VorlÅuferzellen/
Stammzellen (IV)
Vasculogenese Angiogenese Arteriogenese
andere
Endothelzellen
zell – basierte
Therapie (IV)
lokale
Endothelzellen
bioaktive
Carrier (III)
Abbildung 2: Techniken der Angiogeneseinduktion in vivo.
glatte GefÅÖmuskelzellen
Gentherapie (II)
rekombinante
Proteine (I)
10

2. Fragestellung und Zielsetzung der Arbeit
In dieser Arbeit soll der Frage nachgegangen werden, ob es mÑglich ist, eine therapeutische
Angiogeneseinduktion in vivo durch Zellen zu induzieren, die nach genetischer Modifikation
zu einer temporÅren Expression von VEGF 165 fÅhig sind. Bezugnehmend auf die Abbildung
2 wÄrde dies eine Kombination gentherapeutischer Techniken (II) mit einer zellbasierten
Therapie (IV) bedeuten. Ein solches Verfahren wurde von Herrn Professor Machens
entwickelt und steht erstmalig im Rahmen dieser Doktorarbeit zur VerfÄgung. Solche
modifizierten Zellen mÄssen mehrere Bedingungen erfÄllen:
1. sie mÄssen immunologisch kompatibel mit dem Zielgewebe sein
2. sie mÄssen eine zeitlich begrenzte Proteinexpression gewÅhrleisten, um das
Expressionssystem in vivo kontrollierbar zu machen
3. sie dÄrfen ihre Wirkung nur im therapeutisch zu behandelnden Geweben entfalten und
nicht in ortsfremde Gewebestrukturen einwandern (‚trafficking’)
4. sie sollten eine therapeutischen angiogenetische Wirkung entfalten kÑnnen
Um diese Anforderungen ÄberprÄfen zu kÑnnen, ist es erforderlich, die lokale in vivo
Wirkung solcher modifizierter Zellen im Langzeitversuch zu untersuchen sowie ein
geeignetes Tiermodell zu verwenden, welches die âberprÄfung eines therapeutischen
angiogenetischen Effektes ermÑglicht.
Fragestellung und Zielsetzung dieser tierexperimentellen Arbeit sind daher aufgeteilt in
folgende Punkte:
1. Ist es mÑglich, kÑrpereigene Zellen zu entnehmen, ex vivo zu kultivieren und einem
isogenen Wirtsorganismus immunologisch kompatibel wieder zuzufÄhren?
2. Kann in vitro eine genetische Modifikation der Zellen vorgenommen und somit die
Produktion eines therapeutisch wirksamen Proteins (VEGF 165 ) angeregt werden?
3. Welche lokalen Gewebereaktionen werden durch die in vivo Implantation solcher
genetisch modifizierter Zellen ausgelÑst?
4. Gelingt es durch VEGF 165 , das transient im KÑrper durch diese Zellen produziert wird,
die Nekrosewahrscheinlichkeit eines definierten ischÅmischen Gewebeareals durch
therapeutische Angiogeneseinduktion herabzusetzen?
11

3. Material und Methoden
Zur Beantwortung der genannten Fragestellungen wird der Versuchsablauf wie folgt geplant:
1. Die zu modifizierenden Zellen sollen in vivo möglichst keine Immunreaktion
hervorrufen. Aus diesem Grund werden ausschließlich isogene Fibroblasten
verwendet. Diese sollen zunächst in vivo gezüchtet werden.
2. Die gewonnenen Fibroblasten sollen genetisch modifiziert werden, um VEGF 165 zu
produzieren. Dazu erfolgt ihre Kultivierung und Transduktion in vitro.
3. Modifizierte Fibroblasten werden in isogenes Rattengewebe appliziert, um lokale
Langzeiteffekte untersuchen zu können.
4. Zum Nachweis eines klinischen Effektes wird eine Ischämie im Tiermodell generiert
und die modifizierten Fibroblasten werden appliziert. Dazu werden verschiedene
Gruppen gebildet.
Zielort der Untersuchungen ist chirurgisch induziertes ischämisches Gewebe, das ohne
therapeutische Intervention mindestens zu 50 % nekrotisieren würde. Um
standardisierte statistische Aussagen machen zu können, wird in allen Versuchstieren
der gleiche Gewebedefekt provoziert. Verwendet wird hierzu der von McFarlane 1965
beschriebene myofasziokutane Hautlappen mit einer definierten Größe von 8 x 2 cm.
(59). Anhand dieses Vorgehens wird ein Areal generiert, das zuverlässige
Abgrenzungen vitaler und avitaler Gewebeanteile erlaubt.
5. Die eingetretenen Effekte werden dokumentiert und klinisch, histologisch,
immunhistochemisch, proteoanalytisch sowie mikroangiographisch ausgewertet.
3.1 Materialien
3.1.1 Vektoren
Der verwendete und im Labor von Herrn Dr. Lindenmaier (GBF Braunschweig) hergestellte
Vektor ist bicistrionisch (Abbildung 3, s. Anhang), d.h. er codiert für VEGF 165 und GFP
(green fluorescent protein), welches zur FACS-Analyse (FACS= fluorescent activated cell
sorter) benötigt wird. Zusätzlich wird ein so genannter Leervektor benutzt, der nur für GFP
codiert (Abbildung 4, s. Anhang). Ein weiterer, von T. Wickham (Fa. Genentech/USA)
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entwickelter Vektor wurde verwendet, um das lac-Z Gen als zusÅtzlichen Zellmarker mit
maximaler Effizienz in den Zielzellen zu exprimieren (86).
3.1.2 Zellkultur
DMEM: Dulbeccos mod eagle medium with 0,11 /GL Na PYR, with Pyridoxine (Fa. Gibco)-
FBS (fetal bovine serum) (Fa. HtClone/USA)
Penicillin/ Streptomycin 100 IU-100 μl/ml (Fa. BÑhringer)
Fungizone (Amphotericin B, 250 UG/ml) (Fa. Gibco)
L- AscorbinsÅure (Fa. Sigma)
AscorbinsÅurelÑsung: AscorbinsÅure+ aqua dest. 1:10, filtersterilisiert
Vollmedium: DMEM+ 5% FBS+ 1% Pen./ Strep.+ 1% AscorbinsÅurelÑsung+ 0,2%
Fungizone
PBS (Phosphatgepufferte KochsalzlÑsung) (Fa. Gibco)
DMSO (Dimethyl- Sulfoxid) (Fa. Sigma-Aldrich/ England)
Trypsin 1-300 (Fa. ICN Biochemicals)
TrypsinlÑsung: Trypsin+ PBS 1:10, filtersterilisiert
Zellkulturflaschen 150 cmã (Fa. TPP, Trasadingen/ Schweiz)
Qualifreeze Cryo- EinfriergerÅt mit einer AbkÄhlrate von 1äC/ min (Fa. Qualilab/ Bender&
Hobein)
Sterile Pipetten 2, 5, 10, 25 ml
Eppendorf- Pipetten 10, 100, 1000 μl
Falcons 15, 50 ml
Gefriercups 1,5 ml
Filter, Kompressen, Skalpell
3.1.3 Tiere
isogene weibliche Ratten (Sprague-Dawley Stamm, 220 g) der Firma Charles River,
Sandhofer Weg 7, 97633 Sulzfeld
alle Tierversuche erfolgen streng nach den hierfÄr vorgesehenen Protokollarien des
UniversitÅtsklinikum Schleswig – Holstein
die Tierversuche wurden genehmigt vom Ministerium fÄr Umwelt, Natur und Forsten des
Landes Schleswig-Holstein (Tierversuchsnummer: 27/g/02)
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CO2- Gas
Ketamin (Ketanest 25 mg/ ml) (Fort Dodge Laboratories, Iowa/USA)
Xylazin 2% (Rompun 20 mg/ ml) (Fa. Bayer Vital GmbH, Leverkusen)
Operationsinstrumentarium
Nahtmaterial (Seralon blau 50cm, 5/0, scharfe Nadel, DSS-15)
Silastikfolie ( Fa. PharmElast, SF Medical Hudson MA/USA)
Spritzen 2, 5, 10 ml
Insulinspritzen 1ml
Kanülen gelb (0,9 x 40 mm), grün (0,8 x40 mm), braun (0,45 x 12mm)
Isotone Kochsalzlösung (NaCl)
3.1.4 ELISA
Es wurden ELISAs bei einer MOI von 10, 30 und 100 durchgeführt. Medium wurde an den
Tagen 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 17, 21 und 24 entnommen und analysiert. Für alle Versuche
wurden Quantikine human VEGF 165 (Fa. R&D Systems) mit den dazugehörigen Materialien
entsprechend der Anleitung des Herstellers verwendet.
3.1.5 Mikroangiographie
Venenverweilkatheter (Insyte- W 0,9 x 25 mm) (Fa. Vialon)
Gelatine (Fa. Merck, Darmstadt)
Bariumsulfat
Grüne Tinte (Fa. Lamy)
Perfusorspritzen 50ml
Prostavasin
Materialien, die bereits unter 2.1.1- 2.1.3 aufgeführt sind
3.1.6 real time PCR
Die Bestimmung der mRNA für VEGF 165 im Zielgewebe wurde im Institut für Physiologie
durch Herrn Dr. Hellwig-Bürgel und Laborassistenten vorgenommen.
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3.1.7 FACS – Analyse
Zur Messung der Transfektionsrate von GFP-und bicistronisch GFP/VEGF 165 transfizierten
Zellen wurde in der GBF/Braunschweig eine FACS – Analyse der modifizierten Zellen
durchgefÄhrt.
3.2 Methoden
3.2.1 Implantation von Silastik und Gewinnung der Fibroblasten
Zuerst wurden 10 weibliche Sprague Darley Ratten ë 225g mit CO2 begast und anschlieÖend
eine intraperitoneale Narkose mit 0,05ml Rompun und 0,325ml Ketanest gesetzt. Nachdem
die Tiere ausreichend narkotisiert waren, wurde auf dem RÄcken kranial ein 2cm langer
Schnitt gemacht und von da aus die Subkutis von der Muskelfaszie gelÑst, um eine kleine
HÑhle zu schaffen fÄr die anschlieÖende Einlage von einem 5cm langen und 1cm breiten
StÄck Silastik. Danach wurde der Schnitt zugenÅht und die Tiere zurÄck in die KÅfige gesetzt.
Eine Woche spÅter wurden die Tiere wieder wie oben narkotisiert und anschlieÖend das
Fibroblastenkonglomerat, das sich als Folge der FremdkÑrperreaktion um das Silastik gebildet
hatte, entnommen und in ein mit 20 ml DMEM gefÄlltes 50ml Falcon gelegt. Danach wurden
die Tiere euthanasiert. Dann wurde das Konglomerat in einem Labor der gentechnischen
Sicherheitsstufe 1 unter sterilen Bedingungen von der Silastikmembran abgelÑst. Das Material
wurde ausgiebig gewaschen in insgesamt 10 x 50ml Falcons mit 20ml PBS, wobei es 10mal
60 Sekunden lang krÅftig geschÄttelt wurde. Nach dem Waschen wurde das Material in einer
Petrischale mit zwei Skalpellen klein geschnitten. Danach wurde das Material in eine sterile
25ml Monovette gegeben und 60 min bei 37äC mit 10ml einer CollagenaselÑsung (2mg
Collagenase/ ml PBS) und 5ml DMEM ohne ZusÅtze enzymatisch behandelt, um die
Fibroblasten aus dem Kollagenverband zu lÑsen. AnschlieÖend wurde der âberstand mit den
Zellen durch sterile Gaze gefiltert und mit dem Äbrigen Gewebe noch einmal gleichsinnig
verfahren. Danach wurde die so gewonnene Suspension 4 min lang bei 1200 U/ min
zentrifugiert, sodass sich die Fibroblasten am GefÅÖboden als Pellet abgesetzt haben. Nach
Suspension in 10 ml DMEM wurden 20 êl abpipettiert, um die Zellzahl in einer
ZellzÅhlkammer zu bestimmen. Anschliessend wurden die Fibroblasten kryoasserviert oder
weiter kultiviert.
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3.2.2 Kryoasservation
Die Zellen wurden zu je 5 Mio. / Cup verteilt und in je 1ml DMSO/FBS- Lösung (10%
DMSO, 90% FBS) gelöst. Danach wurden die Cups in ein Cryo- Einfriergerät gestellt und bei
-80 °C über 24 Stunden langsam eingefroren. Danach wurden die Cups wieder
herausgenommen und sofort in flüssigen Stickstoff gegeben, um die Zellen bei -196 °C
weiter zu asservieren.
Aus diesem Bestand konnten immer wieder Zellen entnommen werden, um sie zu kultivieren.
Für alle Versuche wurden nur Zellen aus der 4. Passage verwendet.
Dazu wurde die gebrauchte Anzahl an Cups dem Stickstoffbehälter entnommen und im
Wasserbad bei 37 °C aufgetaut. Dann wurden die Zellsuspensionen in DMEM aufgenommen
und aus den Cups abpipettiert und in je ein 15 ml Falcon gegeben, das jeweils schon mit 5 ml
Vollmedium gefüllt war, und 4 min bei 1200 U/min zentrifugiert. Anschließend wurde der
Überstand abgesaugt und das Zellpellet wieder in 5 ml Vollmedium aufgelöst, sodass das
DMSO hinterher entfernt war und die Fibroblasten zur Zellkultivierung weiter verwendet
werden konnten.
3.2.3 Kultivierung der Zellen
Vollmedium wurde bei 37 °C im Wasserbad erwärmt und anschließend je 20 ml in eine
Zellkulturflasche gefüllt. Dann wurde eine Suspension aus 5 Mio. Zellen und 5ml Medium
(siehe oben) dazugegeben und die Zellkulturflaschen wieder in den Brutschrank gestellt. Alle
drei Tage wurde Medium gewechselt, da sich die Fibroblasten ca. alle 16- 18 Stunden teilen
und deshalb entsprechend Energie brauchen. Nachdem die Zellen konfluent waren ( Abb. 5
und 6) , wurden die entsprechenden Flaschen mit 10 ml PBS gewaschen und anschließend
wurde je 4 ml Trypsinlösung für 4min zugegeben, sodass nach sanftem Schwenken und
Beklopfen sich die Zellen ablösten. Danach wurde je 5 ml DMEM dazupipettiert, um die
Trypsinaktivität zu stoppen. Dann wurde die Suspension abpipettiert und in ein 15 ml Falcon
überführt, das 4 min bei 1200 U/min zentrifugiert wurde. Hinterher wurde der Überstand
abgesaugt und das verbleibende Pellet in 9ml Vollmedium resuspendiert. Neue
Zellkulturflaschen wurden mit 22 ml Vollmedium bestückt und die Suspension wurde auf
drei Flaschen gleichmäßig verteilt. Die Zellen wurden so nochmals über 2-3 Zellpassagen
kultiviert, bis man die gewünschte Anzahl an Fibroblasten hatte.
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Abbildung 5: präkonfluente Zellen Abbildung 6: konfluente Zellen
Phasenkontrastmikroskopie: 50fache Vergrösserung
3.2.4 Adenovirale Transfektion
Wesentlicher experimenteller Bestandteil dieser Arbeit war die Transfektion der aus dem
Nativgewebe gewonnenen Fibroblasten mit einem vektortragenden Adenovirus. Nur Zellen
mit der neuen rekombinanten Kerninformation waren später dazu in der Lage, VEGF 165 in das
Gewebe freizusetzen und die gewünschten klinischen Effekte hervorzubringen. Das hier zur
Anwendung kommende Verfahren des zellbasierten Gentransfers wurde von Herrn Professor
Machens entwickelt und genießt internationalen Patentschutz (PTC/EP 03/01766).
Sämtliche Arbeiten erfolgten unter streng sterilen Kautelen in einem Labor der
Sicherheitsstufe 2 mit einem Unterdruckluftsystem zum Absaugen der Luft an jedem
Arbeitsplatz.
Nachdem die Zellen über drei Zellpassagen kultiviert waren, wurde in einer Phase, in der die
Zellen gerade konfluent waren, das Medium abpipettiert und 4ml einer Suspension aus PBS,
2% FCS und Adenovirus dazugegeben. Danach wurden die Flaschen für eine Stunde unter
Abschirmung von UV- Licht auf die Schwenkbank gestellt. Hinterher wurde je 21 ml
Vollmedium dazupipettiert und die Flaschen wurden wieder über Nacht in den Brutschrank
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gestellt. Am nächsten Tag wurde das Medium abpipettiert, die Zellen trypsinisiert und
zentrifugiert und das Pellet in 1ml Vollmedium wieder resuspendiert. Die Menge an
Adenovirus wurde anhand der Zellzahl (Bsp.: 5 Mio. in einer Zellkulturflasche, 200 000 in
einem well einer 12- well Platte), dem Virustiter (Bsp.: 5x 10 10 Pfu/ ml) und der
gewünschten MOI (multiplicity of infection; Bsp.: bei der MOI 100 braucht man für eine
Flasche 5x 10 6 x 100 = 5x 10 8 Viren, aus der Viruslösung muss also 0,1 ml entnommen
werden) ermittelt. Die Zellzahl eines gerade konfluent gewordenen Fibroblastenrasens einer
Zellkulturflasche wurde ausgezählt, um die benötigte Virenmenge zu ermitteln.
3.2.5 Versuchstiere und operatives Vorgehen
3.2.5.1 Gruppeneinteilungen
Um die Wahrscheinlichkeit einer immunologischen Reaktion auf die modifizierten
Fibroblasten in vivo möglichst gering zu halten, wurden ausschließlich isogene Ratten des
Stammes Sprague Dawley verwendet. Alle Tiere wurden unter gleichen Bedingungen in
einem Stall der biologischen Sicherheitsstufe 1 gehalten. Nahrung und Wasser waren für alle
Tiere vor und nach der Operation frei zugänglich. Nach der Operation wurden die Tiere in
Einzelkäfigen gehalten, um Kannibalismusschäden untereinander zu vermeiden.
Die Tiere wurden in verschiedene experimentelle Gruppen unterteilt. (s. Tabelle 1) Jede
Gruppe der Ischämieversuche bestand aus 30 Tieren (ausser Gruppe 0, diese bestand aus 10
Tieren). Die Einteilung der Gruppen beinhaltete eine Untergliederung in 3 Settings. Tieren in
Setting I wurden die applizierten Substanzen bzw. Zellen während der Lappenoperation
verabreicht (Zeitpunkt 0), die Auswertung der Tiere erfolgte 7 Tage später. Tieren im Setting
II und III wurden die Substanzen bzw. Zellen zum Zeitpunkt 7 Tage (Setting II) und 14 Tage
(Setting III) vor der Lappenoperation verabreicht. Die Auswertung erfolgte ebenfalls 7 Tage
nach der Lappenoperation. Aus diesen Zeitmodi wird ersichtlich, dass der längste
stattfindende Kontakt eines Tieres mit den transplantierten Zellen 21 Tage betrug (Tiere in
Setting III). Die Zellen bzw. das Medium wurden an zwei verschiedene Transplantationsorte
implantiert: 5 Mio. Zellen, aufgelöst in 1ml DMEM bzw. 1ml DMEM in 20 parallelen
Implantationsorten im Lappen =A (Gruppen VEGF 165 A, GFP A, NMFB A, DMEM A) und 2
x 5 Mio. Zellen in 2ml DMEM bzw. 2ml DMEM in 20 parallelen Implantationsstellen im
Lappen und 20 Implantationsstellen um das Zielgebiet herum =B (Gruppen VEGF 165 B, GFP
B, NMFB B, DMEM B) (Abb. 7 und 8). Zusätzlich wurde eine Gruppe in Setting I gar nicht
18

ehandelt (Gruppe 0), um eine eventuelle Beeinflussung des Ergebnisses durch das Medium
auszuschließen. Außerdem wurden Langzeitgruppen (VEGF 165 -LZ, GFP-LZ, NMFB-LZ) mit
jeweils 28 Tieren gebildet, denen je 5 Mio. Fibroblasten subkutan in das 2x 8cm große Areal
auf dem Rücken implantiert wurden. Am postoperativen Tag 1, 3, 5, 7, 9, 11, 14, 17 wurden
jeweils zwei Tiere für die Auswertung der Mikroangiographie und zwei Tiere für die
Auswertung der Immunhistochemie und der rt PCR sakrifiziert und das Zielgewebe
analysiert. Eine weitere Gruppe von 5 Tieren wurde gebildet, um lokale
Fremdkörperreaktionen an den Implantationsorten von transplantierten Fibroblasten 7 Tage
nach Zelltransplantation zu untersuchen und um die durch X-gal blau gefärbte Galaktosidase
in mit lac-Z transfizierten Zellen an anderen Gewebelokalisationen aufspüren zu können
(trafficking). Nur in dieser Gruppe wurden die zu transplantierenden Zellen mit einem
adenoviralen Vektor, der für lac-Z kodiert, transfiziert (s.u.)
Gruppeneinteilung
NaCl
(1ml)
DMEM
(1ml)
DMEM
(2ml)
NMFB
(5x10 6 Zellen)
NMFB
(2 x 5x10 6 Zellen)
GFP
(5x10 6 Zellen)
Setting I
während Lappen-OP
Gruppe 0
= 10 Tiere
Gruppe
DMEM A SI
= 10 Tiere
Gruppe
DMEM B SI
= 10 Tiere
Gruppe
NMFB A SI
= 10 Tiere
Gruppe
NMFB B SI
= 10 Tiere
Gruppe
GFP A SI
= 10 Tiere
Setting II
7 Tage vor OP
Gruppe
DMEM A SII
= 10 Tiere
Gruppe
DMEM B SII
= 8 Tiere +
Gruppe
NMFB A SII
= 10 Tiere
Gruppe
NMFB B SII
= 10 Tiere
Gruppe
GFP A SII
= 10 Tiere
Setting III
14 Tage vor OP
Gruppe
DMEM A SIII
= 8 Tiere +
Gruppe
DMEM B SIII
= 10 Tiere
Gruppe
NMFB A SIII
= 10 Tiere
Gruppe
NMFB B SIII
= 10 Tiere
Gruppe
GFP A SIII
= 10 Tiere
Langzeit
Gruppe DMEM
LZ
= 28 Tiere
Gruppe NMFB
LZ
= 28 Tiere
Gruppe GFP
LZ
= 28 Tiere
19

GFP
(2 x 5x10 6 Zellen)
VEGF 165
(5x10 6 Zellen)
VEGF 165
(2 x 5x10 6 Zellen)
lac-Z
(5x10 6 Zellen)
Gruppe
GFP B SI
= 10 Tiere
Gruppe
VEGF 165 A SI
= 10 Tiere
Gruppe
VEGF 165 B SII
= 10 Tiere
Gruppe
GFP B SII
= 10 Tiere
Gruppe
VEGF 165 A SII
= 10 Tiere
Gruppe
VEGF 165 B SII
= 9 Tiere +
Gruppe
GFP B SIII
= 10 Tiere
Gruppe
VEGF 165 A SIII
= 10 Tiere
Gruppe
VEGF 165 B SIII
= 10 Tiere
Gruppe
VEGF 165 LZ
= 26 Tiere *
---
Gruppe lac-Z
LZ
= 5 Tiere
Tabelle 1: Darstellung der Versuchstiergruppen. Die Gruppen LZ wurden als zusÅtzliche Gruppe angesehen.
Hier wurden keine Lappenoperationen vorgenommen. Diese Gruppen dienten der Untersuchung eventueller
Langzeiteffekte im Gewebe. Die Gruppe lac-Z LZ diente der Beantwortung der Frage nach dem mÑglichen
‚trafficking’ der Zellen nach genetischer Modifikation in andere Organe.
* 2 Tiere waren vor Auswertung verstorben.
+ durch Autokannibalismus nach der Lappen-OP konnten Tiere nicht ausgewertet werden.
ä ä
ä ä
ä ä
ä ä
ä ä
ä ä
ä ä
ä ä
ä ä
8cm ä ä
ä ä ä ä
ä ä
ä ä ä ä
ä ä
ä ä
ä ä
ä
ä ä
ä
ä ä
ä ä
ä ä
ä ä
ä
ä ä
ä
ä ä
ä ä ä
ä
2cm ä ä
Implantationsstellen in Gruppen A Implantationsstellen in Gruppen B
und Langzeitgruppen
Abbildung 7: Schematische Darstellung der Implantationsorte in den Gruppen A, LZ, lac-Z LZ sowie in der
Gruppe B.
20

Abbildung 8 : Darstellung der Implantationstechnik in den Tieren der Settings II und III sowie in den Tieren
der Gruppen LZ sowie lac-Z LZ.
3.2.5.2 Operatives Vorgehen und Behandlung in Setting I
Die Sprague Dawley Ratten wurden wie oben beschrieben narkotisiert und der Rücken rasiert.
Dann wurde ein 2x 8 cm großes Areal auf dem Rücken eingezeichnet (Abb. 9) und mit dem
Skalpell kranial ein kleiner Hautschnitt gesetzt. Von da aus wurde mit der Schere in einer
epifaszialen Schicht das Gewebe abpräpariert und seitlich durchtrennt, sodass daraus ein
randomisierter Lappen mit einer 2cm großen kaudalen Basis entstand (Abb. 10). Dieser
Lappen enthielt kutanes, subkutanes und myogenes Gewebe durch den Einschluß des für
Ratten typischen Panniculus Carnosus. Nach Behandlung des Gewebes (Abb. 11) wurde der
Lappen replaziert und mit einer fortlaufenden Naht mit versenkten Knoten wieder eingenäht
(Abb. 12). Eine Woche später wurden die Tiere sakrifiziert und das Zielgewebe ausgewertet.
Abbildung 9 Abbildung 10
21

Abbildung 11 Abbildung 12
3.2.6 LacZ- Färbung
Zuerst wurden die Fixationslösung und die Färbelösung hergestellt. Die Fixationslösung
bestand aus 1% Formaldehyd und 0,2% Glutaraldehyd in PBS. Bsp. 10ml Fixationslösung:
270µl Formaldehyd, 80µl Glutaraldehyd, 965µl PBS. Für 1ml Färbelösung wurden 25µl
Ferrozyanat (Fe 2+ , entspricht 5mM), 25µl Ferrizyanat (Fe 3+ , entspricht 5mM), 2µl MgCl 2
(entspricht 2mM) und 950µl PBS verwendet.
Sieben Tage nach Implantation der lac-Z modifizierten Zellen wurden die Implantationsorte
(Abb. 6) mitsamt den 8 x 2 cm umfassenden myokutanen Geweben entnommen, einmal mit
PBS gewaschen und 5 Minuten lang in die Fixationslösung gelegt, danach nochmals dreimal
mit PBS gewaschen und mit Färbelösung vollständig bedeckt. Nach zwei Stunden bei
Raumtemperatur wurde dem Gewebe die Färbelösung wieder entfernt und durch PBS ersetzt
(Abb. 13). Das Gewebe wurde dann mit Hilfe einer Lupenkamera fotografiert (Abb. 14) und
anschließend in Paraffin eingebettet, HE gefärbt und für die Histologie geschnitten.
Abbildung 13 Abbildung 1
22

3.2.7 Auswertung in vitro
Die in vitro Befundung umfasst die Auswertung einer ELISA-Antigen-Bestimmung und einer
Fluoreszenzmikroskopie. Ziel ist es, durch die in vitro-Analyse zunÅchst einen quantitativen
Nachweis einer VEGF 165 -Produktion durch ELISA bei verschiedenen MOIs zu fÄhren und die
erhaltene Transfektionsrate bei einer dann festgelegten MOI zu messen.
3.2.7.1 ELISA
Ein wichtiger Schritt vor der Arbeit im Tierexperiment war die Beantwortung der Frage nach
der Dauer und der Menge der Expression therapeutischen Proteins durch die modifizierten
Zellen. Dies gelang im in vitro ELISA. Gemessen wurde in zwei verschiedenen ELISA-
AnsÅtzen, wovon jeder jeweils 96 Wells beinhaltete, sodass die Messungen von
verschiedenen MOI zur gleichen Zeit erfolgen konnte, um dadurch einen systematischen
Fehler so klein wie mÑglich zu halten. Der experimentelle Aufbau dazu war folgender:
Eine 12-well-Platte wurde beschickt mit 2x10 5 Fibroblasten pro well. Um sicherzustellen,
dass sich nur noch vitale Zellen auf der Platte befanden, wurde diese fÄr 24 Stunden unter
oben genannten Standardbedingungen kultiviert und anschlieÖend ein Mediumwechsel
durchgefÄhrt. Dabei wurden avitale Zellen und sonstiger Zelldetritus entfernt. Da alle wells
voneinander isoliert waren, war es mÑglich, Transfektionen mit unterschiedlicher MOI auf
derselben Platte durchzufÄhren und so fÄr den Versuchsablauf die bestmÑglichen
Vergleichsbedingungen zu erreichen. Die ersten drei wells wurden nicht transfiziert, sie
dienten als Kontrollgruppe. Drei wells wurden transfiziert mit einer MOI 10, drei mit einer
MOI 30 und drei weitere mit einer MOI 100. Jedes well wurde mit 2 ml Vollmedium befÄllt
und anschlieÖend kultiviert. Jeden Tag zur selben Zeit wurde ein erneuter Mediumwechsel
durchgefÄhrt. Das dabei gewonnene Medium wurde gut resuspendiert und an den Tagen 1, 3,
5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 21, 24, 28, 35, 42, 49 und 56 in Proben zu jeweils einem Milliliter pro
Ansatz asserviert. Die Aufbewahrung der Proben erfolgte nach Schockgefrierung (-196 äC)
bei einer Temperatur von –80 äC.
Zur Auswertung der Proben wurde ein ELISA-Kit (s. Kap. 2.2) verwendet. FÄr jeden zu
untersuchenden Tag wurde von jeder MOI-Probe der asservierte Ansatz im Wasserbad schnell
aufgetaut, 100 êl des Inhaltes entnommen und der Rest in flÄssigem Stickstoff wieder
schockgefroren. Streng nach den Angaben des Herstellers wurde der VEGF 165 -Gehalt jeder
Probe nach guter Resuspendierung im ELISA gemessen.
23

3.2.7.2 Transfektionsrate
FÄr die Beurteilung der EffektivitÅt des Modifikationsverfahrens und die mÑgliche
Korrelation zwischen der Konzentration therapeutischen Proteins und der Zahl transfizierter
Zellen war es wichtig, die Transfektionsrate in der Zellkultur zu bestimmen. Teil des Genoms
der verwendeten Adenoviren war das Gen fÄr GFP. In der GBF/ Braunschweig wurde eine
Analyse der fluoreszierenden Zellen unter Leitung von Dr. Lindemann durchgefÄhrt.
3.2.8.1 Auswertung in vivo
Die in vivo-Befundung erfolgte durch computerassistierte klinisch-planimetrische Messung
der VerÅnderung von FlÅchenverhÅltnissen, Histologie entnommener Biopsate (HE und
PECAM fÄr Kapillardichte), rt-PCR zum m-RNS Nachweis von produziertem VEGF 165 und
eine mikroangiographische Darstellung des GefÅÖbettes (>20 mikrometer).
FÄr die Auswertung wurden alle Tiere mit einer âberdosis des Narkotikums euthanasiert. Der
Lappen wurde standardisiert fotografiert. Die RÅnder der Nekrosezone und des vitalen
Lappenteiles wurden nach Auflegen einer Klarsichtfolie abgezeichnet, um ihre
GrÑÖenverhÅltnisse bestimmen zu kÑnnen (Abb. 15) Im letzten Schritt wurden Gewebeproben
des Lappenareals gewonnen. Dazu musste der Lappen erneut gehoben werden. Der initiale
Schnitt wurde 0,5 cm kaudal des Stieles gefÄhrt. Er reichte bis etwa 0,5 cm auÖerhalb der
Lappengrenzen hinaus. Diese PrÅparation auÖerhalb der Lappengrenzen ermÑglichte eine
spÅtere histologische Darstellung der Regionen, die sich distal der nekrotischen Areale
befanden. Der Lappen wurde bis zu seinem apikalen Ende vom Untergrund gelÑst und in
LÅngsrichtung halbiert. Die beiden Teile wurden asserviert (eine HÅlfte in flÄssigem
Stickstoff bei –196äC, die andere in FormalinlÑsung) (Abb. 16).
Die Tiere der Langzeitgruppe wurden am jeweiligen Auswertungstag 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15,
17, 21, 24, 28, 35, 42, 49 und 56 nach Gewebebehandlung euthanasiert. Das Zielgewebe
wurde an seinen angezeichneten Grenzen gehoben (bei diesen Tieren ist keine Nekrosezone
vorhanden) und quer halbiert. Der apikale Teil wurde in sich wiederum in LÅngsrichtung
halbiert. Ein Teil wurde kryokonserviert (Schockgefrierung bei –196äC), der andere in
FormalinlÑsung asserviert fÄr eine spÅtere CD 31 FÅrbung zum Nachweis von Endothelzellen
und zur leichteren Quantifizierung von Kapillaren. Der basale Teil, an dem sich der
Lappenstiel befand, wurde nicht als Ganzes asserviert. Mit einer PrÅparierschere wurde hier
vorsichtig die unterste Gewebsschicht gelÑst. Etwa 0,5 cmè Zellmaterial sollten so gewonnen
und schockgefroren werden.
24

Abbildung 15
Abzeichnen der Nekrosezone und der Lappengrenze zur planimetrischen Ausmessung des vitalen Lappenanteils
in %
in flüssigen
Stickstoff in Formalin
(rtPCR) (Immunhistochemie)
Abbildung 16
Schematische Darstellung der Auswertung der Ischämiegruppen
25

3.2.8.2 Mikroangiographie
Zur Herstellung des Kontrastmittels, welches sowohl röntgendicht als auch niedrig viskös sein
musste, um selbst kleinste Blutgefäße zu erreichen, wurde eine Mischung aus 40g
Gelatinepulver und 200 ml Wasser (flüssige Gelatine) bei 100°C erhitzt und warm gehalten.
Dann wurde das betreffende Versuchstier anästhesiert und bei Rückenlage fixiert. Nach
Freipräparation der linken Carotis wurde diese mit einer 22er Braunüle kanüliert. Hierein
wurden 40 µg Prostavasin, aufgelöst in 0,5 ml NaCl 0,9%/ 100g Ratte injiziert und 30 sec.
abgewartet. Nach Entnahme von 1,5ml Blut/ 100g Ratte wurde eine Mischung aus flüssiger
Gelatine, Bariumsulfat und Tinte (brillantgrün) in einem Mischungsverhältnis von 1: 2: 0,05
und in einer Menge von 10ml/ 100g Ratte bei noch vitaler Herzfunktion appliziert (Abb. 17
und 18).
Abbildung 17 Abbildung 18
Eine Grünfärbung aller 4 Extremitäten sowie der Ohren und der Augen wurde als Zeichen
dafür gewertet, dass die Mischung die peripheren Gefäße erreicht hat (Abb. 19 - 22).
Abbildungen 19 – 22: (von links nach rechts)
26

Danach wurde das Tier Äber 24 Stunden bei 4äC gelagert. Am nÅchsten Tag wurde das
betreffende Versuchstier nachrasiert und das Zielgewebe entnommen (Abb. 19 und 20). In der
Radiologie erfolgte dann die rÑntgenologische Darstellung der GefÅÖe mittels der digitalen
Mammographie (24 kV bei 9mAs konventionell) (Abb. 23 und 24).
Abbildung 23 Abbildung 24
Die so gewonnenen digitalen Bilder wurden quantitativ ausgewertet durch AuszÅhlung der
GefÅÖabgÅnge/cmã.
3.2 Statistik
Alle Ergebnisse sind als Mittelwert å Standardabweichung dargestellt. Die Signifikanz des
Unterschieds der Varianzen zweier Gruppen wurde mit dem F-Test ermittelt. Paarweise
Vergleiche zwischen den Gruppen wurden mit dem Students t-Test durchgefÄhrt. Die
Varianzanalyse mehrerer Gruppen erfolgte durch den ANOVA Test. Das Signifikanzniveau
wurde auf α = 0,05 festgelegt. Eine Signifikanz lag vor, wenn p≤ 0,05.
4. Ergebnisse
4.1 X-gal- Färbung
Die GegenfÅrbung der vom lac-Z Gen exprimierten und intrazellulÅr verbleibenden Ö-
Galaktosidase durch X-gal ergab, dass die Zellen 10 Tage nach Implantation noch an
derselben Stelle zu finden waren, es hatte also keine Migration stattgefunden. Die
BlaufÅrbung bewies, dass die Zellen noch vital waren aufgrund der kurzen Halbwertszeit von
27

Ö-Galaktosidase. Histologisch konnte man keine AnhÅufung von polymorphonukleÅren Zellen
erkennen, was darauf schlieÖen lÅsst, dass keine Immunreaktion gegen die implantierten
Zellen stattgefunden hat (Abb. 25 und 26). Die Untersuchung von Leber, Lunge und Gehirn
ergab keinen Nachweis LacZ positiver Zellen.
Abbildung 25: HE-FÅrbung , Abbildung 26: HE-FÅrbung,
VergrÑsserung 100x VergrÑsserung 200x
4.2 Transfektionsrate
Andere Vorarbeiten hatten bereits ergeben, dass eine optimale Transfektionsrate bei einer
MOI von 100 zu erzielen war. Bei dieser MOI fanden sich die relativ hÑchsten
Transfektionsraten bei gleichzeitig niedrigster MortalitÅt transfizierter Zellen. Die FACS –
Analyse der nicht transfizierten und trotzdem fluoreszierenden Zellen lag bei 0,4%. Bei den
allein mit GFP transfizierten Zellen lag die Transfektionsrate bei 95,3 % und bei dem
bicistrionischen Vektor, der VEGF 165 zusammen mit GFP codiert, war die Transfektionsrate
88,0 % (Abb. 27).
28

Nicht transfizierte Zellen VEGF 165 transfizierte Zellen GFP transfizierte Zellen
Abbildung 27
Ergebnisse der FACS-Analyse
MOI 100 MOI 100
egfp egfp
egfp
4.3 Produktion von VEGF 165
4.3.1 Proteinexpression in vitro
Kontrolltransfektionen mit einer niedrigeren MOI von 10 erbrachten zwar eine wesentliche
Steigerung der Proteinexpression gegenüber nicht transfizierten Fibroblasten (Abb. 28 und
29), jedoch war die Expression insgesamt nur mit Hilfe eines hochsensitiven ELISA im
niedrigen picogramm-Bereich zu messen. Allerdings lag die Proteinexpression der nicht
transfizierten Fibroblasten schon fast unterhalb der Nachweisgrenze.
pg/ml
25
20
15
10
5
0
VEGF165 MOI10, I
1 3 5 7 9 11 13 17 21 24
VEGF165 11 18 19 6,3 6,8 12 2,2 6,3 0 1,1
Tage
VEGF165
pg/ml
8
7
6
5
4
3
2
1
0
VEGF165 MOI10, II
1 3 5 7 9 11 13 17 21 24
VEGF165 7,4 3,9 5,1 0,5 3,3 5,1 1,6 2,2 0,5 0
Tage
VEGF165
29

Abbildung 28
pg/ ml
0,15
0,1
0,05
0
VEGF1
65
Abbildung 29
nmFB
1 3 5 7 9 1 1 1 2 2
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Tage
VEGF165
Weitere Transfektionsversuche mit einer MOI von 30 zeigten, dass die Proteinexpression
deutlich gegenüber den Werten bei einer MOI von 10 zu steigern war (Abb. 30).
pg/ml
350
300
250
200
150
100
50
0
VEGF165 MOI 30, I
VEGF165 72 317 183 59 41 25 16 25 15 10
Abbildung 30
1 3 5 7 9 11 13 17 21 24
Tage
VEGF165
pg/ml
300
250
200
150
100
50
0
VEGF165 MOI30, II
1 3 5 7 9 11 13 17 21 24
VEGF165 155 251 118 59 37 24 82 30 35 12
Tage
VEGF165
Bei einer MOI von 100 zeigte sich eine weitere Steigerung der Proteinexpression (Abb. 31).
Deutlich war hier wie auch schon bei den Versuchen mit einer MOI von 30, dass ein
Expressionsmaximum am 3. Tag nach Transfektion zu erreichen war. In den folgenden 10
Tagen fiel die Proteinexpression auf einen Basislevel und war danach nur im sehr niedrigen
Bereich messbar gewesen. Andere Versuche hatten ergeben, dass eine weitere Steigerung der
MOI zu keiner wesentlichen Verbesserung der Transfektionsrate wie der Proteinexpression
führte. Deshalb wurden alle folgenden Experimente mit genetisch modifizierten Fibroblasten
bei einer MOI von 100 durchgeführt.
30

pg/ml
1000
800
600
400
200
0
VEGF165 MOI100, I
VEGF165 336 890 781 364 261 189 152 0 130 49,4
Abbildung 31
1 3 5 7 9 11 13 17 21 24
Tage
VEGF165
Proteinexpression bei einer MOI von 100: An Tag 3 konnten fast 1000 pg VEGF 165 gemessen werden.
4.4 Effekte der modifizierten Fibroblasten in vivo
4.4.1 Nachweis von VEGF 165 mittels rtPCR
Aus dem Zielgewebe wurden Gewebeproben an den Tagen 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 21, 24,
28, 35, 42, 49 und 56 nach Gewebebehandlung entnommen. Es fand sich nur während des 1.,
3. und 5. Tages eine signifikante Zunahme der mRNS im Zielgewebe (Abb. 32). Die
maximale Produktion von VEGF 165 der VEGF 156 -LZ Gruppe fand dabei am 3. Tag nach
Zellapplikation statt. Die mRNS Produktion der Kontrollgruppen (GFP und nmFB) ging im
gesamten Zeitraum nicht über den Basislevel hinaus.
%
400
300
200
100
0
Abbildung 32
VEGF
1 3
Tage post operationem
5
Ergebnisse der real time pcr: mRNS Produktion der VEGF 165 -LZ Gruppe im Vergleich zu nicht modifizierten
Zellen. Es wurden jeweils 2 Tiere ausgewertet.
31

4.4.2 Immunhistochemischer Nachweis von VEGF 165
In einem eigens entwickelten Verfahren (Dr. Söllner) gelang die spezifische Färbung von
VEGF 165 im Zielgewebe (gestrichelte Linie in Abb. 33). Dabei konnten auch Zellen
beobachtet werden, die eine besonders intensive Färbung angenommen hatten und als
modifizierte Fibroblasten mit maximaler VEGF 165 Produktion identifiziert wurden (Inset in
Abb. 33).
Abbildung 33: Färbung VEGF 165 positiver Zellen im Zielgewebe:
Vergrösserung 100x und 400x
4.4.3 Immunhistochemischer Nachweis von Kapillaren
Wir konnten eine deutliche Zunahme der Anzahl von Kapillaren pro Gesichtsfeld nur
innerhalb der ersten 7 Tage nach Zellapplikation feststellen. Eine signifikante Steigerung der
Kapillarzahl fand sich dabei interessanterweise nur am Tag 1 nach Zellapplikation (Abb. 34;
Tab. 2 s. Anhang).
32

Kapillaren /Gesichtsfeld
140
120
100
80
60
40
20
0
Immunhistochemie Langzeitgruppen
1 3 5 7 9 11 14
Tage post operationem
VEGF165
GFP
nmFB
Abbildung 34: Graphische Darstellung der Ergebnisse der Immunhistochemie der Langzeitgruppen: Die
anfangs verzeichnete höhere Kapillardichte der therapeutischen Gruppe im Vergleich zu den Kontrollgruppen
nahm im Verlauf ab. Jede Gruppe bestand aus jeweils 18 Tieren, von denen jeweils 2 Tiere an den einzelnen
Tagen post operationem ausgewertet wurden. Aus jedem Tier wurden 4 Gwebeproben entnommen.
*P < 0,05
*
4.4.4 Mikroangiographie
Mikroangiographisch fanden wir nur innerhalb der ersten 5 Tage nach Zellapplikation in der
therapeutischen Gruppe eine signifikante Zunahme der Blutgefäßanzahl pro cm² Zielgewebe.
Ab dem 7. Tag nach Zellapplikation war bereits eine Normalisierung der Gefäßanzahl
festzustellen (Abb. 35, Tab. 3 s. Anhang).
33

Blutgefäße/ cm²
50
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
LZ-Mikroangiographie
1 3 5 7 11 17
Tage post operationem
VEGF165
GFP
nmFB
Abbildung 35: Graphische Darstellung der Ergebnisse der Mikroangiographie der Langzeitversuche: Nach
einer Woche nahm die Dichte des GefÅÖnetzes in der therapeutischen Gruppe wieder ab.
Jede Gruppe bestand aus 18 Tieren, von denen jeweils 2 Tiere an den einzelnen Tagen post operationem
ausgewertet wurden.
4.5 Effekte der modifizierten Fibroblasten in einem etablierten Lappenmodell der
Ratte
4.5.1 Planimetrie
Die Ausmessung der vitalen Lappenanteile, gemessen an der GesamtlappenflÅche, ergab fÄr
fast alle Gruppen vergleichbare Werte ohne signifikante Unterschiede, verglichen mit Gruppe
0, die keinerlei Behandlung nach Lappenbildung erhalten hatte. Einzig in der Gruppe
VEGF165 B im Setting II war eine signifikante VergrÑÖerung vitaler Lappenanteile
gegenÄber den Kontrollgruppen zu beobachten (P < 0,05) (Abb. 36und Abb. 37, Tab. 4 s.
Anhang). In dieser Gruppe waren die VEGF 165 – exprimierenden Fibroblasten 7 Tage vor
Lappenhebung in das Zielgewebe, das 2 x 8 cm messende Lappengebiet, sowie in den
umgebenden Rand, welcher nach Lappenhebung den spÅteren Wundrand darstellen wÄrde,
injiziert worden.
34

vitales Lappengewebe (%)
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Ergebnisse Planimetrie
*
Setting I Setting II Setting III
VEGF165 A
VEGF165 B
GFP A
GFP B
nmFB A
nmFB B
DMEM A
DMEM B
Gruppe 0
Abbildung 37: Graphische Darstellung der Planimetrie: Nur Gruppe VEGF B des Settings II zeigt einen
signifikant höheren Anteil an vitalem Lappengewebe im Vergleich zu den Kontrollgruppen. Jede Gruppe eines
Settings bestand aus 10 Tieren. Für die Auswertung der Planimetrie standen alle Tiere zur Verfügung.
*P < 0,01
Abbildung 37: Beispiele aus den Gruppen DMEM B, NMFB B, GFP B und VEGF165 B im Setting II (von
links nach rechts)
35

4.5.2 Mikroangiographie
Mikroangiographisch konnte der Verdacht bestätigt werden, dass nur in der Gruppe
VEGF165B eine signifikante Zunahme der neu gebildeten Blutgefäße zu verzeichnen war.
Dieses Ergebnis war gegenüber allen anderen Gruppen signifikant (Abb. 38, Tab. 5 s.
Anhang).
Blutgefäße/cm²
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Mikroangiographie
*
SettingI Setting II Setting III
VEGF A
VEGF B
GFP A
GFP B
NMFB A
NMFB B
DMEM A
DMEM B
Gruppe 0
Abbildung 38: Graphische Darstellung der Mikronagiographie der Ischämiegruppen: Hier bestätigte sich
das Ergebnis der Planimetrie. Jede Gruppe eines Settings bestand aus 10 Tieren. Für die Auswertung der
Mikroangiographie standen jeweils 5 Tiere jeder Gruppe zur Verfügung.
* P < 0,01 versus Kontrollen; MW ± SD
36

4.5.3 Immunhistochemie
Wie zu erwarten, fand sich ebenfalls nur in der Gruppe VEGF165 B eine signifikante
Zunahme der Anzahl von Kapillaren pro Gesichtsfeld (Abb. 39, Tab. 6 s Anhang).
Kapillaren/ Gesichtsfeld
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Immunhistochemie Ischämiegruppen
*
Setting I Setting II Setting III
VEGF165 A
VEGF165 B
GFP A
GFP B
nmFB A
nmFB B
DMEM A
DMEM B
Gruppe 0
Abbildung 39: Graphische Darstellung der Immunhistochemie der Ischämiegruppen. Jede Gruppe eines
Settings bestand aus 10 Tieren. Für die Auswertung der Immunhistochemie standen jeweils 5 Tiere jeder Gruppe
zur Verfügung. Aus jedem Tier wurden 4 Gwebeproben entnommen.
* P < 0,01 versus Kontrollen; MW ± SD
37

5. Diskussion
Die KomplexitÅt der hier erbrachten Ergebnisse lÅsst es notwendig erscheinen, einige Aspekte
nÅher zu erlÅutern. Im Folgenden soll daher in Anlehnung an die Abb. 2 zunÅchst auf die
derzeit verwendeten Therapiestrategien zur Angiogeneseinduktion eingegangen werden. Im
AnschluÖ daran sollen die Ergebnisse hinsichtlich des verwendeten Lappenmodelles und der
hier gefundenen therapeutischen Effekte durch VEGF 165 diskutiert werden.
5.1 Therapiestrategien zur therapeutischen Angiogeneseinduktion
Protein-basierte Therapieansätze (I)
In den 1980er und 90er Jahren wurde mit den wachsenden Erkenntnissen Äber die
molekularen Mechanismen der Angiogeneseinduktion und nach der erfolgreichen
Erstanwendung von ‚Angiotropin’ zur Verbesserung der âberlebensrate ischÅmisch
gefÅhrdeter Lappengewebe (30) schnell der Ruf laut nach der klinischen Umsetzung protein-
basierter Studien. WeiterfÄhrende tierexperimentellen Studien, welche hauptsÅchlich mit
VEGF 165 und bFGF als angiogenetische Signalproteine in vivo durchgefÄhrt wurden, ergaben
jedoch durchaus widersprÄchliche Ergebnisse (24). Dies mag zum Teil an den
unterschiedlichen Tiermodellen, Applikationsmodi und Wirkstoffkombinationen in den
jeweiligen Studien gelegen haben (51) (Tab. 7, s Anhang). Unter anderem auch wegen der
relativ kurzen Halbwertzeit applizierter therapeutischer Proteine in vivo besteht inzwischen
Einigkeit darÄber, dass eine echte Angiogeneseinduktion durch die proteinbasierte Therapie
zumindest mittels VEGF 165 allein primÅr nicht stattfindet und stattdessen eine Stimulierung
vasodilatatorischer, NOS-gesteuerter Prozesse im Vordergrund steht (3, 33). Hierbei ist es
auch in AbhÅngigkeit vom verwendeten tierexperimentellen Modell von entscheidender
Bedeutung, ob das Zielgewebe Äber eine bereits ausreichende vaskulÅre KapazitÅt verfÄgt
(z.B: 3 x 9 cm dorsaler Mc Farlane flap mit sakralen StielgefÅÖen der Ratte) oder ob das
Zielgewebe primÅr hypovaskularisiert ist (z.B. 2 x 8 cm randomisierter dorsaler Mc Farlane
flap ohne sakrale StielgefÅÖe der Ratte). Bisher stellen experimentelle Studien zur protein-
basierten Therapie ischÅmischer Gewebe oder zur verbesserten Wundheilung mit mehr als 75
% Literaturanteil (PubMed) die grÑÖte Gruppe innerhalb der Techniken zur therapeutischen
Angiogeneseinduktion fÄr die Plastische Chirurgie dar. Die meisten Publikationen zu diesem
Thema aus den Jahren 2003 und 2004 hatten dabei noch die Applikation von VEGF 165
beschrieben.
38

Gentransfer (II)
Zahlreiche Technologien haben inzwischen Anwendung gefunden für den therapeutischen
Gentransfer. Hierzu gehören physikochemische Methoden des Gentransfers wie DNS-
Liposomenkomplexe und DNS-ummantelte Mikroprojektile sowie viral gesteuerte Techniken
mittels rekombinanten Retroviren und Adenoviren. Alle diese Techniken haben das gleiche
Ziel: die Einführung und Expression eines therapeutischen Genes in eine Zielzelle oder ein
Zielgewebe. Hierbei müssen grundsätzlich zwei verschiedene Verfahren unterschieden
werden, nämlich die Transfektion (transiente Veränderung des genetischen Materials in einer
Zelle) und die Transduktion (permanente Veränderung des genetischen Materials in einer
Zelle). Der Hauptunterschied liegt in der Frage, ob die genetische Modifikation der Zellen
temporär (z.B. Plasmid-DNS, adenovirale Vektoren) oder permanent (z.B. retrovirale
Vektoren) erfolgen soll. Bei ersterem werden die übertragenen Gene weder in das Genom der
Zielzellen integriert noch haben sie die erforderlichen genetischen Bausteine, die ihnen eine
Replikation zum Zeitpunkt der Zellmitose gestatten würde. Die Gene haben nur für eine
bestimmte Zeit Bestand, in der sie exprimiert werden können, was durchaus einen
signifikanten und therapeutisch relevanten Zeitraum bedeuten kann. Bei der permanenten
genetischen Modifikation wird das entsprechende Gen in das Genom der Zielzellen stabil
integriert oder das Gen enthält zusätzliche genetische Informationen, die eine Replikation der
Gene bei der Zellmitose erlauben. Solche Gene haben Fortbestand und werden bis zum
Untergang der Zielzelle exprimiert werden. Darüber hinaus werden die entsprechenden Gene
im Rahmen der Zellteilung ebenfalls repliziert und an die jeweils nächste Generation von
Tochterzellen weitergegeben. Ein wesentlicher Unterschied besteht auch hinsichtlich des
Applikationsortes: wird die genetische Veränderung der Zellen in vivo durchgeführt, so
spricht man von direktem Gentransfer. Wenn die Zellmodifikation dagegen ex vivo erfolgt, so
werden nur die relevanten Zielzellen außerhalb des Organismus selektiv modifiziert und
anschließend an ihren Zielort im Gewebe verbracht. Man spricht dann von zell-basiertem
Gentransfer (Abb. 40) (22). Für die therapeutische Angiogeneseinduktion hat sich gezeigt,
dass eine Kontrollierbarkeit der Genexpression in vivo von besonderer Bedeutung ist, um eine
überschießende Bildung neuer funktionsloser Blutgefäße zu vermeiden.
39

Abbildung 40: zell-basierte Gentherapie: Ex vivo Transfektion von Zellen, die danach in das Zielgebiet
implantiert werden
Direkter Gentransfer in vivo
Mit den zunÅchst sehr optimistischen Erwartungen in die Gentherapie Anfang der 1990er
Jahre nahm diese Technologie auch bald Einzug in die Angiogeneseforschung. ZunÅchst
waren es vor allem Studien aus dem kardiovaskulÅren Bereich, die schon bald in Phase I
Studien mÄndeten. FÄr die direkte Transfektion des ischÅmisch gefÅhrdeten Gewebes werden
zurzeit vor allem Plasmide und Adenoviren erfolgreich verwendet (21, 28). Doch obwohl die
Genexpression in vivo erfahrungsgemÅÖ nur temporÅr Äber maximal 7-14 Tage erfolgt,
wurden auch fÄr adenovirale Vektoren (78) und fÄr DNS-Plasmide (70) pathologische
GefÅÖbildungen in vivo gefunden. Eine klinische Durchsetzbarkeit solcher direkten
Transfektionsverfahren in vivo wird sich nur erreichen lassen, wenn eine MÑglichkeit besteht,
die transgene Expressionskinetik in vitro zu messen, bevor der Vektor in vivo gelangt (77).
Hinzu kommt, dass fÄr diese Therapieformen, bei denen adenovirale Vektoren die effektivere
Transfektionsrate haben, aber dabei die weitaus hÑchste antigene Belastung im
Wirtsorganismus darstellen, bisher keine LÑsung fÄr die bestehenden Probleme der
ungerichteten Transfektion aller erreichbaren Zellen im Zielgebiet, besonders bei
amphotrophen Vektoren und der daraus resultierenden Unkalkulierbarkeit von QualitÅt und
QuantitÅt der Proteinexpression, dargestellt werden kÑnnen. Damit stehen einer klinischen
Umsetzbarkeit dieser Therapieform weiterhin erhebliche Bedenken gegenÄber.
Bioaktive Carrier( III)
Zellfreie biodegradierbare TrÅger, welche als ‚slow-release-systems’ angiogenetische
Signalproteine Äber einen lÅngeren Zeitraum von 1-2 Wochen freisetzen kÑnnen, werden oft
40

als ‚Medizinprodukte’ eingestuft und haben dadurch das Interesse der Industrie auf sich
gezogen. Anders als bei (II) oder (IV) werden dabei zumeist keine autologen Zellen
verwendet, welche immer eine Individualrezeptur darstellen und eine den pharmazeutischen
Markt interessierende interindividuelle Gabe dadurch ausschlieÖen (49). Solche Carrier lassen
sich im wesentlichen in 2 Gruppen unterteilen: PolymerfestkÑrper aus Polyester oder
Polyanhydrite, bei denen inkorporierte Signalproteine weniger durch Diffusion in die
Umgebung sondern mehr durch Hydrolyse des FestkÑrpers selbst freigesetzt werden und
Hydrogele, die als dreidimensionale Polymernetzwerke H2O aufnehmen kÑnnen und eine
kontinuierliche Diffusion von inkorporierten Signalstoffen aus dem Polymerverbund erlauben
(92). GrundsÅtzlich mÄssen bei diesen Verfahren natÄrlich die carrierspezifischen lokalen
inflammatorischen und damit auch angiogenetischen Effekte nach Implantation in vivo
berÄcksichtigt werden. Innerhalb der Plastischen Chirurgie haben Rinsch et al. alternativ
genetisch modifizierte allogene Myoblasten in polymeren Strukturen mikroencapsuliert und
fÄr bFGF sogar unter IschÅmiebedingungen therapeutische angiogenetische Effekte im 3 x 8
cm McFarlane Lappen der Ratte nachweisen kÑnnen (68). UnabhÅngig davon werden auch
adulte differenzierte Zellen zur Induktion einer Angiogenese eingesetzt, weil sie selbst, wenn
auch in deutlich geringerem AusmaÖ als genetisch modifizierte Zellen, angiogenetische
Signalproteine sezernieren (16).
Stammzellen und endotheliale Vorläuferzellen (IV)
GrundsÅtzlich wird zwischen zwei Kategorien von Stammzellen unterschieden: totipotente
embryonale Stammzellen (ESZ) aus Blastozysten stammend sowie pluri- und multipotente
adulte Stammzellen (ASZ) aus differenzierten Geweben unterschiedlichen Ursprunges. Das
grÑÖte regenerative Potential besitzen die ESZ, da sie nicht nur zu Derivaten des Ekto-, Meso
– und Endoderms als Organe differenzieren, sondern einen kompletten Organismus bilden
kÑnnen. Die Therapie mit ESZ wird besonders in Deutschland weiterhin kontrovers diskutiert
und soll hier vorerst nicht dargestellt werden. Die frÄhe Begeisterung fÄr das enorme
regenerative Potential dieser Zellen in vitro wich allerdings bald der Erkenntnis, dass diese
neuen GewebeverbÄnde in vivo auch eine Vaskularisierung erfahren mÄssen, da sie ansonsten
einer progredienten IschÅmie und sukzessivem Zelluntergang anheim fallen. Interessant und
neu ist die Erkenntnis, dass auch differenzierte Zellen unter bestimmten Bedingungen ex vivo
dedifferenziert werden kÑnnen, um sich mesodermal neu zu entwickeln (65). TatsÅchlich sind
verschiedenene Typen von Stammzellen imstande, de novo BlutgefÅÖe im Organismus zu
bilden. Dieser Vorgang wurde vor der Entdeckung endothelialer VorlÅuferzellen (1) im
adulten Organismus nicht fÄr mÑglich gehalten und wird inzwischen als postnatale
41

Vaskulogenese bezeichnet. Der klinische und experimentelle Einsatz einer therapeutischen
Vaskulogenese erweitert natÄrlich die medizinischen MÑglichkeiten, welche experimentell
bislang aber vor allem im kardiovaskulÅren Bereich genutzt wurden.
Zell-basierter Gentransfer (Kombination aus II und IV)
Als Carrier der Proteinexpression dienen hier vitale Zellen, die im Tierexperiment isogen
oder auch autolog gewonnen werden kÑnnen. Diese Zellen werden ex vivo transfiziert. Damit
erhalten sie die gewÄnschte genetische Information (oder eine Kombination mehrerer Gene)
und kÑnnen auÖerdem in vitro auf ihre FunktionalitÅt getestet werden. Dadurch lÅsst sich eine
genauere Quantifizierung der zu erwartenden Proteinexpression in vivo erreichen. Die
transfizierten Zellen werden genau in das gewÄnschte Zielgebiet transplantiert, sodass ein
vektorgebundener (oft viraler) antigener Kontakt im EmpfÅngerorganismus weitgehend
entfÅllt und allenfalls noch die Strukturvektorproteine an der ZielzellenoberflÅche prÅsentiert
werden kÑnnen. In anderen Fachbereichen (z.B. Kardiologie und Kardiochirurgie) haben
zell-basierte Therapien bereits eine gewisse klinische Anwendung in Phase 1 und 2 Studien
erfahren (44). Dabei wurden dem Zielgebiet entsprechend vor allem Myoblasten und
Kardiomyozyten verwendet (4, 46). In anderen Studien wurden NIH3T3 – Zellen (29),
autologe glatte GefÅÖmuskelzellen (23) oder mikrovaskulÅre Endothelzellen (19) erfolgreich
zur Angiogeneseinduktion in vivo genutzt. Die besondere Rolle der dosierten
Proteinfreisetzung zeigten Arbeiten mit retroviral transfizierten Myoblasten, welche
kontinuierlich VEGF 164 freisetzten: 70 - 100 ng VEGF 164 /10 6 Zellen/Tag stellten demnach im
Mausmodell eine ‚Signalgrenze’ zur Induktion von HÅmangiomen dar. Hingegen wurden im
gleichen Modell bei einer kontinuierliche Freisetzung von weniger als 70 ng VEGF 164 /10 6
Zellen/Tag stabile arteriogenetische BlutgefÅÖstrukturen gebildet (63). Auch fÄr den
gesamten Bereich des Tissue Engineering und innerhalb der sich aktuell entwickelnden
Regenerativen Medizin wird dieser Therapieform zunehmende Beachtung geschenkt. So
konnten wir in dieser Arbeit zeigen, dass Zeitpunkt und Applikationsort von VEGF 165
exprimierenden isogenen Fibroblasten eine entscheidende Bedeutung fÄr das klinische
Outcome nach Induktion einer IschÅmie im randomisierten Lappengewebe der Ratte haben.
So konnten wir zeigen, dass eine temporÅre VEGF 165 – Expression im Zielgewebe nur
innerhalb einer Woche vor IschÅmiebeginn eine therapeutisch relevante Angiogenese zu
induzieren vermag. Dabei ist es entscheidend, nicht nur das ischÅmische Zielgewebe sondern
auch dessen Umgebung in die Angiogeneseinduktion mit einzubeziehen. Hingegen sind die
angiogenetischen Effekte bei einer Genexpresession 2 Wochen vor IschÅmiebeginn im
Zielgewebe und dessen Umgebung zum therapeutisch relevanten Zeitpunkt bei einer
42

Monoexpression von VEGF 165
allein nicht mehr therapeutisch effektiv. Diese
therapeutischen Erfolge sind ebenfalls nicht erzielbar, wenn die modifizierten Zellen erst
zum Zeitpunkt des IschÅmiebeginnes in vivo appliziert werden, was durch den
Wirkungsmechanismus der exprimierten Proteine verstÅndlich wird. Da nur ortsstÅndige
Endothelzellen zur Angiogenese angeregt werden, welche unter IschÅmiebedingungen
bereits eine lokale Stimulation durch freigesetzte Signalproteine erfahren, wird eine
zusÅtzliche Expression von Angiogenesefaktoren keine nennenswerten therapeutischen
Effekte generieren kÑnnen. Neue Studien haben deshalb zum Ziel, neben den Signalprotein-
exprimierenden Zellen auch endotheliale Progenitorzellen oder periphere Stammzellen zu
transplantieren, die selbst eine de novo GefÅÖbildung im Sinne einer Vasculogenese
induzieren oder eine Arteriogenese im Zielgebiet unterstÄtzen kÑnnen (32).
5.2 Angiogeneseinduktion im hier dargestellten Modell
In unserem Modell bedienten wir uns des zell-basierten Gentransfers. Der Vorteil dieses
Verfahrens liegt vor allem darin, dass es die Gentherapie, im Gegensatz zur direkten
Transfektion des Gewebes, kontrollierbar macht, da hier eine definierte Anzahl von Genen,
auf eine definierte Anzahl von Zellen gebracht wurde. Die Anzahl der dadurch transfizierten
Zellen wurde bestimmt und die daraus resultierende Proteinfreisetzung konnte noch in vitro
mittels ELISA gemessen werden. Dann wurde eine genau definierte Anzahl dieser Zellen in
ein vorher festgelegtes Gebiet implantiert. HierfÄr wurden Fibroblasten isogener Ratten
entnommen und diese adenoviral mit dem gewÄnschten Gen (VEGF 165 oder GFP) transfiziert.
Als IschÅmiemodell diente uns der McFarlane Lappen. Dieser –von McFarlane 1965 (59)
etablierte- musculokutane Lappen bezeichnet ein Gebiet von 2x8 cm GrÑÖe auf dem RÄcken
der Ratte mit einer randomisierten Blutversorgung, die von der Lappenbasis stammt. Die
Zellen wurden dabei in den Panniclus carnosus injiziert. Aufgrund der GrÑÖe und des
Aufbaus des Lappenmodells war die zu erwartende Nekrose bei unbehandeltem Gebiet immer
um 50%, wenn man davon ausgeht, dass bei randomisierten Lappen bei einem
GrÑÖenverhÅltnis von 1:2 gerade noch eine ausreichende Durchblutung gewÅhrleistet ist und
dieses Modell ein GrÑÖenverhÅltnis von 1:4 beinhaltete. Es konnte somit also nicht nur
histologisch und mikroangiographisch die Anzahl der BlutgefÅsse im behandelten Gewebe
ermittelt, sondern direkt auch die therapeutische Konsequenz im klinischen Verlauf
gemessen werden.
43

Unsere Arbeit zeigte nun, dass nur die Behandlung des Zielgebiets eine Woche vor
IschÅmiebeginn und nur unter Einbeziehung des umgebenden Gewebes eine signifikant
hÑhere âberlebensrate des IschÅmiegebietes erzielen konnte.
In Setting I unserer Versuchsreihe, als nÅmlich die Zellen bei IschÅmiebeginn implantiert
wurden, zeigte sich, dass die Gruppen mit dem therapeutischen Gen keine signifikant bessere
âberlebensrate im Vergleich zu den Kontrollgruppen vorweisen konnten. Auch in Bezug auf
die Anzahl der GefÅÖe und der Kapillardichte fand sich in den Gruppen VEGF A und VEGF
B dieses Settings keine signifikante Verbesserung zu den Kontrollgruppen, obwohl in diesen
Gruppen bei IschÅmiebeginn die hÑchste VEGF 165 -Sekretion, wie im ELISA und der rt-PCR
nachgewiesen, stattfindet. Ein therapeutischer Effekt wie in anderen Studien, bei denen eine
einmalige sytemische Gabe nach IschÅmiebeginn oder sogar die topische Gabe von VEGF
(35) oder die Transfektion des Zielgebiets mit cDNA oder Adenovirus bei IschÅmiebeginn
(62, 82, 90) zu einem signifikant besseren âberlebens des Zielgebiets gefÄhrt hatte, konnte
hier nicht gesehen werden. Es bestÅtigten sich hier unsere frÄheren Beobachtungen, dass eine
lokale Gabe rekombinanter Proteine bei IschÅmiebeginn keinen therapeutischen Effekt hat
(51). Dies lieÖe sich dadurch erklÅren, dass bei IschÅmie die Zellen eines Gewebes Äber den
HIF-1 (Hypoxie induzierter Faktor) Weg schon die maximale Konzentration an verschiedenen
Wachstumsfaktoren sezernierten, was aber bei der GrÑÖe dieses IschÅmiegebietes nicht
ausreichte. Eine Mehrdurchblutung ischÅmischen Gewebes konnte in dieser Phase nur durch
Vasodilatation erreicht werden und nicht durch Angiogenese, die mehrere Tage benÑtigt. Die
Zeit war zu knapp fÄr ein therapeutisches GefÅÖwachstum. Die in den Langzeitergebnissen
gefundene signifikant hÑhere Anzahl an BlutgefÅssen in der VEGF 165 -LZ Gruppe am Tag 1
nach Zellapplikation ist hÑchstwahrscheinlich der Vasodilatation schon bestehender GefÅÖe
zuzuschreiben. Dies ist mÑglicherweise auch ein Teil des Effekts der PrÅkonditionierung
eines zu transplantierenden Lappens durch Dehnung des Gewebes (15, 40) oder
vorhergehender kurzzeitiger IschÅmien („delay phenomen“) (36, 61). Jedoch selbst ca. 1000
pg/ml VEGF 165 / 200000 Zellen/Tag, das bekanntlich ja ein starker Vasodilatator ist, da es
nach Bindung an den VEGFR2-Rezeptor die Bildung von NO und Prostacyclin veranlasst,
reichten in diesem Modell nicht aus, um einen âberlebensvorteil des Zielgewebes der
therapeutischen IschÅmiegruppen zu bewirken. Erschwerend kam noch hinzu, dass die
transplantierten Fibroblasten distal der Lappenbasis selbst vom Sauerstoff- und
NÅhrstoffmangel betroffen waren und daher zugrunde gingen, sodass die VEGF 165
Produktion in diesem Gebiet vermutlich schnell zum Erliegen kam und somit kein Anschluss
an die GefÅÖe des Lappenrandes erfolgen konnte.
-
44

Es konnte jedoch noch ein anderer Effekt dargestellt werden: VEGF 165 fÄhrt in der Akutphase
nicht nur zu einer Vasodilatation, sondern auch bekanntermaÖen zu einer Fensterung des
Endothels. Dieses „capillary leak“, wie schon in anderen Arbeiten beschrieben (13), war in
den Mikroangiographiebildern dieses Settings sehr gut zu sehen. ( Abb. 41).
Abb. 41: Mikroangiographiebild eines Tieres der Gruppe VEGF B Setting II. Zu sehen ist der Austritt von
Kontrastmittel durch das „capillary leak“ (durch rote Pfeile markiert).
Anders sah es in Setting II aus. Hier hatte das Gewebe genug Zeit fÄr eine PrÅformierung der
GefÅÖe. Die Gruppe VEGF B dieses Settings hatte im Vergleich zu den Kontrollgruppen eine
signifikant (P< 0,01) bessere âberlebensrate des Zielgebietes. Die Ergebnisse der
Mikroangiographie und Immunhistochemie bestÅtigten dies. Auch da lieÖ sich eine signifikant
hÑhere Anzahl an kleinen GefÅÖen und Kapillaren ausmachen. Allerdings war dies fÄr die
Gruppe VEGF A aus Setting II, bei der die transfizierten Zellen nur in das Zielgebiet
transplantiert wurden, nicht der Fall. In der IschÅmiesituation zeigte sich, dass die
Blutversorgung des Zielgebietes nicht nur von der Basis abhÅngig war, sondern vor allem
auch die Bildung von Kollateralen zum umgebenden Gewebe eine entscheidende Rolle
spielte. Diese wurden zwar bei der OP durchtrennt, fanden aber zum Teil wieder Anschluss,
nachdem die WundrÅnder wieder adaptiert wurden (Abb. 42).
45

Nekrosezone
Abbildung 42: Mikroangiographiebild eines Tieres der Gruppe VEGF B Setting II. Man sieht deutlich, dass
ein Großteil der Gefäßversorgung vom Wundrand her kommt (durch rote Pfeile markiert).
In Setting III war dieser Effekt wieder verschwunden, die therapeutischen Gruppen zeigten
keinen signifikanten Unterschied zu den Kontrollgruppen in allen Untersuchungen. Dies ließe
sich dadurch erklären, dass die Gefäße, die unter dem Einfluss von VEGF 165 gebildet wurden,
nur aus Endothelzellen bestanden. Diese Gefäße besitzen weder eine Basalmembran, noch
Perizyten oder glatte Muskelzellen, was zu einer enormen Instabilität führt. Fällt der
VEGF 165 -Spiegel ab, bildet sich dieses Gefäßnetz wieder zurück. Dieser Effekt konnte in den
Langzeitversuchen bestätigt werden. Unsere Beobachtung, dass es bei der VEGF B Gruppe
des II. Settings gelang, eine therapeutisch effektive Angiogenese in Gang zu setzen, liesse
sich dadurch erklären, daß eine Woche nach Beginn der zellulären VEGF-Produktion die
Ischämie einsetzte, welche die zusätzliche zelluläre Bildung von Wachstumsfaktoren wie z.B.
bFGF (Basalmembran) und PDGF (glatte Muskelzellen) über den HIF 1-Weg ermöglichte,
was wiederume zu einer weiteren Stabilisierung der Gefäße beitragen konnte (60).
Die Langzeitversuche korrelierten mit den Ergebnissen der ELISAs und teilweise mit denen
der Ischämieversuche. In der ersten Woche post transplantationem ließen sich histologisch
und mikroangiographisch viele Gefäße nachweisen.Wie schon erwähnt, war der Effekt an Tag
1 der therapeutsichen Gruppe der Vasodilatation zuzuschreiben. Dies war jedoch in der
Ischämiesituation nicht ausreichend. Je mehr Zeit verstrichen war, desto mehr glich sich die
Gefäßanzahl der therapeutischen Gruppe die der Kontrollgruppen an. In diesem Modell war
während der beobachteten 28 Tage kein negativer Effekt unserer Gentherapie zu erkennen. Es
gab keine Immunreaktion auf eventuelle Viruspartikel und der Effekt war transient: die
Blutgefässe bildeten sich wieder zurück. Es konnte während der ganzen Zeit kein Wachstum
46

eines Hämangioms oder eines anderen Tumors gesehen werden. Mit einem erhöhten Risiko
für einen Tumor geht vor allem die Behandlung mit retroviralen Vektoren einher, da sich das
Gen des Retrovirus in das Wirtsgenom integriert und somit eine stetige Proteinproduktion
erfolgt und durch die Integration des Gens evtl. Mutationen ausgelöst werden können.
Beim Menschen lässt sich, anders als bei Nagetieren, nicht ausschließen, dass eine
Immunreaktion gegen eingeschleuste Viruspartikel auftritt. Außerdem muß noch die
theoretische Gefahr eines wild-type breakthrough (Spontanmutation in ein
replikationsfähiges Virus) erwähnt werden. Dieser Effekt wurde in unseren
Langzeitversuchen allerdings nicht gesehen. Trotzdem sollte man in Erwägung ziehen, die
Transfektion nicht-viral durchzuführen. Dazu könnte man z.B. die Elektroporation
verwenden. Allerdings ist diese Methode noch nicht ausgereift. Die Transfektionsraten sind
bis jetzt noch um Einiges geringer als bei Verwendung eines viralen Vektors.
Eine Verbesserung der Ergebnisse kann möglicherweise durch den Einsatz anderer Zellen
und/ oder durch eine Kombination verschiedener Wachstumsfaktoren erzielt werden (7, 45).
Als zu transfizierende Zellen hatten wir Fibroblasten ausgewählt, weil diese sich einfach
kultivieren und transfizieren lassen. In unserem Modell konnten wir keinen Einfluß dieser
Zellen auf das Outcome des Lappens feststellen (38, 39). In zukünftigen Experimenten
könnten solche Zellen durch Endothelzellen (41) oder endotheliale Progenitorzellen (2, 11)
oder multipotenten Stammzellen ersetzt werden. Adulte Stammzellen können z.B. aus dem
Fettgewebe gewonnen werden (93). Dies hätte theoretisch den Vorteil, dass durch die
autokrine Wirkung von VEGF 165 auf diese Zellen im Falle der endothelialen Progenitorzellen
und der Stammzellen eine Vasculogenese ausgelöst werden kann. Somit könnte
möglicherweise ein noch dichteres Gefäßnetz aufgebaut werden. Hier würde die Neubildung
von Gefäßen nicht nur allein durch die Aussprossung von schon vorhandenen Gefäßen
bewerkstelligt werden. Man wäre also nicht mehr von einem schon vorbestehenden guten
Gefäßnetz eines Gewebes abhängig. Im tierischen und menschlichen Organismus stellt sich
dieses Problem der A- oder Hypovaskularität nur bei pathologischen Zuständen wie chronisch
ischämisch geschädigten Geweben (27, 64, 71) und daraus resultierenden Problemwunden
(Beispiel: diabetisches Fußsyndrom) (66). Wenn man sich aber mit der Entwicklung
bioartifizieller Gewebe beschäftigt, ist der wichtigste limitierende Faktor bei der Herstellung
dreidimensionaler Gewebe die mangelnde Nährstoffversorgung der zentral und damit am
weitesten von der schon bestehenden Blutversorgung entfernt gelegenen Zellen bei
Implantation des Konstruktes in einen Organismus (58, 85). Um also später wirklich
47

komplexe bioartifizielle Gewebe transplantieren zu können, muss man schon in vitro für ein
ausreichendes Gefäßnetz sorgen (17, 79). Dies lässt sich nur durch Vaskulogenese erreichen.
In unserem Modell ist die Angiogenese nur transient durch die geringe Stabilität der VEGF-
induzierten Gefäße, da die gebildeten Gefäße primär nur aus Endothelzellen ohne
Basalmembran, Perizyten und glatten Muskelzellen bestehen. Man benötigt zur Stabilisierung
solcher fragiler Blutgefäße noch andere Wachstumsfaktoren, die arteriogenetisch wirksam
sind wie z.B. bFGF und PDGF und synergistisch mit VEGF 165 eingesetzt werden müssten
(74, 76). Das optimale Timing für den Wirkungsbeginn solcher Wachstumsfaktoren muss
noch erforscht werden. Die in dieser Arbeit erhobenen Daten liefern dazu für das Modell des
Mcfarlane Lappens im Tiermodell erste Hinweise. Das von VEGF 165 verursachte Kapillarleck
ist primär wichtig, um es Endothelzellen besser zu ermöglichen, in das Gewebe
einzuwandern. In diesem Stadium wäre es eher hinderlich, diese Fenster wieder mit einer
Basalmembran zu verschließen. Um verschiedene Wachstumsfaktoren zu unterschiedlichen
Zeitpunkten und synergistisch wirken zu lassen, gibt es theoretisch zwei Möglichkeiten:
entweder, man appliziert die Protein exprimierenden Zellen zu verschiedenen Zeitpunkten
oder man reguliert die Aktivität eingeschleuster Gene mit Hilfe eines vorgeschalteten
Promotors, mit dem man das Gen an- und abschalten kann. Letzteres ist z. B. bei Tetrazyklin-
abhängigen Promotoren der Fall, die das zu regulierende Gen nur in Anwesenheit von
Tetrazyklin aktivieren (58).
5.3 Ausblick
Gentherapie wird in der Zukunft eine immer wichtigere Rolle in der Behandlung
ischämischen Gewebes spielen. In der Plastischen Chirurgie ist dies vor allem bei
rekonstruktiven Eingriffen mit freien muskulocutanen Lappen von Bedeutung. Um die
Wirksamkeit einer Gentherapie allerdings reproduzierbar und damit für die spätere Therapie
wie bei einem Medikament anwendbar zu machen, hat z.B. Ylä-Hertualla (89) gefordert, zu
den ADME (= absorption, distribution, metabolism, excretion) Kriterien eines Medikaments
für gentherapeutische Produkte zusätzliche Parameter aufzustellen: STED:
Spreading throughout and reaching appropriate cells in the target tissue (eine durchgehende
Ausbreitung des Vectors und das Erreichen der geeigneten Zellen im Zielgewebe)
Transduction efficiency (Transductions-, Transfektionseffizienz)
Expression strength in the transduced cells (Stärke der Genexpression in transduzierten/
-fizierten Zellen)
48

Duration of expression ( Dauer der Genepression).
Diese Kriterien werden von unserem Modell erfüllt, da
� die transfizierten Zellen genau in das Zielgebiet gebracht werden
� der von uns benutzte Vektor eine hohe Transfektionseffizienz besitzt (nämlich 88%)
und dass die daraus resultierende Proteinproduktion sowohl in vitro als auch in vivo
transient ist
� die Proteinproduktion vor Implantation der Zellen gemessen werden kann
� eine klinisch signifikante Wirksamkeit in diesem Modell nur bei Behandlung des
Zielgebiets eine Woche vor Ischämie und nur unter Einbeziehung des umgebenden
Gewebes erzielt werden kann
� auch in den Langzeitversuchen die Gefäßbildung nur transient ist und ein negativer
Effekt nicht gesehen werden konnte
Für die Monotherapie mit VEGF 165 konnten wir das optimale Timing und das optimale Gebiet
für die Behandlung mit VEGF 165 für dieses Modell aufzeigen. Eine Verbesserung der
Durchblutungssituation konnte in diesem Modell nur bei Vorbehandlung des Zielgebiets
erreicht werden, was eine Anwendung dieses Modells nur bei elektiven Eingriffen und nicht
in akuter Ischämiesituation möglich macht. In wieweit jedoch diese Ergebnisse auf größere
Tiere und Menschen übertragbar sind, muss noch gezeigt werden.
6. Zusammenfassung
Ziel dieser tierexperimentellen methodologischen Arbeit war es, ein Verfahren zum zell-
basierten Gentransfer isogener Fibroblasten der Ratte zwecks temporärer Expression von
VEGF in einem etablierten Lappenmodell der Ratte anzuwenden. Dazu wurde ein spezieller
bicistronischer adenoviraler Vektor in der GBF Braunschweig hergestellt
(padcos45VEGFsequieG) und in einem S2 Labor der KEF/Campus Lübeck verwendet.
Isogene Sprague-Dawley Fibroblasten wurden isoliert und zunächst das
Transfektionsverfahren in vitro optimiert. Dafür wurden bei verschiedenen MOIs die
Transfektionsraten der Zielzellen und die resultierende Expression von VEGF in vitro
bestimmt. Es zeigte sich, dass bei einer MOI von 100 das optimale Expressions-,
Transfektionsverhältnis bei erhaltener Zellvitalität zu erreichen war. Das
Expressionsmaximum lag bei 3-5 Tagen nach Transfektion bei einer Gesamtexpressionsdauer
von 7 Tagen. Für die folgenden in vivo Experimente wurde daher eine MOI von 100 genutzt.
49

Um ein ‚trafficking’ transplantierter Fibroblasten in vivo besser untersuchen zu kÑnnen,
wurden Zellchargen zunÅchst mit einem hoch effektiven lac-Z Adenovirus (Labor Prof.
Wickham/Fa. Genentech/USA) zur temporÅren Expression von Ö-Galaktosidase transfiziert
und in das spÅter zu untersuchende Zielgewebe im Rattenmodell dorsal unter den Panniculus
Carnosus transplantiert. Nach 7 Tagen wurden die Tiere sakrifiziert und einer X-gal FÅrbung
im Zielgewebe unterzogen. Es fanden sich bis auf die deutlich erkennbaren Zellen keine
weiteren pathohistomorphologischen VerÅnderungen im Zielgewebe. Weitere Gewebeproben
von Leber, Lunge und Gehirn ergaben keinen Hinweis auf lac-Z positive Zellen.
Um die Langzeiteffekte nach Transplantation von padcos45VEGFsequieG transfizierten
Zellen untersuchen zu kÑnnen, wurde bei 18 Tieren das Zielgewebe zu verschiedenen
Zeitpunkten post transplantationem untersucht. Mit Hilfe der RT-PCR konnte eine
Expression von VEGF165 mRNA in vivo innerhalb der ersten 5 Tage nach Zellimplantation
nachgewiesen werden. ZusÅtzlich gelang es, mittels eines immunhistochemischen Nachweis
VEGF165 in vivo selektiv nachzuweisen.
In einem 2 x 8 cm dorsal gelegenen Mc Farlane Lappenmodell wurden alle weiteren
Tierexperimente durchgefÄhrt. Es konnte gezeigt werden, dass nur bei einer Transplantation
VEGF exprimierender Zellen sowohl in das Zielgebiet als auch in das umgebende Gewebe 7
Tage (Setting II) vor Lappenhebung eine therapeutische Angiogenese induziert werden
konnte. Die Bildung therapeutisch effektiver BlutgefÅÖe lieÖ sich dabei sowohl
immunhistochemisch als auch mittels der im Rahmen dieser Arbeit entwickelten und bereits
publizierten Mikroangiographietechnik quantifizieren. Bei Transplantation zum Zeitpunkt der
Lappenhebung (Setting I) oder 14 Tage vor Lappenhebung (Setting III) war kein
therapeutischer Effekt durch den zellbasierten Gentransfer mehr zu erreichen. Weiterhin
konnte gezeigt werden, dass bereits bestehende BlutgefÅÖe des Lappengewebes vor allem
durch GefÅÖe des Wundrandes revaskularisiert wurden. BegÄnstigt wurden diese VorgÅnge
mÑglicherweise auch durch die VEGF-induzierte Vasodilatation prÅexistierender BlutgefÅÖe.
Zusammenfassend bietet das hier dargestellte Verfahren des zellbasierten Gentransfers die
MÑglichkeit, sowohl in vitro als auch in vivo verschiedene biologische Effekte von VEGF
tierexperimentell nÅher untersuchen zu kÑnnen. Die erbrachten Ergebnisse lassen den SchluÖ
zu, dass eine pharmakologische Konditionierung von potentiell ischÅmisch gefÅhrdetem
Gewebe mit der hier dargestellten Technik mÑglich ist.
50

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8. Anhang
Abbildung 3: Darstellung des verwendeten bicistronischen Vektors zur Expression von VEGF 165 . In diesem
Vektor wird zusätzlich gfp (green fluorescent protein) als Markergen für eine FACS-Analyse exprimiert.
60

Abbildung 4: Darstellung des verwendeten monocistronischen Vektors zur Expression von gfp als
Leervektor. Dieser Vektor wurde verwendet, um die optimale MOI (multiplicity of infections) für die Zielzellen
zu bestimmen und um im Langzeitversuch zu testen, welche gewebespezifischen Veränderungen durch die
Expression des Markerproteins ausgelöst werden.
61

Tabelle 2: Ergebnisse der Immunhistochemie der Langzeit-Gruppen
POT 1 POT 3 POT 5 POT 7 POT 9 POT 11 POT 14
VEGF165 89�37,3 * 74,7�31,5 43,6�23 53,7�23,4 36,5�6,4 25,5�14,8 40�10,6
GFP 25,3�8,5 21,5�9,2 31,8�11 29,7�7,4 44,7�28,4 33,3�10,3 26,3�12
nmFB 29,5�0,7 42,5�6,9 53�12,5 27�9,8 38,3�9,3 32�12,3 41,3�1,2
Anzahl der Kapillaren/Gesichtsfeld: Mittelwerte ± Standardabweichung ; *P < 0,05. Jede Gruppe bestand aus
jeweils 18 Tieren, von denen jeweils 2 Tiere an den einzelnen Tagen post operationem ausgewertet wurden. Aus
jedem Tier wurden 4 Gwebeproben entnommen
Tabelle 3: Ergebnisse der Mikroangiographie der LZ-Gruppen
POT 1 3 5 7 11 17
VEGF165 45�3,1 * 42�3,4 35�2,5 20�3,4 15�3,6 13�4,2
GFP 15�2,6 17�2,4 14�3 15�2,6 13�2,9 12�2,5
NMFB 17�2,8 19�3 15�2,6 14�2,9 13�3,2 12�2,7
Mittelwert Blutgefäße/cm² � Standardabweichung; *P < 0,05. Jede Gruppe bestand aus jeweils 18 Tieren, von
denen jeweils 2 Tiere an den einzelnen Tagen post operationem ausgewertet wurden.
Tabelle 4: Ergebnisse der Planimetrie der Ischämiegruppen
Gruppe 0 55,1�8,9
Setting I Setting II Setting III
VEGF165 A 52,6 ± 3,9 55,8 ± 6,5 58,3 ± 6,1
VEGF165 B 49,2 ± 5,3 69,6* ± 5,0 59,7 ± 4,9
GFP A 56,2 ± 4,0 46,3 ± 3,6 45,7 ± 4,4
GFP B 51 ± 5,2 50,5 ± 3,5 44,3 ± 3,5
NMFB A 49,6 ± 8,7 43,8 ± 10,7 45,8 ± 6,6
NMFB B 42,5 ± 5,6 45,2 ± 4,3 42,3 ± 4,1
DMEM A 56,5 ± 10,5 47,4 ± 4,8 53,7 ± 5,1
DMEM B 50,5 ± 4,2 47,2 ± 3,5 46,2 ± 3,5
Quantitative Darstellung der gemessenen vitalen Lappenanteile in allen operierten Gruppen. Jede Gruppe eines
Settings bestand aus 10 Tieren. Für die Auswertung der Planimetrie standen alle Tiere zur Verfügung.
*P < 0,01 versus Kontrollgruppen, Werte als Mittelwerte ± Standartabweichung
62

Tabelle 5: Ergebnisse der Mikroangiographie der Ischämiegruppen
Gruppe 0 32 ± 3,8
Setting I Setting II Setting III
VEGF165 A 35 ± 3,4 46 ± 4,5 39,3 ± 3,2
VEGF165 B 36,3 ± 4,5 81,7* ± 2,9 42,3 ± 3,2
GFP A 33,3 ± 3,8 30,3 ± 3,7 29 ± 2,6
GFP B 33,7 ± 3,1 37,3 ± 8,5 28,3 ± 3,2
NMFB A 34 ± 2,6 33,3 ± 3,5 28,6 ± 4,6
NMFB B 28,3 ± 3,1 38 ± 3,5 38,3 ± 3,1
DMEM A 31 ± 3,6 28 ± 4,4 27,7 ± 4,2
DMEM B 30 ± 5 35,3 ± 4,2 28,7 ± 3,5
Anzahl der Blutgefäße/ cm²: Mittelwerte ± Standartabweichung; *P < 0,01. Jede Gruppe eines Settings bestand
aus 10 Tieren. Für die Auswertung der Mikroangiographie standen jeweils 5 Tiere jeder Gruppe zur Verfügung.
Tabelle 6: Ergebnisse der Immunhistochemie der Ischämiegruppen
Gruppe 0 20,8 � 6,2
Setting I Setting II Setting III
VEGF165 A 30,2 � 9,7 27,4 � 11,1 23 � 8,3
VEGF165 B 29 � 5,4 74,4* � 13,8 24,6 � 8,3
GFP A 33 � 10,1 31,8 � 15,3 37 � 11,8
GFP B 24,3�11,5 34,3�17,5 28,8 � 9,1
NMFB A 25,8 � 6,9 26 � 5,4 29,8 � 12,7
NMFB B 27 � 8,1 26,4 � 10,4 31,4 � 5,1
DMEM A 27 � 9,3 24,4 � 6,6 31,2 � 7,4
DMEM B 19,8 � 11,6 34,6 � 3,5 37,5 � 6,4
Anzahl der Kapillaren/ Gesichtsfeld: Mittelwerte ± Standardabweichung; *P < 0,01. Jede Gruppe eines Settings
bestand aus 10 Tieren. Für die Auswertung der Immunhistochemie standen jeweils 5 Tiere jeder Gruppe zur
Verfügung. Aus jedem Tier wurden 4 Gewebeproben entnommen.
63

Tabelle 7: verschiedene Studien im Vergleich
Studie Tiermodell Applikationsmodus Wirkstoff
Enhancement of epigastric skin flap survival by adenovirus-
mediated VEGF gene therapy
Lubiatowski P; Goldman CK; Gurunluoglu R; Carnevale K;
Siemionow M
Plastic and reconstructive surgery 109 (6): 1986-9 (2002)
Locally administered vascular endothelial growth factor cDNA
increases survival of ischemic experimental skin flaps
Taub PJ; Marmur JD; Zhang WX; Senderoff D; Nhat PD; Phelps R;
Urken ML; Silver L; Weinberg H
Plastic and reconstructive surgery 102 (6): 2033-9 (1998)
Local perivascular application of low amounts of a plasmid
encoding for vascular endothelial growth factor (VEGF165) is
efficient for therapeutic angiogenesis in pigs
Nikol S; Engelmann MG; Pelisek J; Fuchs A; Golda A; Shimizu M;
Mekkaoui C; Rolland PH
Acta physiologica Scandinavica 176 (2): 151-9 (2002)
The effects of VEGF on survival of a random flap in the rat:
examination of various routes of administration.
Kryger Z; Zhang F; Dogan T; Cheng C; Lineaweaver WC; Buncke
HJ
British journal of plastic surgery 53 (3): 234-9 (2000)
Intracerebral tumor-associated hemorrhage caused by
overexpression of the vascular endothelial growth factor isoforms
VEGF121 and VEGF165 but not VEGF189
Cheng SY; Nagane M; Huang HS; Cavenee WK
Proceedings of the National Academy of Sciences of the United
States of America 94 (22): 12081-7
Angiogenic effects of injected VEGF165 and sVEGFR-1 (sFLT-1)
in a rat flap model
Machens HG; Salehi J; Weich H; Münch S; Siemers F; Krapohl
BD; Herter KH; Krüger S; Reichert B; Berger A; Vogt P; Mailänder
P
The Journal of surgical research 111 (1): 136-42 (2003)
Angiogenic synergism, vascular stability and improvement of hind-
limb ischemia by a combination of PDGF-BB and FGF-2
Cao R; Bråkenhielm E; Pawliuk R; Wariaro D; Post MJ; Wahlberg
E; Leboulch P; Cao Y
Nature medicine 9 (5): 604-13 (2003)
VEGF contributes to postnatal neovascularization by mobilizing
bone marrow-derived endothelial progenitor cells
8 x 8cm Direkte Applikation von
6 x 3cm grosser
gestielter epigastr.
Lappen der Ratte
Coronar- oder
Femoralarterienversc
hluß durch Stents
2 x 8cm
randomisierter
muskulocutaner
Lappen auf dem
rücken der Ratte
Adenovirus in das
Zielgewebe
VEGF 165
cDna in die Femoralarterie VEGF 165
cDNA um die
verschlossene Arterie
Gabe von rekombinantem
Protein
1. einmal systemisch
2.mehrfach systemisch
3. subdermal
4. subfaszial
5. topisch
Maushirn Transfizierte U87MG
7x 7cm grosser
gestielter epigastr.
Lappen der Ratte
Mauscornea
Ligatur der
Femoralarterie bei
Ratte oder Kaninchen
Intraperitoneale
Injektion bei Mäusen
Zellen
Direkte Applikation von
rekombinantem Protein in
das Zielgewebe 1 Woche
vor und am Tag der OP
Protein, eingekapselt in
mikroporöse Hohlfasern
Humanes
VEGF 165
VEGF 165
VEGF 165
und sFLT-1
PDGF-BB
und FGF-2
Rekomb. Protein VEGF 165
64

Asahara T; Takahashi T; Masuda H; Kalka C; Chen D; Iwaguro H;
Inai Y; Silver M; Isner JM
The EMBO journal 18 (14): 3964-72 (1999)
Delivery of FGF-2 but not VEGF by encapsulated genetically
engineered myoblasts improves survival and vascularization in a
model of acute skin flap ischemia
Rinsch C; Quinodoz P; Pittet B; Alizadeh N; Baetens D; Montandon
D; Aebischer P; Pepper MS
Gene therapy 8 (7): 523-33 (2001)
Improved survival of ischemic cutaneous and musculocutaneous
flaps after vascular endothelial growth factor gene transfer using
adeno-associated virus vectors.
Zacchigna S; Papa G; Antonini A; Novati F; Moimas S; Carrer A;
Arsic N; Zentilin L; Visintini V; Pascone M; Giacca M
The American journal of pathology 167 (4): 981-91 (2005)
Effective treatment of vascular endothelial growth factor refractory
hindlimb ischemia by a mutant endothelial nitric oxide synthase
gene
Qian HS; Liu P; Huw LY; Orme A; Halks-Miller M; Hill SM; Jin F;
Kretschmer P; Blasko E; Cashion L; Szymanski P; Vergona R;
Harkins R; Yu J; Sessa WC; Dole WP; Rubanyi GM; Kauser K
Gene therapy 13 (18): 1342-50 (2006)
Synergistically therapeutic effects of VEGF165 and angiopoietin-1
on ischemic rat myocardium.
Liu X; Chen Y; Zhang F; Chen L; Ha T; Gao X; Li C
Scandinavian cardiovascular journal : SCJ 41 (2): 95-101 (2007)
Tetracycline-regulated expression of VEGF-A in beta cells induces
angiogenesis: improvement of engraftment following
transplantation
Mathe Z; Dupraz P; Rinsch C; Thorens B; Bosco D; Zbinden M;
Morel P; Berney T; Pepper MS
Cell transplantation 15 (7): 621-36 (2006)
Improving flap survival by transplantation of a VEGF-secreting
endothelised scaffold during distal pedicle flap creation
Lasso JM; Del Río M; García M; Martínez Calleja V; Nava P;
Muñoz-Fernández MA; Pérez Cano R (2007)
2x 8cm
randomisierter
Hautlappen auf dem
Rücken der Ratte
5 x 8 cm grosser
gestielter epigastr.
Lappen der Ratte
und
5 x 8cm grosser
musculocutaner
lappen des M. rectus
abdominis
Ligatur einer
Femoralarterie der
Ratte
Ligatur einer
Coronararterie der
Maus
In vitro transfizierte
Myoblasten werden in das
Zielgebiet während der OP
implantiert
Direkte Transfektion des
Zielgebiets 0, 7 und 14
Tage vor OP
cDNA-Transfektion des
Zielgewebes
Injektion von Adonovirus
in das Zielgebiet nach OP
Maus (linke Niere) Mittels Lentivirus
Freier Hautlappen am
Ohr des Kaninchens
transfizierte B-Zellen des
Pankreas
Transfizierte
Endothelzellen, die in einer
Fibrinmatrix eingebettet
sind, warden in das
Zielgebiet implantiert
VEGF 165
VEGF 121
FGF-2
VEGF 165
NO
VEGF 165
und
Angiopoetin-
1
VEGF-A
VEGF
65

9. Danksagung
Ich möchte mich für die gute Zusammenarbeit während meiner Arbeit bei allen bedanken,
die mich hierbei unterstützt haben. Mein Dank geht insbesondere an
� Prof. Machens, den besten Doktorvater, den man sich wünschen kann und bei dem ich
viel über Forschungsarbeit lernen durfte
� Meine Codoktoranden Timo Spanholtz und Christian Niedworok, ohne die das Ganze
wahrscheinlich nur halb so viel Spaß gemacht hätte
� Guido Middeler , Inka Jasmund, Susanne Behling und Karen Witting
(Kompetenzzentrum Tissue Engineering/ Lübeck), die mir in Rat und Tat in Sachen
Laborarbeit und Grundlagen der Zellbiologie zur Seite standen
� Werner Lindenmaierund sein Team (GBF/ Braunschweig) für die Bereitstellung des
adenoviralen Vektors, sowie die Durchführung der FACS-Analyse und des Western
Blots
� Stefan Grzybowski, Dr Xie und allen, die mich während ihrer eigenen
Forschungsarbeit unterstützt haben
� Stefan Krüger (Pathologie/ Lübeck)und MTA ´s für die Aufbereitung der
histologischen Schnitte
� Beate Stöckelhuber (Radiologie/ Lübeck) und MTA ´s für die Herstellung der
Mikroangiographiebilder
� Thomas Hellwig-Bürgel (Physiologie/ Lübeck)
� Dr. Noël und den Tierpflegern, die sich vorbildlich um unsere Tiere gekümmert haben
� Wolfgang Franz (Innere Medizin/ München), für die Bereitstellung der Räume für die
Arbeiten der Sicherheitsstufe 1 bzw. 2
� Meinen Eltern und meiner Schwester, die immer an mich geglaubt haben
� Allen, die ich nicht erwähnt habe, die mir aber trotzdem dazu beigetragen haben, dass
diese Arbeit möglich wurde.
66

10. Lebenslauf
Persönliche Daten:
Vor- und Familienname,
Geburtsname: Alexandra Di Mauro, geb. Maichle
Geburtstag: 15.11.1975
Geburtsort: Hechingen
Wohnort: 44628 Herne, Werderstr. 4A
Staatsangehörigkeit: deutsch
Familienstand: verheiratet
Schulbildung: 1982 - 1986
Grundschule in Stetten unter Holstein
1986 - 1995
Gymnasium in Gammertingen
Abschluss: Abitur
Studium: 1995 - 1999
Studium der Medizin an der Philippsuniversität in
Marburg
1998
Physikum
1999 - 2003
Studium der Medizin an der Universität Schleswig-
Holstein, Campus Lübeck in Lübeck
Abschluss: Ärztliche Prüfung:
2000
1. Abschnitt der Ärztlichen Prüfung
2002
2. Abschnitt der ärztlichen Prüfung
2003
3. Abschnitt der ärztlichen Prüfung
Praktisches Jahr: 03/2002- 02/2003
Chirurgie Tertial an der Klinik für Chirurgie an der Universität
Schleswig-Holstein, Campus Lübeck:
02/2003-03/2003
Innere Tertial an der Klinik für Innere Medizin an der
Universität Schleswig-Holstein, Campus Lübeck:
04/2003- 09/2003
Wahlfach Tertial an der Klinik für Urologie an der Universität
Schleswig-Holstein, Campus Lübeck
67

Dissertation: 2000- 2004
Bei Prof. Machens an der Klinik fÄr Chirurgie, Abteilung
Plastische Chirurgie der UniversitÅt Schleswig-Holstein,
Campus LÄbeck,
Thema: „Angiogenetische Effekte von VEGF 165 nach
adenoviralem Gentransfer im ischÅmischen Lappenmodell
der Ratte“
Facharztweiterbildung: seit 15.04.2004 in der Abteilung fÄr Chirurgie des St. Rochus-
Hospitals, GlÄckaufstr. 10, 44 575 Castrop-Rauxel; (davon
15.04.-01.10.2004 AiP)
Chefarzt: bis 30.06.2008 Prof. Dr. med. J. EitenmÄller
seit 01.07.2009 Dr. med. H. BÑhner
(Allgemein-, GefÅÖ- und Viszeralchirurgie)
Priv.- Doz. Dr. med. K. Schmidt
(OrthopÅdie und Unfallchirurgie)
68