Aus der Klinik für Plastische Chirurgie der Universität zu Lübeck ...

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CO2- Gas Ketamin (Ketanest 25 mg/ ml) (Fort Dodge Laboratories, Iowa/USA) Xylazin 2% (Rompun 20 mg/ ml) (Fa. Bayer Vital GmbH, Leverkusen) Operationsinstrumentarium Nahtmaterial (Seralon blau 50cm, 5/0, scharfe Nadel, DSS-15) Silastikfolie ( Fa. PharmElast, SF Medical Hudson MA/USA) Spritzen 2, 5, 10 ml Insulinspritzen 1ml Kanülen gelb (0,9 x 40 mm), grün (0,8 x40 mm), braun (0,45 x 12mm) Isotone Kochsalzlösung (NaCl) 3.1.4 ELISA Es wurden ELISAs bei einer MOI von 10, 30 und 100 durchgeführt. Medium wurde an den Tagen 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 17, 21 und 24 entnommen und analysiert. Für alle Versuche wurden Quantikine human VEGF 165 (Fa. R&D Systems) mit den dazugehörigen Materialien entsprechend der Anleitung des Herstellers verwendet. 3.1.5 Mikroangiographie Venenverweilkatheter (Insyte- W 0,9 x 25 mm) (Fa. Vialon) Gelatine (Fa. Merck, Darmstadt) Bariumsulfat Grüne Tinte (Fa. Lamy) Perfusorspritzen 50ml Prostavasin Materialien, die bereits unter 2.1.1- 2.1.3 aufgeführt sind 3.1.6 real time PCR Die Bestimmung der mRNA für VEGF 165 im Zielgewebe wurde im Institut für Physiologie durch Herrn Dr. Hellwig-Bürgel und Laborassistenten vorgenommen. 14
3.1.7 FACS – Analyse Zur Messung der Transfektionsrate von GFP-und bicistronisch GFP/VEGF 165 transfizierten Zellen wurde in der GBF/Braunschweig eine FACS – Analyse der modifizierten Zellen durchgefÄhrt. 3.2 Methoden 3.2.1 Implantation von Silastik und Gewinnung der Fibroblasten Zuerst wurden 10 weibliche Sprague Darley Ratten ë 225g mit CO2 begast und anschlieÖend eine intraperitoneale Narkose mit 0,05ml Rompun und 0,325ml Ketanest gesetzt. Nachdem die Tiere ausreichend narkotisiert waren, wurde auf dem RÄcken kranial ein 2cm langer Schnitt gemacht und von da aus die Subkutis von der Muskelfaszie gelÑst, um eine kleine HÑhle zu schaffen fÄr die anschlieÖende Einlage von einem 5cm langen und 1cm breiten StÄck Silastik. Danach wurde der Schnitt zugenÅht und die Tiere zurÄck in die KÅfige gesetzt. Eine Woche spÅter wurden die Tiere wieder wie oben narkotisiert und anschlieÖend das Fibroblastenkonglomerat, das sich als Folge der FremdkÑrperreaktion um das Silastik gebildet hatte, entnommen und in ein mit 20 ml DMEM gefÄlltes 50ml Falcon gelegt. Danach wurden die Tiere euthanasiert. Dann wurde das Konglomerat in einem Labor der gentechnischen Sicherheitsstufe 1 unter sterilen Bedingungen von der Silastikmembran abgelÑst. Das Material wurde ausgiebig gewaschen in insgesamt 10 x 50ml Falcons mit 20ml PBS, wobei es 10mal 60 Sekunden lang krÅftig geschÄttelt wurde. Nach dem Waschen wurde das Material in einer Petrischale mit zwei Skalpellen klein geschnitten. Danach wurde das Material in eine sterile 25ml Monovette gegeben und 60 min bei 37äC mit 10ml einer CollagenaselÑsung (2mg Collagenase/ ml PBS) und 5ml DMEM ohne ZusÅtze enzymatisch behandelt, um die Fibroblasten aus dem Kollagenverband zu lÑsen. AnschlieÖend wurde der âberstand mit den Zellen durch sterile Gaze gefiltert und mit dem Äbrigen Gewebe noch einmal gleichsinnig verfahren. Danach wurde die so gewonnene Suspension 4 min lang bei 1200 U/ min zentrifugiert, sodass sich die Fibroblasten am GefÅÖboden als Pellet abgesetzt haben. Nach Suspension in 10 ml DMEM wurden 20 êl abpipettiert, um die Zellzahl in einer ZellzÅhlkammer zu bestimmen. Anschliessend wurden die Fibroblasten kryoasserviert oder weiter kultiviert. 15
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Seite 49 und 50: Duration of expression ( Dauer der
Seite 51 und 52: 7. Literaturverzeichnis 1. Asahara
Seite 53 und 54: 23. Hattan N, Warltier D, Gu W, Kol
Seite 55 und 56: 46. Lu Y, Shansky J, Del Tatto M, F
Seite 57 und 58: 67. Rhodin JA, Fujita H: Capillary
Seite 59 und 60: 88. Ylä-Herttuala S, Alitalo K: Ge
Seite 61 und 62: Abbildung 4: Darstellung des verwen
Seite 63 und 64: Tabelle 5: Ergebnisse der Mikroangi
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Asahara T; Takahashi T; Masuda H; K
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10. Lebenslauf Persönliche Daten:
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